BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Pada tahun 1995, sebuah pencapaian ilmiah besar diumumkan.Untuk pertama
kali, para peneliti telah menyeksuekensing seluruh genom dari salah satu spesies
organisme yang hidup bebas, bakteri Haemophilus influenza.Berita ini membuat
komunitas sains terperanjat hanya sedikit di antara mereka yang berani bermimpi
bahwa hanya 12 tahun sesudah itu, sekensing genom untuk lebih dari 2.000 spesies
tengah dilakukan. Pada 2007, para peneliti telah selesai menyekuensing ratusan
genom prokariota dan lusinan genom eukariota, termasuk sekitar 3 miliar pasang basa
genom manusia.
Pada dasarnya pencapaian ini dimungkinkan oleh kemajuan teknologi DNA-
metode untuk mengolah dan memanipulasi DNA yang mulai berkembang pada 1970-
an. Salah satu keberhasilan penting adalah penemuan teknik untuk membuat DNA
rekombinan(Recombinant DNA),Molekul DNA yang terbentuk ketika segmen DNA
dari dua sumber yang berbeda seringkali spesies yang berbeda digabungkan in vitro
(dalam tabung reaksi). Ini membuka jalan bagi perkembangan teknik-teknik yang
canggih untuk menganalisis gen dan ekspresi gen. Bagaimana ilmuwan menyiapkan
DNA rekombinan dan menggunakan teknologi DNA untuk menjawab pertanyaan-
pertanyaan fundamental biologi.
Ini juga berfokus pada bagaimana kehidupan kita dipengaruhi oleh bioteknologi
(biotechnology) manipulasi organisme/komponennya untuk menghasilkan produk
yang bermanfaat.Bioteknologi memiliki sejarah panjang yang mencakup praktik-
praktik terdahulu seperti pembiakan selektif hewan ternak dan penggunaan
mikrooganisme untuk membuat anggur dan keju. Kini bioteknologi juga mencakup
rekayasa genetik (Genetic engineering), manipulasi langsung gen demi tujuan praktis.
Rekayasa genetik telah melancarkan sebuah revolusi dalam bioteknologi, sehingga
sangat mengembangkan lingkup potensi aplikasi bioteknologi.

1
 Alat dari kotak peralatan DNA kini diterapkan dalam berbagai cara yang tidak
terpikirkan satu dasawarsa lalu, memengaruhi semua hal mulai dari pertanian, hukum
pidana, hingga penelitian medis. Misalnya, pada microarray DNA. Titik-titik bewarna
mempresentasikan tingkat ekspresi relatif 2.400 gen manusia. Dengan analisis
microarray, peneliti bisa membandingkan ekspresi gen pada sempel yang berbeda-
beda secara cepat, misalnya sempel dari jaringan normal dan kanker. Pengetahuan
yang diperoleh dari penelitian ekspresi gen semacam itu memberikan sumbangan
besar terhadap penelitian kanker dan penyakit lain.
Dalam hal ini, pertama-tama kita akan mengatahui pengertian dari DNA
rekombinan, berikutnya, kita akan memahami bahwa adanya prinsip-prinsip dalam
teknologi DNA rekombinan, dalam melakukan teknologi DNA rekombinan meliputi
tahap-tahapan yang mendasarinya. Terakhir,kita akan meninjau manfaat dan dampak
dalam penggunaan teknologi DNA rekombinan serta contoh hasil penelitian atau
percobaan yang dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan.
B. Rumusan Masalah
1. Apa yang di maksud dengan teknologi DNA rekombinan?
2. Bagaimana prinsip-prinsip teknologi DNA rekombinan?
3. Bagaimana tahapan dalam pembentukan DNA?
4. Bagaimana manfaat dan dampak teknologi rekombinan?
5. Bagaimana penelitian kloning Gen penisilin pada DNA rekombinan?
C. Tujuan Penulisan
Tujuan dari pembahasan dari makalah ini adalah, agar mahasiswa/i dapat
mengetahui dan memahami:
1. Teknologi DNA rekombinan.
2. Prinsip-prinsip teknologi DNA rekombinan.
3. Tahapan dalam pembentukan DNA.
4. Manfaat dan dampak teknologi rekombinan.
5. Penelitian mengenai kloning Gen penisilin pada DNA rekombinan.

2
D. Manfaat Penulisan
Adapun manfaat yang dapat diambil dari penyusunan makalah ini adalah:
a. Bagi penulis
1. Agar dapat digunakan untuk menyelesaikan tugas penyusunan makalah
Bioteknologi dengan judul Teknologi DNA Rekombinan.
2. Agar penulis lebih mengetahui sistematika penulisan makalah.
3. Agar penyusunan makalah ini menambah wawasan dan kualitas ilmu yang
dimiliki oleh penyusunan makalah.
b. Bagi pembaca
Agar penyusunan makalah ini dapat menambah wawasan para pembaca
baik dosen maupun mahasiswa/mahasiswi Universitas Borneo Tarakan serta
agar makalah ini dapat dijadikan sebagai contoh literatur dalam penyusunan
makalah.

3
 BAB II

PEMBAHASAN

A. Pengertian Teknologi DNA Rekombinan

Sejak zaman dahulu kala, nenek moyang kita telah mengenal beraneka ragam
makhluk hidup. Beragamnya makhluk hidup memberikan kemungkinan bagi manusia
untuk memilih sesuai dengan yang dikehendakinya.Keanekaragaman itu sudah dapat
kita lihat pada salah satu jenis makhluk hidup saja, misalnya pada padi. Ada padi
yang umur panennya pendek, ada pula yang umur panennya panjang, ada padi yang
bijinya wangi dan ada pula yang tidak wangi, ada padi yang batangnya pendek dan
ada pula padi yang batangnya panjang, ada padi yang berasnya pulen dan ada pula
yang beranya keras (tidak pulen), padi kehidupan kita sehari-hari, secara langsung
maupun tidak langsung, sebagian dari kita pernah berhubungan dengan hasil
penggunaan teknologi DNA Rekombinan.
Tidak puas dengan memilih kombinasi sifat yang sudah ada di alam, manusia
melakukan usaha untuk membuat kombinasi baru dari sifat-sifat yang
diinginkan.Cara klasik yang telah dilakukan oleh para pendahulu kita untuk
mendapatkan kombinasi sifat yang diinginkan adalah dengan melakukan persilangan
(breeding).Para ahli pemuliaan tanaman telah melakukan persilangan-persilangan
untuk menghasilkan berbagai jenis ternak dan berbagai jenis tanaman yang memiliki
kombinasi sifat-sifat unggul. Untuk dapat menghasilkan ternak atau tanaman unggul
dengan cara breeding ini dibutuhkan waktu yang lama dan lahan yang tidak sedikit.
Persilangan (hidrid) mempunyai genom yang berbeda dengan kedua tetua
sebelumnya. Jadi, persilangan (breeding) merupakan salah satu cara untuk merubah
genom suatu organisme.
Mungkin sebagian dari anda bisa melihat tanaman jagung hibrida. Berbagai
jagung hibrida telah diproduksi diberbagai wilayah negeri kita.Mungkin juga
sebagian dari anda dapat melihat tanaman anggrek yang bunganya berwarna-warni.
Sebagian dari tanaman anggrek tersebut merupakan hasil persilangan antar varietas

4
dalam satu spesies, atau hasil persilangan antar spesies, dan bahkan mungkin
merupakan hasil persilangan antar genus.
Dengan telah ditemukannya DNA sebagai bahan gen, manusiapun berupaya
untuk mendapatkan kombinasi sifat-sifat baru suatu makhluk hidup dengan cara
melakukan perubahan langsung pada DNA genomnya. Usaha untuk mengubah DNA
genom secara langsung ini disebut dengan istilah Rekayasa Genetika atau Genetic
Engineering. Dalam Upaya melakukan rekayasa, manusia menggunakan teknologi
DNA rekombinan.
Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metode yang
digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi. Teknik-teknik
tersebut meliputi :
1. Teknik untuk mengisolasi DNA.
2. Teknik untuk memotong DNA.
3. Teknik untuk menggabungkan atau menyambung DNA.
4. Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup.
Kumpulan teknik-teknik atau metode-metode yang telah dikembangkan oleh para
ilmuwan telah memungkinkan bagi kita untuk mengisolasi DNA dari berbagai
organisme, menggabungkan DNA yang berasal dari organisme yang berbeda
sehingga terbentuk kombinasi DNA (DNA Rekombinan), memasukkan DNA
rekombinan ke dalam sel organisme prokariot maupun eukariot hingga DNA
rekombianan tersebut dapat bereplikasi dan bahkan dapat diekspresikan.
Teknologi DNA rekombinan berdasarkan pada mekanisme yang terdapat pada
bakteri. Hasil Percobaan Lederbeg dan tatum (1946) menunjukkan bahwa bakteri
mempunyai mekanisme seksual. Mekanisme seksual pada bakteri ini menyebabkan
terbentuknya kombinasi gen-gen yang berasal dari dua sel yang berbeda. Mekanisme
seksual pada bakteri ini merupakan pertukaran DNA atau gen dari satu sel lainnya.
Jadi mekanisme seksual pada bakteri ini tidak bersifat reproduktif (tidak
menghasilkan anak atau zuriat).

