PROTEIN

Protein
 Protein : salah satu makronutrien yang

mengandung N, selain C,H,O, S dan kadang-kadang P,Fe dan Cu.  Protein : molekul polipeptida disusun dari >100 asam amino yang berikatan dengan ikatan peptida.  Asam amino penyusun (a.a.) ada 20 jenis. Pembeda antar protein : Urutan dan jumlah a.a.  a.a terdiri :gugus karboksil (-COOH) bersifat asam dan gugus amino (-NH2) bersifat basa yang terikat pada atom karbon yang sama

Struktur dasar asam amino (A) dan ikatan peptida yang terbentuk (B)

 Protein bersifat amfoter dapat bersifat asam atau basa tergantung pH  Muatan protein ditentukan muatan pada gugus R.  Ttik isoelektrik : kondisi dimana muatan positif dan negatif potein sama banyak.  pH > titik isoelektrik muatan + dan sebaliknya  Pada titik isoelektrik : kelarutan yang minimum

4 Golongan Asam mino berdasarkan Gugus RGugus R Non polar Polar tidak bermuatan Polar bermuatan negatif (asam) Asam amino Alanin, isoleusin, leusin, mentionin, valin, glisin Asparagin, sistein,glutamin,serin treonin, prolin Asam aspartat, asam glutamat

Polar bermuatan positif (basa)

Arginin ,lisin, histidin

 Protein biasanya terdapat sebagai

kandungan gizi dari makanan yang secara fisik maupun kimia dapat berkombinasi dengan karbohidrat atau lipid yang disebut (glikolipid), glikoprotein dan liporotein
 Protein sumber gizi utama : sumber Asam amino  Asam amino esensial : lisin, triptofan, fenilalanin, mentionin, treonin, leusin, isoleusin dan valin

Struktur primer suatu protein ditentukan oleh sekwensi asam amino yang diikat satu sama lain oleh ikatan peptida dalam suatu molekul polipeptida. Struktur sekunder ditentukan oleh ikatan hidrogen yang terjadi antara N-amida dan O-karbonil yang terdapat pada bagian-bagian yang berbeda dalam suatu molekul polipeptida, maupun yang terdapat pada molekul polipeptida yang berlainan. Struktur tersier ditimbulkan oleh cara melipat/menggulungnya struktur sekunder dari protein. Bagian tersebut menggulung/melipat karena terjadinya ikatanikatan hidrogen antara gugus R, ikatan-iktan ionik, ikatan kovalen (- S S -) dan interaksi hidrofobik. Struktur primer, sekunder dan tersier akan membentuk subunit-subunit protein. Sub-unit dapat melakukan asosiasi membentuk struktur kuartener. Pada umumnya, struktur kuartener mempunyai berat molekul yang tinggi yaitu di atas 50.000

 Fungsi Analisis Protein

1. Mengetahui aktivitas biologis misalnya enzim proteolitik berhub. Dengan pengempukan daging, pectinases dalam pematangan buah, dan trypsin inhibitors yang ada dalam leguminosa 2. Sifat fungsional protein : gliadin and glutenins dalam tepung terigu berperan dalam pembuatan roti, kue; ,casein susu yang berperan dalam koagulasi pembuatan keju dan putih telur pembentuk busa 3. Pelabelan gizi

Penetapan Sifat Fungsional Protein

 Kemampuan protein mengikat air  Pembentukan gel  Sifat sebagai emulsifier  Pembentukan buih

Analisis

Kandungan Protein

 Mengetahui kandungan total protein  Komposisi asam amino  Jumlah protein tertentu dalam campuran  Kandungan protein hasil isolasi dan purifikasi  Non protein nitrogen  Nilai gizi protein (daya cerna, efficiency

ratio, or nitrogen balance)

Prinsip dasar dari penetapan protein

 pengukuran kadar nitrogen total, ikatan peptida,asam amino aromatik  Kapasitas pengikatan zat warna (dye)  Sifat absorbsi sinar ultraviolet oleh protein  Sifat light scattering

Pertimbangan Pemilihan Metode Analisis

 Jenis contoh  Tujuan Analisis  Faktor sensitivitas  Akurasi dan ketelitian  Kecepatan  Biaya analisis

Analisa protein dapat dilakukan dengan :

