UJI FISIKO-KIMIA SENYAWA OBAT

Senyawa aktif atau bioaktif adalah senyawa yang dapat memicu terjadinya aktivitas biologi dalam
organisme hidup.
Aktivitas biologi merupakan keseluruhan perubahan di dalam sistem biologi yang disebabkan oleh suatu
senyawa aktif.
Obat merupakan salah satu senyawa aktif yang banyak digunakan dalam bidang kesehatan/pengobatan.
Obat secara umum didefinisikan sebagai bahan/senyawa kimia yang dapat berinteraksi dengan salah satu
bagian tubuh dan mempengaruhi proses fisiologi dan biokimia yang terjadi pada tubuh. Obat dapat
menurunkan atau meningkatkan fungsi organ, jaringan atau sel, tetapi tidak memunculkan fungsi yang baru.

Batasan Menurut UU:

Obat adalah bahan atau paduan bahan- bahan, termasuk produk biologi yang digunakan untuk
mempengaruhi atau menyelidiki sistem fisiologi atau keadaan patologi, dalam rangka penetapan diagnosa,
pencegahan, penyembuhan, pemulihan, peningkatan kesehatan dan kontrasepsi untuk manusia (UU No
36, 2009 tentang Kesehatan, ayat 1, point 8).

Sedian farmasi terdiri atas obat, bahan obat, obat tradisonal dan kosmetika (UU 36/2009, ayat 1, point 4).
Sediaan farmasi berupa obat dan bahan baku obat harus memenuhi syarat farmakope Indonesia atau buku
standar lainnya. (UU No 36/2009, pasal 105)

Penggunaan obat
Obat digunakan untuk satu atau lebih tujuan berikut:
Melengkapi unsur yang kurang dalam tubuh (misalnya vitamin, hormon, mineral, protein, glukosa, dll)
Pencegahan suatu penyakit atau infeksi (misalnya vaksin dan sera)
Melawan dan membunuh penyebab infeksi (misalnya antibiotika, antibakteri )
Menghalangi sementara fungsi normal organ tubuh (misalnya anestetik dan kontrasepsi)
Mengoreksi suatu fungsi fisiologi yang terganggu (misalnya disfungsi, hipofungsi dan hiperfungsi ).
Mendetoksikasi racun-racun dalam tubuh (misalnya antidotum)
Membantu diagnosa penyakit atau keadaan faal (misalnya senyawa opaque, senyawa bertanda
Obat yang ideal
Mempunyai efek farmakologi/aktivitas biologi yang diharapkan.
Mempunyai sedikit atau tidak sama sekali efek samping.
Mencapai lokasi target obat yang ditentukan pada konsentrasi dan waktu yang tepat.
Mampu berada sisi kerja untuk periode waktu yang diperlukan.
Page|1

Dapat dihilangkan secara cepat dan sempurna dari tubuh (melalui ekskresi) ketika obat itu tidak dibutuhkan
lagi.

Tujuan pengujian
Setiap obat dan produk farmasi yang akan digunakan dan diedarkan untuk dijual harus memenuhi syarat
: khasiat, keamanan dan kualitasnya (UU 36/2009, pasal 98 ayat 1)
Uji khasiat dan keamanan obat dilakukan di suatu laboratorium pengujian secara pra-klinik atau klinik.
Sedangkan uji kualitas obat dilakukan di suatu laboratorium pengujian kualitas/mutu ( industri,
pemerintahan atau universitas).

Status Hukum Farmakope/Kodeks

1. Farmakope adalah sebuah buku yang berisi kumpulan standar dalam bidang farmasi terutama bahan
baku obat serta sediaan jadinya, produk biologi, alat kesehatan, metode analisis, prosedur dan
instrumennya, bahan baku pembanding, sediaan umum dan penerapan standar yang berkaitan dengan
standarisasi di bidang farmasi.
2. Analog untuk bahan tambahan makanan, maka standar yang digunakan adalah Kodeks Makanan.
Bahan untuk kosmetik menggunakan standar Kodeks Kosmetik. Untuk bahan alam dan simplisia
digunakan standar Materia Medika.
3. Buku-buku standar tersebut dikeluarkan dan ditetapkan oleh suatu badan resmi.