5
B. Prinsip-prinsip Teknologi DNA Rekombinan
Dasar pemikiran yang melandasi rekayasa genetika adalah bahwa gen merupakan
segmen DNA yang mengendalikan proses metabolisme di dalam jasad hidup aliran
informasi genetik ini dari DNA ke mRNA dan kemudian ke protein. Dogma inilah
yang mendasari biologi modern dalam mengembangkan rekayasa.
Genetika sebagai titik sentral bioteknologi modern. Bioteknologi dikembangkan
untuk meningkatkan nilai tambah suatu bahan dengan memanfaatkan
mikroorganisme atau sel tumbuhan dan sel hewan. Contoh bioteknologi lama:
pembuatan tempe, tape, roti pengomposan sampah dll. Contoh bioteknologi modern:
produksi antibiotika, vaksin, monosodium glutamate, hormon insulin, zat warna
insektisida dll. Perkembangan bioteknologi sangat pesat dengan adanya rekayasa
genetika.
Misalnya dimensi baru pada perkembangan bioteknologi adalah perkembangan
bioteknologi molekuler, melibatkan teknik-teknik khusus untuk menciptakan
terobosan baru dalam peningkatan efisiensi dan ekonomi industri bioteknologi,
misalnya manipulasi DNA rekombinan dan kultur jaringan.
Rekayasa genetika merupakan salah satu usaha untuk memanipulasikan
pewarisan sifat suatu organisme. Teknik baru untuk memanipulasikan pewarisan
sifat adalah DNA rekombinan. Prinsip-prinsip DNA rekombinan meliputi:
1. Perangkat Teknologi DNA Rekombinan
Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah
perangkat-perangkat yang ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain adalah
enzim restriksi, enzim DNA ligase, Plasmid, transposon, pustaka genom, enzim
transkripsi balik, pelacak DNA/RNA.
a. Enzim Restriksi
Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA. Pada tahun 1960,
Werner Arber & Hamilton Smith menemukan enzim dari mikroba yang
dapat memotong DNA utas ganda. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan
nama enzim restriksi atau endonuklease restriksi. Enzim tersebut mengenal

6
dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang panjangnya 4 sampai
dengan 6 pasang basa.
Enzim tersebut sekarang dikenal dengan nama enzim restirksi atau enzim
endonuklease restriksi. Secara alami, bakteri menghasilkan enzim restriksi
untuk menghancurkan DNA fage yang menginfeksinya (yang masuk ke
dalam sel bakteri). Sampai saat ini sudah banyak jenis enzim restriksi yang
telah di temukan dan diisolasi dari berbagai spesies bakteri.
Nama setiap enzim restriksi diawali dengan tiga huruf yang menyatakan
nama bakteri yang menghasilkan enzim tersebut. Setiap enzim restriksi
mengenal sekuens dan situs pemotongan yang khas. Enzim restriksi
memotong DNA bukan pada sembarang tempat, tetapi memotong DNA pada
bagian tertentu. Bagian pada DNA yang dikenai aksi pemotongan oleh enzim
restriksi ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens pengenal adalah
urutan nukleutida (urutan basa) tertentu yang di kenal oleh enzim restriksi
sebagai tempat atau bagian yang akan dipotongnya.
Salah satu contoh enzim restriksi ini adalah enzim EcoRI yang telah
diisolasi pertama kali oleh Hobert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri
Escherichia coli. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan
basanya adalah GAATTC (sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC).
Di dalam sekuens pengenal tersebut, enzim EcoRI memotongnya tidak pada
sembarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan
A.
Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan
sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong
setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian antara G dan A. Sebagai
akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang
dihasilkan akan memilih ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang
dikenal dengan istilah sticky ends atau cohesive ends.
Pengklonaan gen dan rekayasa genetic mengandalkan penggunaan
enzim-enzim yang memotong molekul DNA pada lokasi yang spesifik dalam

7
jumlah terbatas. Enzim-enzim ini, disebut endonuklease restriksi, atau enzim
restriksi (restriction enzyme), ditemukan pada bakteri. Enzim restriksi
melindungi sel bakteri dengan cara memotong-motong DNA asing dari
organisme lain atau fag.
Ratusan enzim restriksi yang berbeda telah diidentifikasi dan diisolasi.
Setiap Enzim restriksi bersifat sangat spesifik, mengenali sekuens DNA
pendek tertentu, atau situs restriksi (retriction site), dan memotong kedua
untai DNA pada titik-titik yang sangat spesifik di dalam situs restriksi. DNA
sel bakteri dilindungi dari enzim restriksi sel itu sendiri oleh penambahan
gugus metal (-CH3) ke adenine atau sitosin di dalam sekuens yang dikenali
oleh enzim. Bagian gambar mengilustrasikan sebuah situs restriksi yang
dikenali oleh sejenis enzim restriksi tertentu dari E.coli. Seperti yang
ditunjukkan dalam contoh, kebanyakan situs restriksi bersifat simetris.
Dengan kata lain, enzim restriksi memotong-motong DNA dengan cara yang
dapat diulang kembali.
Enzim-enzim restriksi yang paling berguna akan memotong tulang
punggung gula fosfat dikedua untai DNA secara tidak merata, seperti yang
diindikasikan pada gambar. Fragmen restriksi berutai-ganda yang dihasilkan
setidaknya memiliki satu ujung beruntai-tunggal. disebut ujung lengket
(styky end). Penjuluran-penjuluran pendek ini dapat membentuk pasangan
basa berikatan hydrogen dengan ujung lengket yang komplementer pada
molekul DNA lain yang dipotong dengan enzim yang sama. Sambungan
yang terbentuk dengan cara ini hanyalah sementara, Namun dapat dibuat
permanen dengan enzim DNA ligase. Seperti yang telah dipelajari bahwa
enzim ini mengatalisis pembentukan ikatan-ikatan kovalen yang
menyambungkan tulang punggung gula-fosfat dari untai DNA. Misalnya,
DNA ligase menggabung-gabungkan fragmen-fragmen Okazaki saat
replikasi.Anda bisa melihat di bagian bawah gambar. Bahwa penggabungan
DNA yang dikatalisis oleh ligase dari dua sumber yang berbeda akan
menghasilkan molekul DNA rekombinan yang stabil.

8
 Gambar 2.1: Enzim Restriksi
b. Enzim Ligase
Enzim DNA ligase digunakan untuk menyambung DNA. Pada tahun
1972, David Jackson, Robert Simon, dan Paul Berg melaporkan bahwa
mereka berhasil membuat molekul DNA rekombinan. Mereka berhasil
menggabungkan fragmen-frgemen DNA dengan cara memasangkan (anneal)
ujung sticky ends dari satu fragmen dengan ujung sticky ends fragmen
lainnya, kemudian menyambungkan enzim DNA ligase. Keberhasilan
membuat DNA rekombinan ini terjadi tidak lama setelah enzim restriksi
ditemukan dan diisolasi pertama kali dari E-coli oleh Herbert Boyer yaitu
pada tahun 1969.
Di dalam sel fungsinya adalah untuk mereparasi tempat putusnya untai
tunggal diskontinuitas yang terjadi pada molekul DNA untai ganda yang
mungkin terjadi pada waktu replikasi DNA. Ligase DNA dari kebanyakan
organisme juga akan menyambungkan dua fragmen DNA untai ganda.

Gambar 2.2: Enzim Ligase

9
 Gambar 2.3: Mekanisme Efisiensi
Ligase

c. Plasmid
Plasmid digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen atau
mengklonkan fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri. Pada umunya
bakteri mempunyai satu kromosom. Kromosom bakteri berupa DNA sirkular
atau DNA yang berbentuk lingkaran. Di samping memiliki satu kromosom,
berbagai jenis bakteri juga memiliki DNA sirkular lainnya yang ukurannya
jauh lebih kecil dari pada DNA kromosomnya. DNA sirkular selain
kromosom yang terdapat pada bakteri dinamakan plasmid. Jadi, plamid
merupakan DNA bakteri yang terpisah dari kromosom bakteri. Plasmid dapat
bereplikasi sendiri. Plasmid juga mengandung berbagai gen. Jenis, jumlah
jenis, dan Jumlah tiap jenis (copy) plasmid bervariasi antar sel. Bahkan antar
sel dalam satu spesies bakteri.
Plasmid mulai digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen tidak
lama setelah David Jacksom, Robert Simon, dan Paul Berg berhasil membuat
molekul DNA rekombinan itu pada tahun 1972. Dalam hal ini, plasmid
dikombinasikan dengan DNA asing. Plasmid rekombinan yang pertma kali
berhasil berpelikasi di dalam sel bakteri adalah plasmid pSC101 yang telah
dikontruksi oleh Stanley Cohen DAN Herbert Boyer (SC=Stanley Cohen).