1. Metoda Kjeldahl 2. Metoda Dumas 3. Metoda Aktivasi neutron/proton 4. Metoda Biuret 5. Metoda Phenol reagen 6. Metoda Spektrofotometer 7. Metoda Nephelometer atau turbidimeter 8. Metoda Dye Binding 9. Metoda Lowry, dll

Metode Kjeldahl
 Prinsip : pengukuran kadar nitrogen total yang ada

dalam contoh. Konversi ke kadar protein dengan adanya protein factor

 Keuntungan : tidak membutuhkan biaya mahal, hasil

cukup akurat dan metode resmi AOAC

 Kelemahan : nitrogen yang dianalisa berasal dari

protein dan non protein, sehingga tidak menggambarkan secara tepat akan kandungan protein = % Protein kasar

1. 2. 3. 4. 5.

Pemanas kjeldahl Labu kjeldahl Alat destilasi lengkap dengan erlenmeyer Magnetic stirer buret

Reagen
1. 2. 3. 4. 5. 6. H2SO4 pekat (36 N) Katalis campuran seleniumsulfat atau HgO, Kalium s HCl larutan asam borat 4% larutan NaOH indikator larutan methyl red- bromocresol green campurkan 1 bagian 0.2 % alkohol methyl red dengan 5 bagian 0.2 % alkohol bromocresol green

NaOH + Na2S2O3

Air

Sampel + H2SO4 Katalis

Asam Borat +Indikator

Titrasi Digestion dan Destilation

1. Metoda Kjeldahl Prinsip reaksi 1.Digestion (destruksi)

Sampel + H2SO4
Katalis
(

CO2 + H2O + SO3 + (NH4)2SO4

Sampel mengalami destruksi karena adanya panas, asam sulfat dan katalisator hingga larutan berwarna jernih Seluruh karbon dan hidrogen teroksidasi menjadi CO2 ,H2O nitrogen menjadi ammonium sulfat : (NH4)2SO4

Katalisator
Yang umum digunakan Hg O (mercuri), CuSO4, Selenium, Ti O2
Selenium mempercepat oksidasi karena meningkatkan titik didih dan mudah mengadakan perubahan dari valensi tinggi ke rendah atau sebaliknya. Kelemahan : karena oksidasi cepat maka N ikut hilang, ehingga pemakaiannya hanya 0,25 g Awalnya CuSO4 sebagai standar katalis, tetapi sekarang HgO lebih cepat dan efektif dari pada CuSO4 HgO merupakan katalis yang efektif, demikian pula selenium, tetapi Keduanya sangat toksik dan mahal. Hg O dapat bereaksi komplek dengan NH3, harus + sulit Katalis mercuri dapat dalam bentuk : metal (Hg), Hg O, HgCl, Hg I) Mercuri dapat membentuk reaksi kompleks dengan anionik akibatnya amonia sukar dibebaskan

Mercuri dapat membentuk reaksi kompleks dengan anionik akibatnya amonia sukar dibebaskan, Oleh karena itu mercuri digunakan sebagai katalis perlu ditambahkan

-K2 S atau -K2 SO4 atau -Na2SO4 atauNa2S2O3

untuk memecahkan komplek yang terjadi dan membebaskan amonia

K2 SO4, dan Na2SO4: dapat mempertinggi titik didih dengan mempercepat reaksi

2. Netralisasi dan Destilasi

Ammonium Sulfat dinetralkan dengan Alkali menjadi ammonia dan didestilasi Destilat kemudian ditampung dalam asam borat 4% (atau Asam HCl atau Asam sulfat ). Agar kontak lebih baik maka ujung tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam asam. Untuk mengetahui asam berlebih maka diberi indikator BCG + MR. Destilasi diakhiri sampai destilat tidak bereaksi basa.

(NH4)2SO4 + 2 NaOH
2NH3 + 2H3 BO3

2NH3 + 2 H2O + Na2SO4

2 NH4 H2BO3

Indikator
1. 2. 3. 4. 5. Methyl orange Congo red Bromo phenol blue Bromo cresol purple Methyl red + bromo cresol green pH akhir = 5.6

3.Titrasi
2NH4H2BO3 + 2 HCl 2NH4 Cl + 2 H3BO3

Senyawa NH4H2BO3 ditritasi dengan HCl encer, sehingga asam borat terlepas kembali dan terbentuk amonium klorida. Jumlah HCl yang digunakan untuk titrasi setara dengan jumlah gas NH3 yang dibebaskan selama destilasi. 1 Mol HCL = 1 mol N = 14 gN Bila indikator BCG + MR maka perubahan warna dari biru/hijau ke merah muda.