Isi Monografi Farmakope

Nama resmi farmakope (INN, generik) dalam bahasa Indonesia dan Latin.
Rumus molekul, struktur dan nama kimia resmi dengan CAS number dan BM.
Pernyataan kadar atau potensi bahan aktif dalam bahan baku atau sediaannya.
Pemerian atau uraian dari segi organoleptik bahan.
Kelarutan dalam berbagai pelarut.
Identifikasi
Syarat atribut mutu/tetapan fisika bahan.
Kemurnian
Penetapan Kadar/Potensi
Wadah dan Penyimpanan

Implikasinya
Semua bahan obat dan sediaan farmasi resmi
Page|2

(artinya tercantum dalam FI) dan beredar di wilayah Indonesia harus memenuhi persyaratanidentitas,
kadar, atribut mutu dan kemurnian yang tercantum dalam monografi FI (kecualibobot molekul, rumus
kimia dan kelarutan).
Pengujian mutu yang menggunakan metode dan prosedur lain di luar Farmakope dapat
digunakan asalkan dapat dibuktikan ketelitian dan ketepatannya paling sedikit sama dengan metode dan
prosedur farmakope melalui suatu verifikasi metode.

PENGUJIAN MUTU BAHAN BAKU OBAT

1. Tujuan : menetapkan kesesuaian dengan persayaratan bahan baku obat meliputi: identitas, atribut
mutu, kemurnian dan kadar.
2. Cara : menggunakan metode, prosedur dan instrumen yang tercantum dalam Farmakope.
3. Kalau tidak tercantum dalam FI, maka dapat digunakan persyaratan dari Farmakope lainnya
seperti: USP, BP, JP, EP, P Int, dll)

I. SYARAT IDENTITAS

Syarat identitas atau identitas baku adalah pernyataan kualitatif yang harus dipenuhi untuk membuktikan
kebenaran, kesesuaian identitas dan keotentikan senyawa aktif seperti yang tertera pada etiketnya
sehingga dapat dibedakan dengan senyawa/bahan yang lain.
Identifikasi adalah suatu cara untuk mengungkap identitas dan membuktikan bahwa bahan yang diperiksa
mempunyai identitas yang sesuai dengan senyawa yang tertera pada etiketnya.
Identifikasi ini mengikat walaupun cara pengujiannya tidak cukup kuat tetapi harus spesifik dan peka.
Pengujian lainnya dapat digunakan sebagai penunjang pembuktian identitas bahan yang diuji.
Contoh pernyataan identitas

1. Spektrum serapan infra merah zat yang telah dikeringkan dan didispersikan dalam kalium bromida P
menunjukkan maksimum hanya pada panjang gelombang yang sama seperti pada .BPFI.
2. Harga Rf bercak utama pada kromatogram uji sesuai dengan larutan baku seperti tertera pada
penetapan cemaran umum <481>.
3. Waktu retensi puncak utama pada kromatogram larutan uji sesuai dengan larutan baku seperti yang
tertera pada penetapan kadar
4. Pada 5 ml larutan 2%, tambahkan 1 ml natrium hidroksida 2N: terbentuk endapan kuning.
5. Spektrum serapan ultraviolet larutan (1 dalam 10000) dalam larutan natrium hidroksida encer P
menunjukkan maksimum dan minimum hanya pada panjang gelombang yang sama pada.

Page|3

Cara melakukan identifikasi

Syarat identitas dapat diungkap dengan melakukan berbagai uji identifikasi yang berdasar pada:

1. Cara metode kimiawi

2. Cara fisikokimia
3. Cara kromatografi
4. Cara fisika

A. CARA KIMIA
Cara kimia dalam identifikasi meliputi penggunaan pereaksi kimia yang dapat bereaksi secara khas
dengan senyawa yang diuji.
Reaksi kimia yang dapat digunakan dalam identifikasi adalah:
1. hasil reaksi harus dapat diobservasi oleh indra seperti warna, bau, endapan, dll.
2. Reaksi harus cepat dan spesifik
3. Reaksi harus dapat diulang (reproducible) dengan hasil yang sama baik dilakukan oleh penguji lain
atau pada waktu yang berlainan.
Cara melakukan

1. Menggunakan tabung reaksi

2. Menggunakan pelat tetes, untuk reaksi tetes (spot test).

Catatan:

1. Reaksi harus menunjukkan bagian molekul yang khas (ion, gugus fungsi atau gol. )
2. Kadang-kadang diperlukan pemanasan untuk mempercepat reaksi (hati-hati).
3. Untuk membantu interpretasi, gunakan juga kontrol positif dan kontrol negatif.
4. Untuk mendeteksi adanya bau, gunakan kibasan tangan, jangan langsung dihirup dengan hidung
karena berbahaya (toksis).