10
 Salah satu contoh plasmid yang telah lama digunakan sebagai vector
untuk mangklon gen adalah plasmid pBR322. Plasmid pBR322 ini
mengandung gen penyandi resistensi terhadap ampisilin dan tetrasiklin.
Adanya gen resistensi terhadap antibiotik yang didalamnya mengandung
situs enzim restriksi akan memberikan kemudahan dalam meyeleksi plasmid
rekombinan atau memudahkan dalam menyeleksi klon bakteri yang telah
membawa plasmid rekombinan. Akan lebih memudahkan lagi dengan adanya
enzim yang hanya memotong pada bagian gen resistensi terhadap antibiotic.
Misalnya, enzim PstI yang hanya akan memotong pBR322 pada bagian gen
resistensi terhadap empisilin (gen ampR).
Sekarang setelah mempelajari tentang enzim restriksi dan DNA ligase,
kita dapat mengamati secara lebih dekat mengenai bagaimana gen-gen
diklona dalam plasmid. Plasmid awal disebut vector pengklonaan (cloning
vector), yang didefinisikan sebagai molekul DNA yang dapat mengangkut
DNA asing ke dalama sel inang dan bereplikasi disitu. Plasmid bakteri
banyak digunakan sebagai vector pengklonaan karena beberepa alasan.
Plasmid semacam itu dapat diisolasi dari bakteri dengan mudah,
dimanipulasi sehingga membentuk plasmid rekombinan dengan penyisipan
DNA asing in vtro, dan kemudian di masukkan kembali ke dalam sel bakteri.
Terlebih lagi, plasmid bakteri rekombinan (beserta DNA asing yang
diangkut) memperbanyak diri dengan cepat berkat laju reproduksi sel inang
yang tinggi.
Dari beberapa pernagkat diatas (enzim restriksi, enzim DNA ligase, dan
plasmid), telah memungkinkan bagi kita untuk mengklonkan gen atau
fragmen DNA. Dalam hal ini, kita dapat membuat plasmid rekombinan
(plasmid yang mengandung fragmen DNA asing) di dalam tabung reaksi.
Bila dikombinasikan dengan salah satu cara bakteri memindahkan DNA,
Yaitu transformasi, kita dapat memasukkan plasmid rekombinan tersebut ke
dalam sel bakteri.
Karakteristik Plasmid meliputi:

11
 1. DNA untai ganda
2. Berbentuk Lingkaran
3. Bersalinan Tinggi
4. Berukuran Kecil (Mudah di manipulasi)
5. Dapat Bereplikasi sendiri di dalam sel
6. Dapat disisipi DNA asing (DNA sisipan)
7. Ada dua gen marker yaitu: untuk mendeteksi adanya vector dan untuk
mendeteksi adanya DNA sisipan.

Gambar 2.4:Peta Plasmid

d. Transposon
Transposon digunakan sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan
untuk menyisipkan penanda. Keberhasilan para ahli dalam melakukan
rekayasa genetika terhadap berbagai organisme tidak lepas dari peranan
transposon. Transposon atau elemen loncat mula-mula ditemukan oleh
Barbara McClintock. Untuk sampai pada penemuan tentang adanya
transposon.
Barbara McClintock mempelajari penyebab terjadinya variasi warna biji
jagung. Seperti yang pernah kalian pelajari sebelumnya bahwa biji jagung
terbentuk sebagai hasil dari pembuahan ganda (dua pembuahan). Satu

12
pembuahan menghasilkan zigot yang kemudian berkembang menjadi embrio
yang tersimpan dalam biji jagung. Satu pembuahan lainya menghasilkan
endosperma. Endosperma inilah yang kita lihat penampilannya (yang
nampak sebagai biji jagung).
Endosperma ini merupakan bagian terbesar dari biji dan merupakan
bagian penyimpan makanan. Endosperma inilah yang kita gunakan
kandungan karbohidratnya untuk makanan kita maupun makanan ternak.
Oleh karena itu endosperma ini awalnya berasal dari satu sel (sel triploid)
yang merupakan hasil peleburan antara satu inti sel sperma dengan dua inti
sel kutub) yang kemudian membelah secara mitosis. Oleh karena itu,
seharusnya endosperma tersebut merupakan kumpulan sel yang sama
sifatnya. Bila kumpulan sel endosperma warnanya sama maka setiap titik
pada permukaan setiap biji jagung itu warnanya sama atau seragam. Bila
berwarna putih maka seluruh permukaan biji jagung (endospermanya)
berwarna putih. Atau bila kuning, maka seluruh warna permukaan biji jagung
(endospermanya) berwarna kuning. Oleh karena itu, kalian dapat
menemukan di pasar atau di penjual sayur keliling, jagung yang setiap
bijinya berwarna kuning atau putih.
Barbara McClintock mempelajari mengapa ada biji jagung yang
warnanya tidak seragam sehingga nampak kuning dengan bercak-bercak
coklat. Pola bercaknya tidak teratur. Biji yang satu dengan biji lainnya juga
berbeda pola bercaknya. Dengan melakukan persilangan-persilangan antar
tanaman jagung yang berbeda warna bijinya, akhirnya Barbara McClintock
menemukan bahwa ketidak-seragaman atau variasi warna biji jagung
disebabkan oleh adanya bagian dari kromosom yang berpindah-pindah.
Bagian dari kromosom tersebut pindah dari satu tempat ketempat lain pada
kromosom yang sama atau pindah dari satu kromosom ke kromosom lainnya.
Bagian dari kromosom yang dapat berpindah tersebut dinamakan
transposon.

13
 Jadi transposon adalah DNA yang dengan sendirinya dapat berpindah-
pindah tempat atau berpindah posisinya. Transposon dapat berpindah-pindah
tempatnya pada satu molekul DNA atau pada satu kromosom. Transposon
juga dapat pindah dari satu molekul DNA ke molekul DNA lainnya atau
pindah dari satu kromosom ke kromosom lainnya. Karena memiliki
kemampuan untuk berpindah tempat dengan sendirinya maka sering kali
transposon disebut juga dengan nama elemen loncat.
Transposon dapat ditemukan pada berbagai jenis tanaman,cendawan, atau
bakteri. Jenis transposon bermacam-macam berdasarkan ukuran atau
panjangnya gen-gen yang dikandungnya dan cara berpindahnya.Transposon
yang paling sederhana hanya mengandung gen penyandi enzim transposon
(transposase). Enzim transposon ini dibutuhkan untuk melepaskan diri dari
tempat semula dan menyisip ke tempat yang lain. Transposon yang lebih
kompleks dapat mengandung satu atau beberapa gen tertentu misalnya gen-
gen penyandi resistensi terhadap antibiotik.
Bila transposon menyisip pada suatu gen tertentu maka gen tertentu
tersebut akan terganggu fungsinya. Oleh karena itu, transposon sering
digunakan oleh para peneliti untuk melakukan mutagenesis (melakukan
proses mutasi) sehingga dihasilkan mutan. Misalnya untuk mempelajari gen
yang menyebabkan warna hijau, seorang peneliti dapat menggunakan
transposon untuk mendapatkan mutan yang tidak berwarna hijau. Mutan
menjadi tidak hijau karena gen penentu warna hijau disisipi oleh transposon.
Dengan melacak posisi dimana transposon berada maka peneliti tersebut
dapat mempelajari gen yang menentukan warna hijau karena gen tersebut
telah disisipi transposon (gen warna hijau bersatu bersama transposon).
Transposon juga dapat digunakan untuk menandai suatu sel. Transposon
yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik sering digunakan oleh para
peneliti sebagai penanda. Kita dapat menandai suatu strain bakteri dengan
menyisipkan gen resistensi terhadap suatu antibiotik. Untuk menyisipkan gen
resistensi terhadap antibiotik, kita dapat menggunakan trasposon. Misalnya,

14
kita dapat menandai strain bakteri-B dengan menggunakan gen transposon
Tn5-kanR (transposon Tn5 yang mengandung gen kanR. Gen kanR
menyandikan ressistensi terhadap antibiotik kanamisin). Kita dapat
menggunakan Tn5-kanR untuk menandai agar bakteri-B menjadi resistensi
terhadap kanamisin. Bila Tn5 masuk ke dalam sel bakteri-B maka Tn5
beserta gen kanR yang dikandungnya akan menyisip ke dalam DNA
(kromosom) bakteri-B. Dengan demikian bakteri-B yang semula tidak tahan
terhadap kanamisin, setelah disisipkan Tn5 menjadi tahan terhadap
kanamisin. Selanjutnya bakteri-B yang sudah ditandai tersebut tercampur
dengan sel bakteri lainnya, maka kita masih dapat memilihnya atau
menyeleksinya yaitu mengguanakan media yang mengandung kanamisin.
Dalam hal ini, bakteri lain tidak tumbuh, sedangkan bakteri-B (yang
sudah ditandai) dapat tumbuh pada media dengan antibiotik kanamisin
tersebut. Transposon dapat digunakan untuk menandai sel, menandai suatu
gen, melacak keberadaan suatu gen, menemukan letak suatu gen di dalam
kromosom. Jadi transposon merupakan salah satu perangkat di dalam
teknologi DNA rekombinan.