Perhitungan
%Protein Kasar = (V sampel - V blanko) HCl x N HCl x 14,007 mg berat sampel x PF x 100

%N =

(V sampel -

V blanko) HCl

x N HCl x 14,007 mg berat sampel

x 100

% protein = % N x PF (Protein Factor) N HCl = normalitas HCl 14,007 = BM N

Protein Factor
Penentuan protein factor tergantung kepada asal protein bahan Dengan asumsi bahwa campuran protein murni mengandung 16 % nitrogen Jadi protein bahan didapat dengan mengalikan % nitrogen dengan factor tersebut (6.25) yang berasal dari 100/16 = 6.25 Protein factor secara umum 6.25

PROTEIN FACTOR BEBERAPA JENIS PANGAN

Jenis pangan Campuran Daging Maizena Roti, gandum, makaroni,mie Susu dan produk susu Tepung Telur Gelatin Kedelai Beras Kacang tanah X(% N dalam protein) 16,00 16,00 16,00 16,00 15,66 17,54 14,97 18,02 17,51 16,81 18,32 Faktor Konversi F (100/X) = Protein Factor 6,25 6,25 6,25 6,25 6,38 5,70 6,68 5,55 5,71 5,95 5,46

Faktor konversi % N ke % protein Faktor 1.Sayuran 2.Buah-buahan 3.Susu 4.Ikan 5.Ragi dan algae 6.Daging 7.Cereal a.Barley (Horduum vulgare) b.Maize (Zea mays) c.Rice (Oriza sativa) d.Sorghum (Sorghum spp) 8.Legume a.Bean (Phaseolus vulgaris) b.Chick pea (cicer arietinum) c.Coco pea (Vigna spp) d.Groudeut (Arachic hypogea) e.Soy bean (Blycin max) 9.Terigu 10.Galatin 6.25 6.25 6.38 6.25 6.25 6.25 5.83 6.25 59.5 6.25 6.25 6.25 6.25 5.45 5.71 5.70 5.55

Contoh dalam labu kjeldahl (0,1 0,5 g)

+ 2 g K2SO4, 50 mg HgO, 3-5 ml H2SO4 , batu didih . Dididihkan sampai jernih (1-1,5 jam)

Penambahan air (hati-hati) Masukkan labu destilasi (labu kjeldahl dibilas), pasang penampung berisi 5 ml asam borat dan indikator. + 8 10 ml NaOH . Destilasi s/d 15 ml destilat tertampung

Titrasi dengan HCl sampai terjadi perubahan warna (abu-abu)

Soal
1. Pada penetapan kadar protein tepung terigu dengan metode kjedahl dimasukkan 0,1 gram contoh tepung ke dalam labu kjeldahl kemudian didestruksi sampai diperoleh larutan bening yang mengandung ammonium sulfat. Setelah dinetralisasi dan didestilasi, destilat dititrasi dengan HCl 0.0100 N. Volume HCl untuk titrasi contoh adalah 8,60 ml sedangkan untuk blanko adalah 0,10 ml. Hitung Kadar Protein basis basah dari tepung terigu tersebut. PF = 5,70

Pada penetapan kadar protein kacang tanah dengan metode kjedahl dimasukkan 0,08 gram contoh kacang tanah ke dalam labu kjeldahl kemudian didestruksi sampai diperoleh larutan bening yang mengandung ammonium sulfat. Setelah dinetralisasi dan didestilasi, destilat dititrasi dengan HCl 0.0095 N. Volume HCl untuk titrasi contoh adalah 27,55 ml sedangkan untuk blanko adalah 0,05 ml. Hitung Kadar Protein basis basah dari kacang tanahtersebut. PF = 5.46

Jawab
 % N = (8,60 0,10) ml X 0,0100 N X 14,007 X 100

0,1 g X 1000  % N = (8,50) ml X 0,0100 N X 14,007 X 100 = 1,1906 100  % protein = %N x PF  % protein = 1.1906 X 5,70 = 6.7864

Jawab
 % N = (27,55 0,05) ml X 0,0095 N X 14,007 X 100
0,08 g X 1000  % N = (27,50) ml X 0,0095 N X 14,007 X 100 = 4.5742 80  % protein = %N x PF  % protein = 4.5742 X 5,46 = 24.9749

