Nurwachid Arbangi / PD-03

1

Fosforilasi Oksidatif
A. Teori
Fosforilasi oksidatif adalah suatu jalur metabolik yang menghasilkan ATP dari
ADP melalui fosforilasi yang menggunakan energi hasil oksidasi nutrisi. Fosforilasi
oksidatif terjadi di membran dalam mitokondria. Mitokondria terdiri atas membran
luar dan membran dalam. Membran luar mitokondria permeable terhadap molekul-
molekul kecil dan ion karena memiliki kanal transmembran. Sementara itu, membran
dalam mitokondria impermeable terhadap hampir semua molekul kecil dan ion.
Membran dalam mitokondria memiliki kompleks protein yang berperan dalam proses
fosforilasi oksidatif.
Katabolisme suatu zat (glukosa) akan menghasilkan elektron, elektron tersebut
kemudain akan ditangkap oleh universal electron acceptor (NAD
+
, NADP
+
, FMN,
FAD
+
).


NADH + H
+
yang terbentuk merupakan senyawa larut air yang kemudian akan
masuk ke mitokondria untuk memasuki jalur fosforiasi oksidatif.
Komponen rantai respirasi disusun dengan potensial reduksi yang meningkat.
Komponen tersebut adalah kompleks I, II, III, IV.
Kompleks I
NADH dehidrogenase mendehidrogensai NADH+H
+
sehingga didapatkan 2
elektron. Elektron ini kemudian ditransfer ke koenzim Q dan terbentuklah
ubiquinol (QH
2
). QH
2
merupakan senyawa yang larut lipid sehingga dapat
bergerak dalam membran dalam mitokondria membawa elektron tersebut ke
Di kompleks I juga dihasilkan 4H
+
yang dikeluarkan ke spasium intermembran.
Kompleks II
Melibatkan enzim succinate dehidrogenase yang mengubah succinat menjadi
fumarat dan menghasilkan FADH
2
yang akan transfer elektronnya ke koenzim Q
untuk mengasilkan QH
2
. Kompleks II tidak memompa H
+
ke spasium
intermembran.
Kompleks III
Terjadi transfer elektron dari QH
2
ke sitokrom c yang disertai pemindahan 4H
+

menuju spasium intermembran.
Kompleks IV
Terjadi transfer elektron dari sitokrom c ke oksigen dan menghasilkan H
2
O.
Sebenarnya pada kompleks 4 terbentuk 4H
+
, tetapi 2H
+
digunakan dalam
pembuatan molekul H
2
O dan hanya 2H
+
yang ditanspor keluar ke spasium
intermembran. Adanya transpor H
+
menuju spasium intermembran menyebabkan
munculnya proton motive force. Proton motive force disebabkan karena adanya
perbedaan potensial kimia dan potensial elektron antara matrix dan spasium
intermembran.
Nurwachid Arbangi / PD-03
2

Kompleks V
Kompleks V melibatkan enzim ATP synthase. ATP synthase terdiri atas 2
domain yaitu F0 dan F1. Di F1 terjadi reaksi pembentukan ATP dari ADP dan
pospat. Sedangkan F0 merupakan proton pore yang menyebabkan H+ dapat
masuk ke matrix mitokondria dan melepaskan ATP yang terbentuk di
permukaan F1. Total H+ yang ditanspor ke spasium intermembran untuk 1
NADH adalah 10, sedangkan 1 FADH adalah 6. Untuk membentuk 1 ATP
dibutuhkan 3-4 H
+
. Oleh karena itu, NADH dapat membentuk 3 ATP dan
FADH hanya 2 ATP.
B. Praktikum
1. Phosphate Estimation
Tujuan : Memperkirakan jumlah fosfat
Prinsip :
Fosforilasi Oksidatif terjadi bila terbentuk gradien proton diluar membran
dalam mitokondria dan membran dalam mitokondria utuh.
Penambahan agen uncoupler akan meningkatkan permeabilitas membran
dalam mitokondria sehingga gradien proton tidak terbentuk.
Fungsi Reagen :
1. Media inkubasi
a. Glukosa, ATP, dan crude hexokinase : mensuplai ADP dan Pi
b. KH
3
PO
4
: buffer
c. EDTA : mengikat logam-logam berat
d. NAD : sumber NAD
e. Bovin serum albumin : menghilangkan agen uncoupler yang mungkin
terakumulasi pada isolat mitokindria
2. Natrium Hidrogen Glutamat : Sumber glutamat yang akan mengubah NAD
+

menjadi NADH
3. 2,4 dinitrofenol : agen uncoupler
4. Sukrosa : sumber monosakarida
5. Suspensi mitokondria : sumber mitokondria
6. Trichloro acetic acid (TCA) : mendeproteinasikan campuran
7. Reagen Neumann :
a. HNO
3
: Mengubah fosfat organik menjadi fosfat inorgaik (Pi)
b. Amonium molibdate : bereaksi dengan Pi membentuk kompleks
berwarna kuning.
Fungsi Perlakuan :
1. Water bath 37
o
C : menyesuaikan suhu tubuh
2. Sentrifugasi : memisahkan camopuran berdasarkan berat molekul
3. Pemeriksaan pada
t = 0 menit : kontrol warna pada awal reaksi
t = 15 menit : memberikan waktu agar reaksi berjalan
Nurwachid Arbangi / PD-03
3