Gambar 2.5: Tronposon

15
e. Pustaka Genom
Pustaka Genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen DNA
yang telah diklonkan. Salah satu cara yang digunakan untuk mempelajari
genom suatu organisme adalah dengan menggunakan pendekatan Shot-Gun.
Dengan pendekatan ini, DNA total dipotong menggunakan enzim restriksi.
Oleh karena itu, jumlah potongannya sangat banyak maka sangatlah sulit
untuk mempelajari setiap potongan dalam waktu bersamaan. Oleh karena itu,
potongan-potongan tersebut perlu untuk disimpan lebih dulu sebelum
mendapatkan gilirannya untuk dipelajari. Untuk menyimpan potongan
fragmen DNA genom digunakan Pustaka Genom. Pustaka genom merupakan
koleksi berbagai klon bakteri yang berisi plasmid rekombinan maupun
koleksi klon fage berbagai klon bakteri yang berisi plasmid rekombinan
maupun koleksi klon fage yang mengandung DNA rekombinan.
Di dalam pustaka genom ini, setiap plasmid rekombinan atau setiap DNA
fage rekombinan membawa salah satu potongan atau fragmen DNA genom
yang dipelajari. Setiap klon bakteri membawa satu plasmid rekombinan
sedangkan setiap klon fage membawa satu DNA fage rekombinan.
Kumpulan klon-klon bakteri yang membawa plasmid rekombinan dinamakan
Pustaka Plasmid, sedangkan kumpulan fage rekombinan dinamakan Pustaka
Fage. Jadi pustaka genom dapat berupa Pustaka Plasmid dan atau Pustaka
Fage.

Gambar 2.6 : Pustaka Genom

16
f. Enzim transkripsi-balik digunakan untuk membuat DNA berdasarkan
RNA.
Tidak lama setelah penemuan enzim restriksi, Howard Temin dan David
Baltimore secara terpisah pada tahun 1970 menemukan enzim transkripsi-
balik (reverse-trancriptase) yang digunakan oleh retrovirus untuk membuat
copy DNA berdasarkan RNA-nya. Enzim transkripsi-balik cDNA
(complementary DNA) dengan menggunakan RNA sebagai cetakannya.
Dengan demikian gen atau bagian dari gen dapat disintesis berdasarkan
mRNA. Proses sintesis DNA dengan cara ini merupakan kebalikan dari pada
proses transkripsi. Oleh karena itu dinamakan transkripsi-balik.
Saat ini, enzim transkriptase-balik sudah diproduksi secara komersial.
Ketersediaan enzim transkriptase-balik ini telah memberikan kemudahan
bagi para peneliti untuk mempelajari gen yang bertanggung jawab terhadap
sifat-sifat tertentu. Tanpa enzim transkriptase-balik, pekerjaan mencari gen
umumnya dimulai dari mengisolasi DNA total genom, kemudian memotong-
motongnya menjadi ratusan ribu potongan yang kemudian diteruskan dengan
mempelajari setiap potongan. Cara ini tentu saja membutuhkan lebih banyak
tenaga dan memakan waktu yang lebih lama. Dengan ketersediaan enzim
traskriptase-balik, pekerjaan mencari gen tidak lagi harus dimulai dengan
mengisolasi DNA genom total tetapi dimulai dengan mengisolasi mRNA.
Tahapan utama dalam pembuatan DNA menggunakan transkriptase-balik
ini adalah sebagai berikut :
1) DNA gen eukariot terdiri atas intron dan exon, pada waktu
transkripsi semua bagian tersebut diterjemahkan oleh enzim
transkriptase menjadi RNA.
2) Dalam proses pasca-transkripsi, intron dibuang sehingga mRNA
tidak lagi mengandung intron.
3) Bila kita berhasil mengisolasi mRNA dari sel, maka kita dapat
membuat DNA gen yaitu dengan menambahkan enzim transkriptase-
balik.

17
 4) Enzim transkriptase-balik mensintesis DNA dengan menggunakan
mRNA tersebut sebagai cetakannya. Hasilnya berupa DNA utas
tunggal.
5) Setelah dihasilkan DNA utas tunggal, DNA polimerase akan
mensintesis utas DNA pasangannya sehingga dihasilkan gen yang
berupa DNA utas ganda. DNA gen hasil dari transkripsi-balik ini
tidak mengandung intron.

Gambar 2.7: Enzim Transkripsi -Balik

g. Pelacak DNA/RNA
Pelacak DNA/RNA digunakan untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA
yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar. Edwin M
Shouthern, pada tahun 1975, telah mempublikasikan prosedur untuk
mendeteksi fragmen DNA yang spesifik. Prosedur ini dikenal dengan nama
teknik Shouthern blotting. Pelacak atau probe yang digunakan untuk
mengidentifikasi fragmen DNA yang spesifik tersebut merupakan asam
nukleat pendek, bertuas tunggal (RNA atau DNA berutas tunggal) dan diberi

18
label radioaktif atau non radioaktif. Bila dicampurkan dengan fragmen-
fragmen DNA, rangkaian basa yang ada pada probe tersebut akan
berpasangan dengan rangkain basa komplementer yang ada pada fragmen
DNA. Dengan kata lain, bahwa fragmen DNA yang akan tertempeli probe
adalah fragmen DNA yang mengandung urutan basa yang komplementer
dengan urutan basa pada probe.
Dengan teknik ini, gen tertentu dapat mengisolasi dari campuran fragmen
DNA yang kompleks. Langkah awalnya adalah memisahkan fragmen-
fragmen DNA dengan cara elektroforesis pada gel agarosa. Fragmen DNA
yang telah terpisah di dalam gel agarose, selanjutnya didenaturasi (dibuat
menjadi utas tunggal). Fragmen-fragmen DNA tersebut kemudian ditransfer
pada filter nitroselulosa atau membran nilon sehingga setiap fragmen DNA
menempel kuat pada membran dan posisinya yang sama dengan posisi pada
gel agarosa. Kemudian membran atau filter direndam dalam cairan yang
mengandung probe. Bila probe-nya adalah probe radioaktif, filter
selanjutnya ditempelkan atau diekspose pada lembaran film X-ray untuk
mengetahui posisi fragmen yang tertempeli probe pada filter atau membran.
Probe non-radioaktif juga telah cukup dikembangkan. Probe dapat dikaitkan
dengan enzim, misalnya peroksidase sehingga menjadi probe-enzim.
Deteksinya dapat dilakukan dengan menggunakan substrat
chemiluminescent yang signalnya ditangkap oleh lembaran film X-ray.
Probe juga dapat dikaitkan dengan vitamin misalnya biotin,sedangkan
deteksinya menggunakan enzim misalnya alkalin phosphatase. Signalnya
akan nampak langsung pada filter atau membran berupa pita-pita yang
berwarna biru/ungu bila pita-pita tersebut merupakan fragmen DNA yang
berikatan dengan probe.
Dengan prinsip yang sama yaitu perpasangan basa-basa probe dengan
basa-basa DNA target yang komplementer, probe asam nukleat ini juga dapat
digunakan untuk mendeteksi klon yang benar. Klon DNA ( gen atau fragmen
DNA) dapat dibuat melalui pembuatan plasmid rekombinan di dalam tabung

19
 reaksi (mencampurkan plasmid asal dan fragmen DNA). Kemungkinan yang
dapat ditemui di dalam tabung reaksi tersebut adalah plasmid tanpa
mengandung fragmen DNA (plasmid asal) dan plasmid rekombinan (plasmid
yang mengandung fragmen DNA).
2. Bakteri Klon
Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga
cara konjugasi, transformasi, dan transduksi. DNA yang masuk ke dalam sel
bakteri selanjutnya dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri
sehingga terbentuk kromosom rekombinan.
a. Konjugasi
Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke
dalam sel bakteri lainnya sel (resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel.
Sel donor (sel jantan) memasukkan sebagian DNAnya kedalam sel resipien
(sel betina). Transfer DNA ini melalui pili seks yang dimiliki oleh sel jantan.
Sel betina tidak memiliki pili seks. DNA dari sel jantan berpindah ke dalam
sel betina secara replikatif. Oleh karena itu, setelah proses konjugasi selesai,
sel jantan tidak kehilangan DNA. Setelah konjugasi selesai kedua sel berpisah
kembali dan jumlah sel tidak bertambah (setelah konjugasi tidak dihasilkan
anak sel). Oleh karena itu, proses konjugasi ini disebut juga sebagai proses
atau mekanisme seksual yang tidak reproduktif.