Klasifikasi reaksi kimia

Reaksi untuk ion-ion:
Digunakan untuk identifikasi senyawa ionik ( senyawa anorganik) dan senyawa organik berupa asam, basa
organik atau garamnya.
Reaksi penggolongan senyawa obat:
Digunakan reaksi kimia penggolongan menggunakan pereaksi kimia yang khas, umum dan semi spesifik:
misalnya reaksi untuk alkaloida, senyawa xantin, senyawa amin aromatik primer, turunan fenotiazin, fenol,
dll.
Page|4

FI menggunakan istilah uji identifikasi umum <291> berupa cara pengujian yang sering digunakan untuk
identifikasi zat resmi. Pengujian ini tidak dimaksudkan untuk dilakukan terhadap campuran zat kecuali jika
dinyatakan demikian.
Kelemahan dan Keunggulan identifikasi dengan cara kimia
Keunggulan:
1. Praktis, murah, dan cepat
2. Mudah diinterpretasikan
3. Terdapat cara kimia untuk identifikasi yang tidak dapat digantikan oleh cara instrumen

Kelemahan:
1. Merupakan metode destruktif
2. Tergantung pada kadar (kepekaan pereaksi)
3. Pengamatannya dapat tertutupi oleh ada reaksi lain atau senyawa lain.

B. CARA FISIKO-KIMIA
Cara ini mempunyai beberapa keuntungan yaitu hasil yang diperoleh lebih nyata dan dalam beberapa
hal bahan tidak mengalami kerusakan atau penguraian yang berarti.
Salah satu kelemahannya adalah cara ini memerlukan instrumen yang canggih dan bahan baku
pembanding serta keterampilan khusus untuk melaksanakannya. Kadang-kadang memerlukan bahan yang
murni dan biaya yang cukup mahal.
Cara yang direkomendasikan Farmakope adalah cara Spektrofotometri (UV dan IR), serta cara
Kromatografi (KLT, KCKT dan KG).

B.1. Spektrofotometri Infra merah

FI menggunakan cara ini sejak FI ed. III tahun 1972. Identifikasi ini menggunakan pengukuran spektrum
radiasi IR pada daerah 2,5 15 m atau 4000 667 cm -1 (dalam bilangan gelombang).
Spektrum yang diperoleh menggambarkan puncak-puncak yang berkaitan dengan gugus fungsi, ikatan-
ikatan kimia dan juga kerangka molekul.
Sampel uji harus murni karena spektrum IR dapat dipengaruhi senyawa asing, cemaran ataupun matriks.
Pengujian memerlukan senyawa atau spektrum IR senyawa pembanding (BPFI).
Penyiapan sampel
Ada dua cara penyiapan baik untuk sampel uji maupun bahan pembanding.
1. Senyawa berupa cairan, diteteskan pada ruang diantara dua lempeng NaCl padat transparan
sehingga terbentuk lapisan tipis film. Atau senyawa didispersikan dalam cairan bebas air yang sesuai
seperti parafin (mull).
Page|5

2. Senyawa berupa padat, dapat didispersikan dalam parafin cair atau cairan lain yang sesuai hingga
terbentuk pasta homogen. Atau digerus dengan KBr kering dan halus sampai homogen lalu dicetak
menjadi tablet tipis, transparan , rata, dan tak ada retakan.

Cara identifikasi

Spektrum IR menggambarkan grafik antara perubahan transmitans dengan perubahan bilangan

gelombang.
Spektrum IR zat uji dinyatakan sesuai bila menunjukkan maksimum/puncak dalam posisi
maupun intensitas relatif sama dengan spektrum IR bahan pembanding yang
diperlakukan sama.
Oleh karena itu identifikasi memerlukan spektrum IR bahan baku pembanding (BPFI) atau
spektrum IR pembanding dari Pustaka.
Bilangan gelombang untuk beberapa gugus fungsi dan ikatan (hanya sebagian saja).