2. Metoda Dumas (1981), Anales de chemis (3), 47 : 198

prinsip bahwa : N dibebaskan dengan cara pyrolisis dan N2 diukur volumenya Modifikasi dari Dumas dilaporkan oleh Stern Glanz dan Kolling, 1962 (Anal Chemist 34 : 544 547) Dapat menentukan dengan tepat dan akurat N dari bahan-bahan organik

3. Metoda Aktivation (Wood, 1965 )

digunakan untuk menentukan nitrogen dalam bahan dengan jalan mengaktivasi neutron dengan cepat. Telah dilaporkan oleh Doty et al, 1970. J. AOAC. 53 : 801 sedangkan Dohan et al, 1976. Cereal chem. 53 : 91, mengembangkan proton activation analysis William et al, 1978. Cereal Food Wood. 23 : 544. Membandingkan ke dua cara tersebut dengan cara Kjeldahl dan membuktikan bahwa cara neutron activation lebih baik hasilnya. Neutron dan proton activation sering diklasifikasikan dalam radio chemical analysis

4. Metoda Biuret (Riagler, 1914 ; anal chem 53 : 242 245) Prinsip :

Dalam larutan basa Cu2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida (-CO-NH) suatu protein yang berwana ungu. Intensitas warna ungu berbanding lurus dengan konsentrasi protein dan bisa diukur Absorbansi pada 540 nm

Keuntungan
Sederhana Cepat Murah Reaksi yang terjadi benar-benar reaksi protein

Kerugian :
Hasilnya dapat terpengaruh oleh kandungan lipid Warna yang terjadi dari berbagai jenis protein tidak identik, sehingga warna yang terbentuk perlu distandarisasi dengan protein yang diketahui

Berbagai modifikasi dari metoda biuret telah digunakan dalam determinasi protein dari bahan : Cairan fisiologis tanaman dan hewan Jaringan hewan Susu Cereal, dll Bahan dan Reagen 1.Protein standard (5 atau 10 mg albumin/ml) 2. Reagen biuret : Reagen A : larutkan 8,5 g CuSO4 dalam aquadest sampai 50 ml Reagen B : larutkan 3,6 gram KI dalam aquadest sampai 50 ml Reagen C : larutkan 81 g Na-sitrat , 50 g NaCO3, 80 g NaOH dalam aquades hungga volume 1000 ml Panaskan dan tambahkan reagen B. Encerkan sampai volume 1000 ml dengan aquadest

 Persiapan Contoh :
 Contoh berbentuk larutan, sekitar 1-10 mg protein/ml. Contoh padat

dicairkan dengan cara menghancurkan dulu dengan waring blender dengan penambahan air. Hancuran yang diperoleh disaring lalu disntrifugasi. Supernatan didekantasi untuk pengukuran.
 Contoh cair ; pengenceran. Bila keruh Ditambahkan air 1 ml dan 1 ml TCA

(Trikloro acetic acid) 10% hingga protein terdenaturasi, disentrifugasi 3000 rpm selama 10 ment sampai protein mengendap. Didekantasi an endapan ditambah 2 ml etil eter, dan disentrifugasi untuk menghilagkan sisa TCA. Di biarkan kering dan ditambahkan 4 ml air, sehingga protein larut sempurna.

6 ml reagen biuret + 4 ml Larutan std (0-1 mlprotein std add aquades s/d 4 ml

Cara
reagen biuret + 0.1-1 ml larutan protein

aduk

aduk penangas air 37 oC, 10 menit Dinginkan

penangas air 37 oC, 10 menit

Dinginkan baca pada 540 nm baca pada 540 nm Pengukuran Standard Pengukuran Sampel

Perhitungan

 Persamaan regresi dari kurva standar bovine serum albumin Y = a+ bx  Nilai Y = Absorbansi dan nilai x (konsentrasi protein contoh)

5. Metoda Phenol Reagen

Paling banyak digunakan untuk menentukan protein dalam larutan Didasarkan pada interaksi antara protein dengan reagen phenol dan Cu (copper) dalam larutan basa Pembentukan warna yang tidak terjadi karena : Cu (copper) mengkatalisa reaksi oksidasi dari asam-asam amino aromatik dan group lain oleh heteropolyphospat (phospofungstic phosphomolybdic) reagen Dasar reaksi ini diperkenalkan oleh Wu, 1922. Biol Chem. 51 : 33 34. Dimodifikasi oleh Folin dan Clocateau. 1927. J. Biol Chem. 73 : 627 650. Dan Lowry 1951. J. Biol Chem. 193 :265 -275. Cara ini lebih sensitif 100 kali dari Biuret , 10 20 kali dari metoda UV.