Gambar 2.8: Konjugasi

20
b. Transformasi
Transformasi, merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan
di sekelilingnya. DNA yang berada disekitar bakteri (DNA asing) dapat
berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel bekteri
lainnya atau dari organisme lainnya. Masuknya DNA dari lingkungan
kedalam sel bakteri ini dapat terjadi secara alami. Fenomena transformasi ini
telah diamati oleh Griffith (1928) dan kelompok Avery (1944).Griffith (1928)
telah menemukan bahwa starin bakteri yang tidak virulen (starin yang
penampilan koloninya kasar) dapat berubah sifatnya menjadi strain yang
virulen (penampilan koloninya halus). Perubahan sifat ini disebabkan sel-sel
bakteri strain virulen (strain halus) yang telah dimatikan.
Very, McCleod, dan McCarty (1944) menemukan bahwa perubahan sifat
atau transformasi dari bakteri kasar menjadi bakteri halus atau perubahan dari
tidak virulen menjadi virulen tersebut disebabkan oleh adanya DNA dari sel
bakteri halus yang masuk ke dalam sel bakteri kasar.
Berdasarkan pada mekanisme transformasi alami ini, kita dapat melakukan
transformasi bakteri secara buatan. Dengan perlakuan tertentu, kita dapat
memasukkan potongan DNA ke dalam sel bakteri. Prinsipnya sederhana yaitu
mencampurkan sel-sel bakteri hidup dengan potongan DNA tertentu di dalam
tabung reaksi. Beberapa waktu kemudian kita dapat menyeleksi sel-sel bakteri
yang sudah mengandung potongan DNA tertentu tersebut.

Gambar 2.9: Transforming

21
c. Transduksi
Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya
melalui perantaraan fage. Beberapa jenis virus berkembang biak di dalam sel
bakteri. Virus-virus yang inangnya adalah bakteri seringkali di sebut
bakteriofage atau fage. Pada waktu fage menginfeksi bakteri, fage
memasukkan DNA-nya ke dalam bakteri. DNA fage ini kemudian bereplikasi
di dalam sel bakteri atau berintegrasi dengan kromosom bakteri (ingat siklus
hidup fage:siklus litik dan siklus lisogenik). Pada waktu DNA fage dikemas di
dalam pembungkusnya untuk membentuk partikel fage-fage baru. DNA fage
tersebut dapat membawa sebagian dari DNA bakteri lainnya, maka fage akan
memasukkan DNA-nya yang mengandung sebagian dari DNA bakteri
inangnya yang sebelumya. Dengan demikian, fage tidak hanya juga
memasukkan DNA dari sel bakteri lainnya yang ikut terbawa pada DNA fage.
Jadi, secara alami fage memindahkan DNA dari satu sel bakteri ke sel bakteri
lainnya.

Gambar 2.10: Transduksi

22
C. Tahapan DNA Rekombinan
Tahapan dalam mengklonkan gen meliputi: Isolasi DNA,pemotongan plasmid,
menyisipkan gen atau fragmenDNA, memasukkan DNA kedalam sel bakteri
(transformasi), seleksi klon bakteri yang benar yaitu bakteri yang mengandung
plasmid rekombinan.
1. Isolasi DNA
Isolasi DNA diawali dengan melakukan perusakan serta penghilangan dinding
sel. Dalam proses ini dapat dilakukan secara mekanis ataupun dengan cara
enzimatis. Setelah perusakan sel telah dilakukan, langkah selanjutnya adalah
pelisisan sel hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan buffer nonosmotik,
serta deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat
(SDS). Remukan sel yang diakibatkan oleh lisisnya sel dibuang dengan
melakukan sentrifugasi sehingga bisa dibedakan antara bagian yang rusak serta
organel target.
Yang pada akhirnya didapatkan DNA yang nantinya dilakukan pemurnian
dengan penambahan amonium asetat dan alkohol. Teknik isolasi DNA ini dapat
diaplikasikan untuk DNA genomiK maupun DNA vektor, khususnya plasmid.
Plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau
dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular sedangkan DNA
kromosom ikatan antara kedua untaiannya lebih longgar.
Hal ini akan menyebabkan DNA plasmid lebih rentan terhadap terjadinya
denaturasi protein apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Tahap kedua
dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun
plasmid. Perkembangan teknik pemotongan DNA berawal dari saat
ditemukannya sistem restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli, yang
berkaitan dengan infeksi virus atau bakteriofag lambda. Virus l digunakan untuk
menginfeksi dua strain E. coli, yakni strain K dan C. Jika l yang telah
menginfeksi strain C diisolasi dari strain tersebut dan kemudian digunakan untuk
mereinfeksi strain C, maka akan diperoleh l progeni (keturunan) yang lebih
kurang sama banyaknya dengan jumlah yang diperoleh dari infeksi pertama.

23
Dalam hal ini, dikatakan bahwa efficiency of plating (EOP) dari strain C ke strain
C adalah 1. Namun, jika l yang diisolasi dari strain C digunakan untuk
menginfeksi strain K, maka nilai EOP-nya hanya 10-4. Artinya, hanya ditemukan
l progeni sebanyak 1/10.000 kali jumlah yang diinfeksikan. Sementara itu, l yang
diisolasi dari strain K mempunyai nilai EOP sebesar 1, baik ketika direinfeksikan
pada strain K maupun pada strain C. Hal ini terjadi karena adanya sistem
restriksi/modifikasi (r/m) pada strain K.
2. Pemotongan Plasmid
Selanjutnya adalah pemotongan DNA dengan menggunakan enzim restriksi
endonuklease. Pemutusan ini dilakukan di dalam strain tertentu yang bertujuan
untuk mencegah agar tidak merusak DNA. Selain itu strain tersebut juga
mempunyai suatu sistem modifikasi yang menyebabkan pemutusan basa pada
urutan tertentu yang merupakan recognition sites bagi enzim restriksi tersebut.
Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor dengan menggunakan enzim
restriksi ini harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel dalam
arti setiap fragmen DNAnya harus dapat disambungkan dengan DNA vektor
yang sudah berbentuk linier.
Pada tahap pemotongan plasmid biasanya jenis plasmid yang digunakan yaitu.
Plasmid pBR322. Pertama Plasmid di potong di dalam tabung reaksi
menggunakan enzim restriksi PstI maka pBR322 akan terpotong atau terbuka
pada bagian gen ampR. Kedua menyisipkan gen atau fragmen DNA. Bila pBR322
yang sudah terbuka lingkarannya di campur dengan potongan DNA asing dan
kemudian ditambahkan enzim DNA ligase, maka kemungkinan hasilnya adalah
berupa campuran yang berisi:
a. Plasmid pBR322 yang tersambung kembali atau membentuk lingkaran
lagi seperti semula.
b. Plasmid rekombinan yaitu pBR322 yang telah disisipi oleh DNA asing.
Gambar plasmid pbr322

24
 Gambar 2.11 : Plasmid PBR322
3. Memasukkan DNA
Tahap penyambungan DNA terdapat beberapa cara, yaitu penyambungan
dengan menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri, penyambungan dengan
menggunakan DNA ligase dari sel E. coli yang telah diinfeksi dengan
bakteriofag T4 atau sering disebut dengan enzim T4 ligase. Serta dengan
pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal
homopolimerik 3. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh ujung
lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase.
Aktivitas enzim ini berada pada suhu 37 C. Namun, proses penyambungan biasa
dilakukan pada suhu 4 dan 15C.
Pada bakteri memasukkan DNA kedalam sel, kedua bentuk plasmid kemudian
dicampurkan dengan kumpulan sel-sel bakteri hidup yang tidak mempunyai
plasmid. Kemungkinan hasilnya berupa campuran yang berisi:
a. Sel bakteri yang mendapatkan plasmid pBR322 tanpa sisipan
b. Sel yang mendapatkan plasmid rekombinan (pBR322 yang telah disisipi
DNA asing)
c. Sel bakteri yang tidak mengandung (tidak dimasuki) plasmid.

25
4. Analisa Terhadap Hasil Pemotongan DNA.
Tahap berikutnya adalah analisa terhadap hasil pemotongan DNA genomik
dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA dengan
menggunakan teknik elektroforesis. Hasil dari penyambungan ini dimasukkan ke
dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dalam hal ini pada
campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada
sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu
sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini
dinamakan transformasi. Sehingga diharapkan sel inang mengalami perubahan
sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.
5. Seleksi Klon Bakteri
Seleksi klon bakteri yang benar yaitu bakteri yang mengandung plasmid
rekombinan. Dalam contoh ini, seleksi dilakukan dengan menggunakan media
tumbuh bakteri yang mengandung antibiotik. Sel yang tidak mengandung
ampisilin maupun tetrasiklin. Sel bakteri yang mengandung plasmid tanpa sisipan
(pBR322 semula) tumbuh pada media yang mengandung tetrasiklin tetapi tidak
tumbuh pada media yang mengandung ampisilin karena gen ampR disisipi DNA
asing sehingga tidak berfungsi.
Dalam teknis pelaksanaannya, cairan suspensi dalam pekerjaan tranformasi
(campuran antara bakteri, plasmid, dan DNA asing yang telah diperlakukan dalam
rangka transformasi) disebarkan pada media yang mengandung tetrasiklin. Koloni
bakteri yang tumbuh adalah koloni Sel 1 dan koloni Sel 2 (koloni adalah
sekumpulan sel yang sama yang semula berasal dari satu sel). Sel bakteri yang
tidak mengandung plasmid tidak mampu tumbuh. Masing-masing koloni yang
tumbuh pada media+tetrasiklin kemudian dipindahkan pada media+ampisilin
adalah koloni yang diinginkan (sel-sel bakterinya mengandung plasmid
rekombinan).
Contoh plasmid lainnya yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk
mengklonkan gen adalah plasmid pUC118 dan pUC119. Plasmid ini merupakan
pengembangan dari pBR322. Plasmid pUC118 dan pUC119 mengandung gen

