FOSFORILASI OKSIDATIF

By Jimmi L.

Prinsip Praktikum

Mitokondria + substrat = terjadi respirasi membentuk ATP. Bila terdapat glukosa dan
hexokinase, Pi tidak bisa membentuk ATP karena terperangkap dalam Glukosa 6 Pospat

Cara Kerja

Menyiapkan 5 tabung inkubasi, tabung 1 dan 2 dibuat dalam tabung didih, sedangkan
tabung 3, 4, dan 5 pada tabung reaksi dengan komposisi sbb :

1. Penentuan fosfat : 1 ml supernatan + 2 tetes HNO3 pekat + 2

ml ammonium molibdate, dipanaskan,
 seimbangkan campuran tabung 1
(+) bila warna larutan menjadi kuning
dan 2 pada suhu 37o C, saat 0 menit
jeruk + endapan
tambahkan mitokondria
 tutup tabung dan inkubasi dalam water
 ambil 0,2 ml sampel dan 2,8 ml
bath 37oC
TCA 10% sambil dicampur
 setelah 15 menit tentukan kandungan Pi
 sentrifugasi dan perkirakan
seperti poin 3, lalu bandingkan
kandungan Pi dari supernatan (menit
hasilnya
0) dengan Tes Newmann

2. Ambilan Oksigen

 tambahkan 2 ml parafin cair ke tabung  amatiperubahanwarnanya

3, 4, dan 5 lalu inkubasi pada 37 oC
tanpa digojog

Reagen dan Perlakuan

1
1. media inkubasi : 6. suspensi mitokondria : tempat
terjadinya respirasi selular
 Glukosa 150 mM : substrat
glikolisis 7. parafilm : mencegah kontaminasi
luar
 hexokinase : membentuk glukosa
menjadi glukosa 6 pospat 8. air : pelarut, mempermudah transfer
elektron
 KH2PO4 : mengambil Pi dari ATP/
sumber pospat 9. TCA : deproteinasi

 bovine serum albumin : mengikat 10. ammonium molibdat : mengikat Pi

uncoupling agent membentuk kompleks warna kuning

jeruk
 NAD+ : suplai koenzim
11. HNO3 : mengubah pospat organik
 ATP : sumber energi, sumber ADP jadi anorganik

2. 2, 4 Dinitrofenol : uncoupling agent 12. metilen blue : indikator warna yang

untuk memecah rantai posporilasi mempunyai potensial reduksi
oksidatif
perlakuan :
3. sodium hidrogen glutamat : sumber
glutamat  sentrifugasi : memisahkan
supernatan dan presipitat
4. kalium sianida : zat toksik yang
menghambat sitokrom a3  inkubasi : menyesuaikan keadaan
seperti dalam tubuh
5. sukrosa : sumber energi

Hasil Percobaan 1 : Penentuan fosfat

 Pada tabung 1 proses fosforilasi oksidatif berjalan dengan normal. ADP dan Pi
akan membentuk ATP. Tes Newmann menunjukan hasil negatif (kuning jernih)
karena tidak ada Pi yang tersisa, semua digunakan untuk membentuk ATP.

 Pada tabung 2 ditambahkan 2,4 dinitrofenol, yang memisahkan rantai fosforilasi

dengan rantai respirasi. Rantai fosforilasi dihambat, tidak terjadi ikatan ADP dan
Pi. Neumann Test hasilnya positif (larutan warna kuning jeruk) masih ada Pi

2
Percobaan 2 : Respirasi Seluler

Kadar Pi dilihat dengan indikator metilen blue, semakin muda warna birunya, kadar Pi
semakin rendah.

Pada tabung 3 ditambahkan KCN yang kerjanya dengan menghambat sitokrom

oksidase. Warna metilen biru menjadi biru muda, disebabkan tereduksinya MB oleh H+
menjadi MBH2. Namun perubahan ini reversible karena O2 molekuler yang masih ada
akan mengoksidasi MBH2 menjadi MB, sehingga larutan kembali berwarna biru.

Pada tabung 4, terdapat uncoupler, yaitu 2,4 dinitrofenol yang menyebabkan reaksi
rantai respirasi dan fosforilasi oksidatif terpisah dan berlangsung lebih cepat. Hal ini
menyebabkan fosforilasi oksidatif tidak terjadi, sehingga ATP tidak terbentuk.

Pada tabung 5, tidak ada inhibitor berupa uncoupler atau sianida sehingga reaksi
berjalan normal. Selama respirasi berjalan aktif, reaksi aerob bersaing dengan cabang
MB, sehingga hanya sebagian MB yang menjadi tidak berwarna, sampai semua oksigen
digunakan. Ion H+ yang dihasilkan mereduksi MB menjadi MBH2. Kadar Pi yang
menurun ditunjukan dengan warna biru yang semakin muda.