B.2. Spektrofotometri UV-VIS

Spektrum UV VIS suatu senyawa organik menggambarkan kurva antara serapan terhadap panjang
gelombang radiasi pada daerah 190 380 nm (daerah ultra violet) dan 380 800 nm ( daerah visibel).
Spektrum UV-VIS suatu senyawa organik biasanya tidak menunjukkan selektifitas yang tinggi seperti
spektrum IR. Tetapi ada beberapa senyawa yang memberikan profil yang khas atau memadai sehingga
spektrum UVnya dapat digunakan untuk identifikasi.
Cara identifikasi

Ada tiga (3) parameter yang digunakan dalam identifikasi dengan spektrofotometri UV, yaitu:

1. Pola (profil) spektrum UV dalam kadar dan pelarut tertentu.

2. Letak dan harga serapan maksimum pada panjang gelombang tertentu.
3. Harga serapan jenis , A (1cm, 1%) atau serapan molar ( ) senyawa tersebut yang dapat dihitung dari
persamaan Lambert- Beer.

Pendekatan interpretasi

Pengukuran spektrum dilakukan terhadap larutan dalam pelarut dan konsentrasi tertentu yang telah
dinyatakan monografi.

Page|6

 Pengukuran serapan dilakukan pada panjang gelombang yang dinyatakan monografi secara tepat
atau dalam batas 2 nm dari panjang gelombang yang telah ditentukan. Dalam hal ini yang dijadikan
parameter adalah nilai serapan atau ratio serapan pada dua (2) panjang gelombang yang berbeda.
Spektrum UV zat uji dikatakan sesuai dengan spektrum UV bahan pembandingnya bila kedua
spektrum itu identik baik pola spektrum, posisi panjang gelombang serapan maksimum maupun
serapan jenisnya (dalam pelarut dan konsentrasi yang sama).

B. 3. Kromatografi lapis tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah teknik kromatografi cair dimana fase diam berupa bahan padat
penjerap yang menyebar merata seperti lapisan tipis di atas lempeng kaca, plastik atau logam.
Pemisahan berlangsung karena adanya perbedaan adsorpsi, partisi, kombinasi keduanya dan
pertukaran ionik.
Pertama kali digunakan pada 1938 oleh Ismailov dan Scraiber dari Ukranian Institut of Experimental
Pharmacy, dan dikembangkan lebih lanjut oleh Egon Stahl pada 1950..

Cara identifikasi

Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan bercak dengan harga Rf yang identik dan
ukuran yang hampir sama, dengan menotolkan zat uji, bahan pembanding serta campuran zat uji
dan bahan pembanding.
Harga Rf sendiri tidak dapat langsung digunakan sebagai dasar identifikasi karena nilainya sangat
tergantung pada kondisi percobaan yang dilakukan. Faktor yang berpengaruh pada nilai Rf adalah:
kualitas fase diam, komposisi fase gerak/larutan pengembang, kejenuhan bejana pengembang,
suhu, jarak pengembangan dan jumlah sampel yang ditotolkan.
Untuk menghindari hal ini, maka identifikasi dilakukan dengan cara ko-kromatografi, dengan
menotolkan tiga bercak : zat uji, campuran zat uji dan bahan pembanding, serta bahan pembanding
pada lempeng yang sama.

Cara mengetahui posisi bercak

Untuk menghitung harga Rf suatu bercak maka perlu diketahui posisi bercak yang telah terpisah
dalam kromatogram.

1. Pengamatan langsung, untuk bercak yang berwarna, atau tampak dibawah sinar biasa atau
sinar UV.

Page|7

 2. Direaksikan dengan pereaksi kimia tertentu dengan cara disemprotkan atau dibacam. Pereaksi
yang digunakan disebut pereaksi penampak bercak.
3. Dengan cara bioautografi menggunakan bakteri.
Peralatan
1. Lempeng kaca, alumunium atau plastik ukuran 20 X 20 cm atau 20 X10 cm.
2. Pembuat lapisan tipis (TLC sprider).
3. Bahan penjerap sebagai fase diam: silika gel GF 254, atau jenis lainnya.
4. Bejana Pengembang Kromatografi.
5. Cairan Pengembang/eluen.
6. Alat dan pereaksi penampak bercak.