26
lacZ yang menyandikan enzim b-galactosidase. Pada lacZ terdapat daerah yang
disebut daerah polikloning.
Pada daerah polikloning ini terdapat banyak situs restriksi dari berbagai enzim
restriksi. Dalam hal ini, kita dapat menggunakan berbagai enzim restriksi untuk
memotong pUC118 atau pUC119 pada bagian lacZ. Dengan demikian kita dapat
menyisipkan DNA asing pada bagian lacZ. Bila gen lacZ disisipi oleh DNA asing
maka gen lacZ tersebut tidak berfungsi (tidak menghasilkan -galactosidase). Bila
kita menggunakan pUC118 atau pUC119 sebagai plasmid vektor, maka koloni
yang membawa plasmid rekombinan dapat di deteksi dengan menggunakan Xgal
(5-bromo-4-chloro-indolyl--D-galactosida). Enzim -galactosidase akan
memecah Xgal menjadi galaktosa dan 5-bromo-4-chloroindigo berwarna biru.
Koloni bakteri yang mengandung plasmid pUC118 atau pUC119 akan
berwarna biru bila ditumbuhkan pada media yang mengandung Xgal. Hal ini
karena 1 bakteri meghasilkan enzim -galactosidase. Oleh karena medianya,
mengandung Xgal maka enzim -galactosidase memecahkan Xgal sehingga
dihasilkan 5-bromo-4-chloroindigo berwarna biru. Koloni bakteri akan berwarna
putih bila pUC118 atau pUC119 telah disisipi DNA asing pada bagian lacZ.
Dalam hal ini sel bakteri tidak menghasilkan enzim -galactosidase karena gen
lacZ tidak berfungsi karena disisipi DNA asing.

Gambar 2.12:Seleksi Transformen

27
Gambar 2.13: Teknologi DNA Rekombinan (Kloning Gen)

Gambar 2.14:Teknik DNA Rekombinan

28
D. Memperbanyak DNA Secara in Vintro: Reaksi Berantai Polimerase (PCR)
Pengklonaan DNA dalam sel tetap merupakan metode terbaik untuk
mempersiapkan gen tertentu atau sekuens DNA lain dalam kuantitas besar. Akan
tetapi, ketika sumber DNA hanya sedikit atau tidak murni,reaksi berantai polimerase
atau polymerase chain reaction (PCR) lebih cepat dan lebih selektif. Dalam teknik
ini,segmen sasaran spesifik apa pun di dalam satu atau banyak molekul DNA dapat
dengan cepat diamplifikasi (diperbanyak atau disalin berkali-kali) dalam tabung
reaksi. Dengan otomatisasi, PCR dapat membuat miliaran salinan segmen sasaran
DNA dalam beberapa jam, jelas jauh lebih cepat daripada waktu berhari-hari yang
dibutuhkan untuk memperoleh jumlah salinan yang sama dengan menapis pustaka
DNA untuk menemukan klona dengan gen yang dikehendaki dan membiarkan gen itu
bereplikasi di dalam sel inang. Bahkan PCR semakin banyak digunakan untuk
membuat cukup banyak fragmen DNA spesifik yang disisipkan secara langsung ke
dalam vektor, sepenuhnya melewatkan langkah-langkah pembuatan dan penapisan
pustaka. Untuk meneruskan analogi sastrawi kita, PCR bagaikan menfotokopi satu
halaman saja, bukan memeriksa semua buku dalam perpustakaan.
Dalam prosedur PCR, sebuah siklus berlangkah tiga menjalankan reaksi berantai
yang menghasilkan populasi molekul-molekul DNA identik yang bertumbuh secara
eksponensial. Pada setiap siklus, campuran reaksi dipanaskan untuk mendenaturasi
(memisahkan) untai-untai DNA dan kemudian didinginkan agar terjadi penempelan
(annealing, pembentukan ikatan hidrogen) primer DNA pendek beruntai tunggal
yang komplementer dengan sekuens-sekuens di untai yang satu lagi pada setiap ujung
sekuens sasaran. Akhirnya, DNA polimerase yang tahan panas memperpanjang
primer-primer dengan arah 5 3. Jika DNA polimerase standar digunakan, protein
akan terdenaturasi bersama dengan DNA selama langkah pemanasan pertama dan
terpaksa harus digantikan setelah masing-masing siklus. Kunci dari otomatisasi PCR
berupa temuan DNA polimerase tak lazim yang tahan panas, yang pertama kali hidup
di mata air panas, yang dapat menahan panas pada awal setiap siklus. Perhatikan
gambar yang mengilustrasikan langkah-langkah PCR.

29
 Yang sama-sama mengesankan dengan kecepatan PCR adalah spesifitasnya.
Hanya sedikit sekali DNA yang diperlukan sebagai materi awal, dan DNA ini bisa
saja berada dalam kondisi terdegradasi sebagian, asalkan ada sedikit molekul yang
mengandung sekuens sasaran yang lengkap. Kunci spesifikasi yang luar biasa ini
adalah primer, yang berikatan hidrogen hanya dengan sekuens-sekuens di ujung-
ujung yang berlawanan dari segmen sasaran. (Agar memiliki kespesifikan yang
tinggi, panjang primer setidaknya harus 15 asam nukleotida). Pada ujung siklus
ketiga, seperempat molekul yang ada identik dengan segmen sasaran, dengan kedua
untai memiliki panjang yang sesuai. Seiring setiap siklus yang berturutan, jumlah
molekul segmen sasaran dengan panjang yang sesuai akan berlipat dua dan segera
mengalahkan jumlah semua molekul-molekul DNA lain dalam reaksi. Terlepas dari
kecepatan dan kespesifikannya, amplifikasi PCR tidak dapat menggantikan
pengklonaan gen dalam sel-sel jika kita membutuhkan banyak sekali gen. Kesalahan-
kesalahan yang terkadang terjadi selama replikasi PCR membatasi jumlah salinan-
salinan yang kondisinya bagus yang dapat dibuat dengan metode ini. Ketika PCR
dimanfaatkan untuk menyediakan fragmen DNA spesifik bagi pengklonaan, klona-
klona yang dihasilkan disekuensing untuk memilih klona-klona dengan sisipan yang
bebas kesalahan.
PCR, dirancang pada 1985, telah berdampak besar terhadap penelitian Biologi
dan Bioteknologi. PCR telah digunakan untuk mengamplifikasi DNA dari banyak
sekali ragam sumber: fragmen DNA purba dari marmot berbulu yang berusia 40.000
tahun: DNA dari sidik jari atau sepercik darah, jaringan, atau semen yang ditemukan
di TKP : DNA dari sel-sel embrio tunggal untuk diagnosis prenatal terhadap berbagai
kelainan genetik: dan DNA gen-gen virus dari sel-sel yang terinfeksi virus yang sukar
dideteksi, misalnya HIV.

30
 Gambar 2.15: Memperbanyak DNA Secara
in Vintro: Reaksi Berantai Polimerase
(PCR)

E. Elektroforesis Gel
Banyak pendekatan yang digunakan untuk mempelajari molekul-molekul DNA
melibatkan elektroforesis gel (gel electrophoresis). Teknik ini menggunakan gel dari
polimer, misalnya polisakarida. Gel bekerja sebagai penapis molekular untuk
memisahkan asam nukleat atau protein berdasarkan ukuran,muatan listrik, dan sifat-
sifat fisik lain. Karena mengandung muatan negatif dalam gugus-gugus fosfatnya,
molekul asam nukleat bergerak ke arah kutub positif dalam medan listrik. Saat
bergerak, kisi-kisi serat polimer menjadikan molekul panjang lebih sulit bergerak
daripada molekul pendek, sehingga molekul-molekul terpisah berdasarkan panjang.