TEORI

FOSFORILASI OKSIDATIF

 Reducing equivalen hasil oksidasi karbohidrat, asam amino, dan lipid akan
diarahkan ke kompleks respirasi yang terdapat di membran dalam mitokondria
membentuk ATP dan direaksikan dengan O2 membentuk H20.

 komponen rantai respiratorik

1. NADH-Q oksidoreduktase ( kompleks 1) : elektron dari NADH dipindahkan ke

ubiquinon setelah sebelumnya melewati koenzim FMN dan Fe.S reaksinya sbb:

NADH + Q + 5H+ (matriks)--- NAD + QH2 + 4H+ (ruang antar membran)

2. Q- Sitokrom c oksidoreduktase (kompleks III) : elektron dari koenzim Q ke sitokrom

c. reaksinya sbb :

3
 QH2 + 2 Cyt c teroksidasi + 2H+ (matriks)-- Q + 2 Cyt c tereduksi + 4H+
(ruang antarmembran)

3. Sitokrom c oksidase (kompleks IV) : memindahkan elektron dari sitokrom c ke O2

melalui sitokrom a, sitokrom a3, dan Cu, oksigen akan tereduksi menjadi H20.

4 Cyt c tereduksi + O2 + 8H+ (matriks)--- 4 Cyt teroksidasi + 2 H20 + 4H+

(ruang antar membran)

NB : substrat dengan potensial redoks lebih positif dari NADH akan melalui
kompleks II bukan kompleks I, yaitu suksinat Q reduktase. Contohnya adalah FADH2
yang dibentuk dari konversi suksinat menjadi fumarat dan akan dipindahkan melalui
Fe.S ke koenzim Q tanpa mengakibatkan aliran proton ke ruang antar membran.

TEORI KEMIOSMOTIK

Kompleks I, III, dan IV bekerja sebagai pompa proton yang menciptakan

gradien proton antar ruang yang dibatasi oleh membran dalam, yaitu negatif pada sisi
matriks dan positif pada ruang antar membran. Daya gerak proton timbul dari
pengkopelan antara gradien proton dan perbedaan potensial elektrokimiawi. Daya gerak
proton inilah yang menyebabkan proton kembali masuk ke matriks melalui enzim ATP
sintase yang memicu terjadinya sintesis ATP.

Adanya uncouplers agent meningkatkan permeabilitas membran dalam terhadap

ion sehingga menurunkan gradien proton dengan membiarkan H+ kembali masuk
matriks tanpa melalui kompleks ATP sintase, sehingga respirasi tetap berjalan dan
cenderung lebih cepat namun tidak dihasilkan ATP.

4
KOMPLEKS ATP SINTASE

Daya gerak proton akan mengaktifkan ATP sintase dan bila terdapat ADP dan Pi
akan terbentuk ATP. struktur dari ATP sintase :

F1: subunit protein yang menonjol ke dalam matriks

FO: subunit protein yang menembus membran dalam membentuk kanal H+

OSCP : (oligomycin sensitivity conferring protein) menghubungkan FI dan FO

Racun yang menghambat rantai respiratorik :

 barbiturat : menghambat perpindahan elektron dari Fe.S ke Q

 antimisin A dan dimerkaprol : menghambat rantai respiratorik di kompleks III

 H2S, CO, sianida : menghambat kompleks IV

 malonat : inhibitor kompleks II

 atraktilosid :menghambat FO dengan menghambat ADP menjadi ATP

 uncouplers agent : memisahkan oksidasi dengan fosforilasi, contohnya adalah

2,4 dinitrofenol, termogenin, oligomisin. dinitro fenol bersifat amfipatik yang
meningkatkan permeabilitas membran lipid dalam mitokondria sehingga
potensial elektrokimia menurun

KLINIS

Kerusakan atau ketiadaan dari sebagian besar oksidoreduktase dalam rantai respirasi
dapat menyebabkan disfungsi ginjal dan miopati mitokondria infantil fatal. MELAS
(encelopati mitokondria, asidosis laktat, dan stroke) merupakan akibat dari defisiensi
kompleks 1 atau kompleks 4 yang disebabkan karena mutasi DNA mitokondria.
referensi :

 Kooman, Roehm. 2004. Color A tlas of Biochemistry. Thieme. New York

 Mayes, Peter A. 2009) Harper’s Biochemistry Edisi ke-27. Penerbit Buku

Kedokteran EGC, Jakarta

5
 Buku Manual Praktikum Blok 1.2 Cradiorespiratory Sytem. FK UGM 2009