Sekarang lempeng KLT komersial sudah tersedia dalam bentuk pralapis (precoated) yang sangat
kuat namun cukup mahal.
Tahapan pengujian

Penyiapan lempeng KLT termasuk aktivasinya.

Penyiapan larutan pengembang dalam bejana sekaligus penjenuhannya.
Penotolan larutan sampel ( kalau perlu dilakukan ekstraksi dari sampel)
Pengembangan lempeng KLT dalam bejana yang jenuh dengan larutan pengembang.
Pengeringan lempeng dan penentuan bercak dan perhitungan harga Rf.
Evaluasi dan interpretasi hasil

B.4. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

KCKT merupakan kromatografi kolom cair yang menggunakan kolom berlubang kecil (dengan
diameter dalam 2 - 5 mm) dan isi kolom berupa partikel kecil 3 50 m yang memungkinkan
tercapainya kesetimbangan secara cepat antara fase gerak dengan fase diam.
Kolom kecil ini memerlukan sistem pompa tekanan tinggi agar tercapai laju alir ml/menit.
Kadar zat uji yang kecil < 20 g maka diperlukan suatu detektor yang sensitif dan selektif.
Dengan teknologi ini KCKT menghasilkan pemisahan dan sekaligus pencirian yang cepat dengan
kinerja yang tinggi.

Page|8

Peralatan dan kerja KCKT

Pada dasarnya peralatan KCKT terdiri dari sistem pompa, gerbang suntik, kolom, detektor, penguat
sinyal dan perekam data (biasanya digabung dalam sistem komputer).
Sistem pompa mengalirkan fase gerak ke dalam kolom melalui pipa tekanan tinggi. Sampel
disuntikkan melalui gerbang suntik dengan sistem loop ke dalam kolom. Aliran fase gerak yang
membawa analit akan keluar dari ujung kolom yang lain dan dideteksi oleh detektor.

Cara identifikasi

Dengan menggunakan detektor diferensial kromatogram akan memunculkan puncak-puncak yang

menggambarkan komponen suatu sampel.
Untuk identifikasi kromatogram senyawa uji dibandingkan dengan kromatogram senyawa
pembanding (BPFI) yang dikromatografi dalam kondisi yang tetap sama (tekanan, laju alir, kolom
dan komposisi fase gerak).
Sebagai parameter identitas digunakan waktu retensi (tR )atau volume retensi (VR ) senyawa uji dan
senyawa pembanding.
Detektor yang biasa digunakan adalah fotometer UV, refraktometer dan fluorometer ( sekarang
dimungkinkan menggunakan detektor spektroskopi massa).
Pemisahan senyawa dikendalikan oleh interaksi solut- fase gerak- fase diam( lihat teori pemisahan
kromatografi)
Jika terdapat senyawa lain yang berbeda tapi mempunyai waktu retensi yang sama, maka
dianjurkan menggunakan teknik Spiking atau ko-kromatografi. Di mana tiga jenis larutan disiapkan
terdiri dari larutan uji, bahan pembanding dan larutan campuran keduanya. Ketiganya dikromatografi
dengan kondisi yang sama.
Waktu retensi puncak utama pada ketiga kromatogram akan identik dengan kromatogram
yangdispike akan memunculkan puncak yang lebih tinggi karena ada penambahan dari bahan
pembanding. Kalau ternyata puncaknya tidak bertambah, maka dalam sampel diuji dapat dipastikan
tidak ada senyawa yang dimaksud.

II. SYARAT ATRIBUT MUTU

Tanda kualitas baku (standard quality attributes) adalah besaran angka, nilai atau rentang angka
tetapan fisika yang harus dipunyai bahan kimia.
Tetapan fisika merupakan tetapan yang khas untuk senyawa murni, sehingga dapat digunakan
sebagai kriteria identifikasi. Akan tetapi dengan adanya senyawa asing atau cemaran dalam senyawa
Page|9

 akan mempengaruhi tetapan fisika yang terukur (Hukum Roult). Oleh karenanya tetapan fisika dapat
digunakan sebagai kriteria kemurnian.