31
Dengan demikian, elektroforesis gel memisahkan pita-pita, yang masing-masing
terdiri atas molekul-molekul DNA yang panjangnya sama.
Satu lagi aplikasi yang bermanfaat dari teknik ini adalah analisis fragmen restriksi
(restriction fragment analysis), yang dapat dengan cepat menyediakan informasi
berguna tentang sekuens DNA. Dalam tipe analisis ini, fragmen DNA yang
dihasilkan melalui digesti molekul DNA oleh enzim restriksi (pemotongan) dipilah-
pilah dengan elektroforesis gel. Ketika campuran fragmen restriksi menjalani
elektroforesis, campuran itu menghasilkan pola pita yang khas untuk molekul awal
dan enzim restriksi yang digunakan. Bahkan, molekul DNA virus dan plasmid yang
relatif kecil dapat diidentifikasi hanya berdasarkan pola fragmen restriksi. Karena
DNA hanya dapat diambil kembali tanpa kerusakan dari gel, prosedur ini juga
memberi jalan untuk menyiapkan sampel murni dari fragmen individual jika pita-pita
DNA dapat dipisahkan dengan jelas. (Molekul DNA yang sangat besar, misalnya
DNA kromosom eukariotik, menghasilkan sedemikan banyak fragmen sehingga
tampak seperti sumiran, bukan pita-pita yang terpisah).
Analisis fragmen RNA juga berguna untuk membandingkan dua molekul molekul
DNA yang berbeda-misalnya, dua alel dari sebuah gen. Enzim restriksi mengenali
sekuens nukleotida spesifik dan perubahan sepasang basa sekali pun dalam sekuens
itu akan mencegah enzim memotong pada situs tertentu. Oleh karena itu, jika
perbedaan nukleotida antara kedua alel terjadi dalam situs restriksi. Digesti dengan
enzim yang berbeda berupa fragmen-fragmen dari masing-masing alel. Setiap
campuran akan menghasilkan pola pita sendiri dalam elektroforesis gel. Misalnya,
penyakit sel sabit disebabkan oleh mutasi satu nukleotida tunggal yang terletak di
dalam sebuah sekuens restriksi pada gen -globin.
Materi awal, sampel alel -globin yang telah diklona dan dipurifikasi. Namun apa
yang bisa kita lakukan jika tidak memiliki alel-alel murni sebagai materi awal?.
Anggaplah kita ingin menentukan apakah seseorang merupakan pembawa sifat
heterozigot untuk alel muatan penyebab penyakit sel sabit. Dalam contoh ini, kita
akan membandingkan secara langsung genom DNA dari orang itu dengan DNA dari
seseorang yang mengidap penyakit sel sabit ( dan homozigot untuk kedua alel mutan)

32
dan telah disinggung , elektroforesis DNA genom yang di digesti dengan enzim
restriksi serta diwarnai dengan pewarna pengikat DNA menghasilkan terlalu banyak
pita sehingga tidak bisa dikenali satu per satu. Akan tetapi, metode yang disebut
Southern blotting (dikembangkan oleh ahli biokimia Inggris, Edwin Southern), yang
mengombinasikan elektroforesis gel dan hibridisasi asam nukleat, memungkinkan
kita mendeteksi hanya pita-pita yang mengandung bagian-bagian gen -globin.
Prinsip Shouthern blotting sama dengan hibridisasi asam nukleat untuk menapis
klona bakteri. Dalam Southern blotting, luar biasanya merupakan molekul DNA
radioaktif beruntai-tunggal yang komplementer dengan gen yang dikehendaki.
Gambar berikut akan menjabarkan garis besar dari seluruh prosedur tersebut dan
mencontohkan bagaimana Southern blottingdapat membedakan heterozigot (dalam
contoh ini, heterozigot alel sel sabit) dan orang yang homozigot untuk alel normal.
Identifikasi pembawa alel mutan yang berkaitan dengan kelainan genetik
hanyalah satu dari banyak kegunaan Southern blotting. Bahkan, teknik ini telah
digunakan di laboratorium selama bertahun-tahun. Akan tetapi, belakangan ini
Southern blotting telah digantikan oleh metode-metode yang lebih cepat, seringkali
melibatkan amplifikasi PCR dari bagian-bagian genom yang spesifik yang mungkin
berbeda.

Gambar 2.16: Elekroforesis Gel

33
F. Sekuensing DNA
Begitu gen diklona, sekuens nukleotida lengkapnya dapat ditentukan. Kini,
sekuensing berlangsung secara otomatis, dilaksanakan oleh mesin sekuensing.
Prosedur yang otomatis itu didasarkan pada teknik yang disebut metode terminasi
rantai dideuksiribonukleatida (atau disingkat dideuksi). Metode ini dikembangkan
oleh ahli biokimia Inggris, Fredrick Sanger, yang menerima Hadiah Nobel tahun
1980 larena pencapaiannya. (Sanger adalah satu dari empat orang yang
memenangkan dua hadiah Nobel. Ia juga menerima hadiah ini pada 1975 atas
keberhasilannya menentukan sekuens asam insulin.
Dengan mengetahui sekuens dari sebuah gen, para peneliti dapat membandingkan
gen itu secara langsung dengan gen-gen dalam spesies lain, dengan fungsi produk gen
yang mungkin telah diketahui. Jika dua gen dari spesies yang berbeda memiliki
sekuens yang cukup mirip, masuk akal untuk menanggap bahwa produk-produk
gennya melaksanakan fungsi yang serupa. Dengan cara ini, perbandingan sekuens
memberikan petunjuk tentang fungsi gen, topik yang akan segera dibahas.
Seperangkat petunjuk lain diperoleh dari pendekatan percobaan yang menganalisis
kapan dan dimana gen diekspresikan.

Gambar 2.17:Hasil Penentuan Urutan Nukleutida

DNA sisipan (DNA Sequencing)

34
 Gambar 2.18: Hasil Sekuensing

G. Manfaat dan Dampak Teknologi DNA Rekombinan

1. Manfaat Teknologi DNA Rekombinan
Teknologi DNA rekombinan telah memberikan banyak manfaat bagi
perkembangan ilmu pengetahuan maupun bagi kehidupan manusia sehari-sehari.
Beberapa jenis obat-obatan, vaksin, bahan pangan dan lainnya telah diproduksi
dengan memanfaatkan teknologi DNA rekombinan.
Dalam kehidupan kita sehari-hari, secara langsung maupun tidak langsung,
sebagian dari kita pernah berhubungan dengan hasil penggunaan teknologi DNA
Rekombinan. Contoh :Insulin telah digunakan untuk mengobati penyakit Diabetes
militus. Penyakit diabetes pada manusia diobati dengan insulin manusia.
Bagaimanakah kita dapat memperoleh insulin manusia ini? Apakah untuk
mengobati orang yang sakit diabetes ini kita harus mengorbankan orang yang
sehat untuk diekstrak insulinnya? Tentu saja tidak. Saat ini insulin manusia telah
berhasil diproduksi secara masal dengan menggunakan bakteri. Kemampuan
bakteri untuk memproduksi insulin manusia ini adalah karena manusia telah

35
berhasil memasukkan dan mengintegrasikan gen yang menjadikan insulin
manusia ke dalam genom bakteri.
Contoh lainnya adalah kapas transgenik. Kapas transgenik pernah ramai
dibicarakan dimedia masa kita pada awal abad 21 ini. Salah satu kapas transgenik
adalah kapas-bt. Tanaman kapas-bt telah mengandung gen penyandi toksin yang
berasal dari bakteri Bacillus turingiensis (Bt). Toksin tersebut dapat membunuh
hama kapas sehingga kapas-bt tersebut tahan terhadap serangan hama. Tanaman
kapas ini tahan terhadap serangan hama (ulat) karena tanaman ini menghasilkan
toksin yang dapat membunuh hamanya (ulat). Toksin tersebut di sandikan oleh
gen yang berasal dari bakteri Bacillus turingiensis.
Genom tanaman kapas ini mengandung gen yang berasal dari bakteri Bacillus
turingiensis. Oleh karena itu, tanaman kapas ini seringkali disebut sebagai kapas-
Bt (Bt= Bacillus turingiensis). Kapas-bt merupakan salah satu contoh organisme
transgenik. Organisme transgenik adalah organisme yang mengandung gen yang
berasal dari jenis organisme lainnya. Oleh karena tanaman kapas ini mengandung
gen yang asalnya dari orgenisme lainnya, maka kapas ini secara umum disebut
tanaman kapas transgenik.
Bakteri penghasil insulin dan tanaman kapas-bt tersebut merupakan sebagian
dari hasil rekayasa yang dilakukan manusia terhadap makhluk hidup dengan
menggunakan teknologi DNA rekombinan.
Aplikasi teknik DNA rekombinan dalam bioteknologi diantaranya adalah
produksi vaksin, insulin, antibodi dan sebagainya. Gen insulin yang berasal dari
sapi kemudian ditentukan urutan DNA-nya setelah itu direkombinasikan di dalam
suatu vektor misal plasmid kemudian dimasukan dalam sel bakteri. Selanjutnya
bakteri ini mengalami transformasi dan bisa menghasilkan insulin. Ini adalah
salah satu contoh aplikasi teknik DNA rekombinan dalam bioteknologi. Beberapa
produk DNA rekombinan yang digunakan dalam terapi manusia, diantaranya :
a. Insulin untuk penderita diabetes.
b. Faktor VIII untuk laki-laki menderita hemofilia a
c. Faktor IX untuk hemofilia b.