6. Metoda Spektrofotometri Langsung

Dasar :
Protein mempunyai absorpsi maksimal yang jelas pada panjang gelombang 280 nm karena mengandung tyrosine, trypthophan dan phenilalanin. Hasilnya harus diinterprestasikan secara hati-hati karena komposisi asam-asam amino berbeda (ada kalanya harus dikalikan dengan faktor 5 atau lebih besar) Asam nukleat : 260 nm

7. Metoda Nephelometri atau Metoda Turbidimetri

Kekentalan akan terjadi bila protein dicampur dengan zat pengendap protein, seperti : trichlor acetic acid Sulfo salisilic acid K ferrisianida dengan konsentrasi rendah Untuk larutan protein : cara ini mudah Untuk protein solid : perlu ekstraksi, memerlukan waktu dan analisa menjadi komplex Metoda ini tidak dapat membedakan protein yang mengendap dengan protein yang lain

Metode Dye Binding

 Penetapan protein cara tidak langsung  Prinsip : Gugus polar protein dapat mengikat zat warna (dye). Jumlah zat warna yang diikat berbanding langsung dengan kadar protein. Zat warna yang tidak terikat pada protein disentrifugasi, supernatan diukur intensitasnya. Semakin rendah nilainya semakin tinggi kadar protein. Zat warna : Amido Black (615 nm) dan Orange G (485 nm)

8. Dye Binding
Froenkel Corat dan Cooper. 1944. Melaporkan untuk pertama kali bahwa protein dapat mengikat zat warna organik Metoda ini dapat digunakan untuk : menentukan total group asam amino bersifat asam dan basa dari protein. Zat ini pada kondisi asam spesifik terhadap : Asam amino bebas Lysin Group imidozaol dari histidin Group guanidil dari arginine Zat warna orange 12 dapat juga digunakan (strukturnya sama seperti orange 6) hanya pada orange 12 mempunyai 1 gugus sulfanic acid Zat warna lain :Amido black 10 B dan Bromo sulfalein

Prosedur
 Persiapan Contoh  Pembuatan Kurva standar  Penetapan Contoh  Perhitungan

9. Metoda Lowry
Prinsip :  Reaksi antara Cu2+ dengan ikatan peptida dan reduksi asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan tritopan akan menghasilkan warna biru. Keuntungan menggunakan reagen Folin :  sangat sensitif, tidak memerlukan destruksi  10 20 kali lebih sensitif dari metoda UV pada panjang gelombang 280 nm  100 kali lebih sensitif dari metoda biuret  sampel yang digunakan sedikit jumlahnya, lebih sensitive daripada ninhydrin test

Reagen :
A : 2 % Na2CO3 didalam 0.1 N NaOH B : 0.5 % Cu SO4 5 H2O didalam 1 % Na K Tartrat C : larutan alkalin Cu = 50 ml larutan A + 1 ml larutan B D : sama dengan C tanpa NaOH (kegunaan reagen baca Lowry. 1951. J. Biol. Chem. 193 : 265 275) E : reagen Folin yang diencerkan dengan volume yang sama dengan air Larutan ini adalah : Na Tungstat + Na Molybdat : didalam phosporic acid dan HCl Protein standar : Serum darah manusia, atau Bovin serum albumin (serum darah sapi)

Prosedur
1. Kedalam tabung reaksi volume antara 3 10 ml dimasukkan larutan yang diperiksa sebanyak 0.2 ml (kandungan protein s 5 - 100 Qg) 2. Tambahkan 1 ml reagen C dan campurkan dengan sempurna 3. Biarkab 10 menit pada suhu kamar 4. Campurkan dengan cepat 1 ml reagen E 5. Biarkan 30 menit 6. Baca OD dengan spectrofotometer dengan P = 750 nm 7. Sebelumnya kerjakan kurva standar dengan sampel berbagai konsentrasi bovin serum albumin.

TUGAS
 Membuat Rangkuman materi Pendahuluan (GLP), Analisis kadar Air, Analisis kadar Abu, dan Analisis kadar Protein , Analisis Kadar Lemak, Analisis Mineral  Dipresentasikan 2 minggu kemudian (dipilih 6 kelompok secara acak)