Prosedur
1. Menyiapkan 5 tabung inkubasi : tabung nomer 1 dan 2 dipanaskan dan
tabung 3, 4, dan 5 tidak.
2. Mencampurkan reagen ke tabung 1 dan 2
Reagen Tabung 1
(ml)
Tabung 2
(ml)
Media inkubasi 1 1
Na-H-Glutamat 0.2 0.2
2,4-dinitrofenol - 0.1
Air 0.3 0.2
Sukrosa 0.6 0.6
Masukan water bath 37
o
CTambahan
suspensi mitokondria dan hitung sebgai
t=0 menit
Suspensi
mitokondria
0.5 0.5

3. Perlakuaan saat t=0 menit
Memasukan 0,2 ml sample kedalam 2,8 ml TCA, kemudain sentrifugasi dan
ambil supernatan. Mambahkan reagen neumann. Bila mengandung fosfat,
akan timbul endapan dan larutan berwarna kuning jeruk.
4. Perlakuan saat t=15 menit
Sentrifugasi dan menambahkan 0,2 ml supernatan kedalam tabung reaksi
berisi 2,8 ml TCA. Mengecek adanya fosfat dengan mereaksikannya dengan
reagen neumann.
Pembahasan
Tabung 1 : Warna larutan pada t=15 menit jernih. Hal ini menunjukan kadar
fosfat rendah. Dengan kata lain, reaksi sintesis ATP berjalan dan fosfat
dalam larutan dipakai dalam proses pembentukan ATP.
Tabung 2 : Warna larutan pada t=15 menit kuning. Hal ini menandakan jumlah
fosfat dalam larutan tinggi dan tidak dipakai untuk pembuatan ATP (sintesis
ATP tidak berjalan)
2. Oxygen Uptake
Prinsip :
Pada fosforilasi oksidatif terjadi transpor elektron dan oksigen berperan sebagai
akseptor elektron terakhir. Sianida merupakan inhibitor enzim sitokrom reduktase
di kompleks IV sehingga dapat menghentikan proses transfer elektron. Potensial
reduksi methylene blue setara dengan ubiquinon sehingga dapat berkompetisi
menerima reducing equivalent.
Fungsi Reagen :
Nurwachid Arbangi / PD-03
4

Methylene blue (MB) : indikator warna (MB: biru tua, MB tereduksi :tidak
berwarna) dan berkompetisi dengan ubiqinon dalam menerima reducing
equivalent.
KCN : donor CN
-
, menginhibisi enzim sitokrom oksidase di kompleks IV
Parafin cari : mencegah keluar-masuknyanya oksigen
Fungsi Perlakukan:
Inkubasi dalam water bath 37
0
C: memberikan suasana sesuai keadaan fisiologis
tubuh manusia.
Prosedur
1. Menyiapkan reagen yang diperlukan
Reagen Tabung 3 Tabung 4 Tabung 5
Medium inkubasi 1 1 1
NA-H-Glutamat 0.2 0.2 0.2
2,4 dinitrofenol - 0.1 -
Methylene blue
(MB)
0.2 0.2 0.2
KCN 0.1 - -
Air - - 0.1
Sukrosa 0.6 0.6 0.6
Suspensi
mitokondria
0.5 0.5 0.5
2. Menambahkan parafin 2 ml ke tabung 3,4, dan 5.
3. Menginkubasi pada 37
o
C, amati perubahan warna.
4. Meninterpretasikan hasil
Hasil dan Pembahasan
Tabung 3 : Setelah 15 menit warna larutan jernih. Penambahan KCN
menyebabkan terganggunya kompleks IV sehingga proses pembentukan H
2
O
tidak terjadi dan Methelene Blue tetap dalam kedaan tereduksi (MBH
2
) yang
tidak berwarna.
Tabung 4 : Setelah 15 menit larutan berwarna biru kehijauan. 2,4 dinitrofenol
meningkatkan permeabilitas membran terhadap H
+
, tetapi tidak mengganggu
kompleks protein yang lain, utamanya kompleks IV. Kerja O
2
sebagai akseptor
elektron terakhir di kompleks IV tidak terganggu. MBH
2
memberikan
elektronnya untuk reaksi pemebntukan H
2
O dan kembali menjadi MB yang
berwarna biru.
Tabung 5 : Warna larutan biru muda. Tidak terjadi gangguan proses fosforilasi
iksidatif pada tabung ini, hanya saja karena adanya penambahan air, methelene
blue yang berwarna biru terencerkan sehingga warna akhir larutan adalah biru
muda.


Nurwachid Arbangi / PD-03
5