Contoh pernyataan tanda kualitas

1. Suhu lebur lebih kurang 225o disertai peruraian.
2. Rotasi jenis -239o sampai-258o, dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan menggunakan larutan 1%
dalam asam klorida 0,01N.
3. Jarak lebur antara 110o dan 112o.
4. Indeks bias 1,526 sampai 1,537
5. Bobot per ml 0,90 sampai 0,923
6. Bobot jenis antara 0,882 dan 0,886, lakukan penetapan pada suhu 25o

A. Penetapan suhu atau jarak lebur

Suhu lebur zat padat adalah suhu pada saat zat padat mulai melebur dan melebur sempurna.
Jadi jarak lebur adalah jarak antara suhu awal dan suhu akhir peleburan zat.
Suhu awal peleburan dicatat pada saat zat mulai melebur dan suhu akhir dicatat pada saat hilangnya
fase padat menjadi fase cair.

Peralatan

1. Pipa kapiler (10 cm, diameter 0,8 1,2 mm dan tebal 0,2 0,3 mm).
2. Termometer yang telah dikalibrasi.
3. Wadah gelas untuk tangas cairan yang transparan dengan pengaduk dan pemanas api atau
listrik.

Sekarang sudah ada alat listrik otomatis dan digital komersial untuk penetapan suhu dan jarak lebur
tersebut (electrothermal melting point determination apparatus).

Cara penetapan

Setiap peralatan harus memiliki ketelitian yang setara dan harus nsering dikalibrasi dengan
menggunakan satu atau lebih dari 6 baku pembanding suhu lebur.
Dalam FI IV terdapat 5 metode yang semuanya menggunakan pipa kapiler. Yang paling banyak
digpakai adalah metode I.

Page|10

 Pernyataan lebih kurang berati suhu lebur tidak boleh berbeda + 2o dari suhu lebur yang
dinyatakan. Sedangkan jarak lebur yang diuji harus berada dalam rentang suhu yang dinyatakan
monografi.

B. Penetapan Rotasi Optik dan Jenis.

Beberapa senyawa optik-aktif dalam keadaan murni atau dalam bentuk larutan dapat memutar
bidang polarisasi cahaya terpolarisasi yang melewatinya. Kemampuan ini dapat digunakan sebagai
kriteria identifikasi dan juga kemurnian.
Rotasi optik adalah besar sudut pemutaran bidang polarisasi yang terjadi bila cahaya terpolarisasi
dilewatkan padanya. Cahaya yang digunakan adalah lampu Natrium pada garis D atau garis 546,1
nm pada spektrum raksa.
Rotasi jenis adalah besar sudut pemutaran bila dilewatkan pada larutan sepanjang 1 dm yang
mengandung 1g/ml
Tanda (+) diberikan pada senyawa yang memutar ke arah yang searah putaran jarum jam, dan
tanda (-) untuk yang berlawanan dengan arah putaran jarum jam.

Peralatan dan perhitungan

1. Peralatan : Polarimeter (manual ataupun digital)

2. Perhitungan Rotasi Jenis adalah:

[]tD = 100 /(L.c)

di mana
= besar sudut rotasi
L = panjang sel dalam dm
c = kadar zat (g/100 ml)

C. Penetapan Indeks Bias

Indeks bias suatu zat adalah perbandingan kecepatan cahaya dalam hampa udara dengan
kecepatan cahaya dalam zat tersebut.
Indeks bias berguna untuk identifikasi cairan murni dan pengujian kemurnian.
Indeks bias dinyatakan pada suhu 20o dengan menggunakan Refraktometer yang dilengkapi
dengan cahaya Natrium garis D 589,3 nm.
Refraktometer komersial dirancang dengan menggunakan cahaya putih tapi telah dikompensasi
agar memberikan indeks bias setara dengan cahaya natrium garis`D.
Page|11

D. Penetapan bobot jenis

Bobot jenis dan bobot per ml ditetapkan untuk cairan atau larutan.
Bobot jenis adalah perbandingan antara bobot zat di udara pada suhu 25o terhadap bobot air dengan
volume dan suhu yang sama.
Bobot per ml adalah bobot zat dalam gram per ml yang ditimbang di udara pada suhu 20o, kecuali
dinyatakan lain dalam monografi.
Alat yang digunakan : Piknometer

Page|12