36
 d. Hormon pertumbuhan manusia (hgh)
e. Erythropoietin (epo) untuk mengobati anemia.
f. Beberapa jenis interferon.
g. Beberapa interleukin.
h. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (gm-csf) untuk
menstimulasi sumsum tulang setelah transplantasi sumsum tulang
i. Granulocyte koloni-stimulating factor (g-csf) untuk merangsang neutrofil
produksi, misalnya, setelah kemoterapi dan untuk memobilisasi sel induk
hematopoietik dari sumsum tulang ke dalam darah.
j. Aktivator plasminogen jaringan (tpa) untuk melarutkan gumpalan darah
k. Adenosin deaminase (ada) untuk mengobati beberapa bentuk severe
combined immunodeficiency (scid)
l. Hormon paratiroid.
m. Beberapa antibodi monoclonal.
n. Antigen permukaan hepatitis B untuk vaksinasi terhadap virus hepatitis B.
o. C1 inhibitor (c1inh) digunakan untuk mengobati edemaangioneurotic
turun-temurun.
2. Dampak Teknologi DNA Rekombinan
Dampak Positif
a. Peningkatan produksi pangan
b. Peningkatan Kesehatan
c. Peningkatan cara pengolahan limbah
d. Penyedia bahan alternativ.
Dampak Negatif
1) Dibidang Etika/Moral
Ada masyarakat yang menganggap bahwa menyisipkan gen dari
makhluk hidup satu ke makhluk hidup lain bertentangan dengan nilai
budaya dan melanggar hukum alam.
2) Dibidang Sosial Ekonomi

37
 Menimbulkan kesenjangan antara Negara/perusahaan yang
memanfaatkan bioteknologi dengan yang belum memanfaatkan
bioteknologi (Negara dunia ke tiga)
3) Dampak Dibidang Kesehatan
Ada produk hasil rekayasa genetic yang disinyalir menimbulkan
masalah serius, misalnya kematian akibat penggunaan insulin, sapi
penghasil susu yang disuntik dengan Hormon BGH mengandung
bahan kimia yang berbahaya, tomat Flavr Savr diketahui membawa
gen resisten terhadap antibiotik.
4) Dampak Terhadap Lingkungan
Pelepasan organisme transgenik ke alam dapat merusak keseimbangan
alam dan kelestarian organisme.
H. Jurnal Penelitian tentang Teknologi DNA Rekombinan
Jurnal Penelitian mengenai Kloning Gen Penisilin V Asilase dari Bacillus sp
BAC4 Melalui Pembuatan Pustaka Genom. Oleh Elfi Susanti Vh dan Sri Retno
Dwi Ariani, Program Studi Kimia Jurusan PMIPA FKIP Universitas Sebelas
Maret Surakarta 57126
1. Latar Belakang
Pustaka genom (genomic library) adalah kumpulan klon rekombinan
dalam bentuk plasmid, phage atau kosmid yang membawa fragmen molekul
DNA tertentu secara independen, berukuran tertentu dan merupakan
kumpulan keseluruhan informasi genetik suatu organisme (Winnaker et al.,
1987). Keboleh jadian suatu gen spesifik dalam kumpulan klon rekombinan
dipengaruhi oleh panjang fragmen DNA dan tingkat kompleksitas genom.
Semakin tinggi tingkat suatu spesies, maka semakin kompleks genomnya.
Beberapa tahap penting yang dapat menentukan keberhasilan pembuatan
pustaka genom adalah penyiapan fragmen DNA, penyiapan vektor, reaksi
ligasi, dan perbanyakan DNA dalam sel inang.
Pustaka genom dapat dibuat dengan memurnikan DNA kromosom dan
memotong DNA tersebut secara parsial dengan enzim restriksi tertentu, baik

38
melalui variasi konsentrasi enzim maupun variasi waktu inkubasi. Fragmen
tersebut diharapkan mewakili keseluruhan gen pada suatu organisme.
Selanjutnya fragmen DNA diinsersikan ke vektor yang sesuai, sehingga
dihasilkan vektor rekombinan. Hasil pengemasan (packing) dapat ditransfeksi
ke dalam sel inang yang sesuai, sedangkan bila menggunakan vektor plasmid,
hanya dilakukan transformasi dengan metode kejutan panas (heat shock) ke
dalam sel inang (Boulnois et al., 1987) Spesies Bacillus sangat cocok untuk
produksi enzim, kecuali B. cerus dan B. anthracis. Mikroba jenis Bacillus
tidak menghasilkan toksin, mudah ditumbuhkan, dan tidak memerlukan
substrat yang mahal. Kemampuan Bacillus untuk bertahan pada temperatur
tinggi, tidak adanya hasil samping metabolisme, dan kemampuannya untuk
menghasilkan sejumlah besar protein ekstra seluler membuat Bacillus
merupakan organisme favorit untuk industri.
Saat ini Bacillus subtilis dipakai sebagai organisme inang untuk studi
DNA-rekombinan (Doi et al., 1992). Dalam penelitian ini, gen PVA dari
Bacillus sp. BAC4 akan diklon ke dalam vektor plasmid menggunakan
pustaka genom. Pustaka genom dibuat dengan memurnikan DNA kromosom
Bacillus sp. BAC4 dan memotong DNA tersebut secara parsial dengan enzim
restriksi tertentu melalui variasi konsentrasi enzim. Fragmen tersebut
diharapkan mewakili seluruh gen yang terdapat pada suatu organisme.
Selanjutnya fragmen DNA diinsersikan ke vektor yang sesuai sehingga
menghasilkan vektor rekombinan. Hasil pengemasan (packing) ditransfeksi ke
dalam sel inang yaitu E. coli. Ekspresi skrining dilakukan untuk melihat
aktivitas PVA klon rekombinan. Pengukuran aktivitas enzim PVA didasarkan
pada jumlah 6-APA yang dibebaskan pada reaksi hidrolisis enzimatik
penisilin V.
Dari uraian di atas ingin diketahui apakah kloning gen PVA dari Bacillus
sp. BAC4 dapat dilakukan dengan menggunakan pembuatan pustaka genom.
Jika telah didapatkan klon yang positif terhadap uji aktivitas PVA, akan
dilihat bagaimana ekspesi serta aktivitas PVA dalam E. coli.

39
 Penelitian ini bertujuan untuk mengklon dan mengidentifikasi gen PVA
dari Bacillus sp. BAC4. Studi perbandingan gen PVA dan aktivitas enzim
PVA dari beberapa spesies akan memberikan pengertian yang lebih mendalam
mengenai hubungan antara struktur dan fungsi enzim dari beberapa bakteri.
2. Bahan Dan Metode
Bahan:
Mikroorganisme, yaitu Bacillus sp. BAC4 dan E.coli JM109 diperoleh
dari Laboratorium Rekayasa Genetika, Pusat Penelitian Antar Universitas,
Institut Teknologi Bandung. Diperlukan pula enzim restriksi HindIII,
enzim T ligase, enzim RNAse, protenase-K, dan DNA standar.
Bahan untuk ekstraksi DNA, yaitu gliserol, media LB (Luria Bertani
medium) padat, medium LB cair, bufer lisis terdiri dari 0,15 M NaCl, 0,1
M EDTA pH 8 dan 10 mg lizosim, SDS 10%,NaClO,5 M,
kloroform:isoamil alkohol (24:1), etanol 95%, etanol 70 %, bufer TEN
terdiri dari 10 mM Tris HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8, dan 100 mM NaCl,
RNAse, proteinasi K, fenol:kloroform:isoamil alkohol (25:24:1 v/v/v), dan
ddHO.
Cara kerja
a. Penentuan aktivitas enzim PVA.
Uji pendahuluan dilakukan dengan mengukur aktivitas enzim PVA
dalam Bacillus sp. BAC4 menggunakan metode Konferld (1978).
Aktivitas PVA diukur berdasarkan jumlah 6-APA yang dibebaskan. Satu
unit aktivitas didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk
menghasilkan 1 mol 6-APA permenit pada suhu 37C.
b. Isolasi DNA kromosom Bacillus sp. BAC4.
Isolasi DNA kromosom Bacillus sp. BAC4 dilakukan dengan metode
Wang (Doi dan McGloughlin, 1992). Tingkat kemurnian DNA ditentukan
dengan spektrofotometer sinar Uv pada panjang gelombang 260 dan 280
nm. Karakterisasi DNA dilakukan menggunakan elektroforesis gel
agarosa dengan konsentrasi gel 0,8%. Konsentrasi larutan DNA

40
kromosom hasil isolasi dapat diperkirakan dengan membandingkan
intensitas warna pitanya dalam gel agarosa dengan intensitas pita standar
yang telah diketahui ukuran dan konsentrasinya.
c. Isolasi DNA plasmid pHB201 dari E. coli.
Isolasi ini dilakukan dengan metode lisis alkali. Lisis sel bakteri
dilakukan secara kimia menggunakan kombinasi larutan EDTA dan
lisozim, suatu senyawa yang merusak protein tanpa merusak molekul
DNA maupun RNA. Proses lisis sel ini dipercepat dengan penambahan
SDS, yang akan menghilangkan molekul lipid sehingga membran sel
dapat terbuka secara perlahan. Pada metode ini, sebagian besar protein dan
RNA tidak larut. Penambahan fenol:kloroform: isoamilalkohol (25:24:1)
diharapkan dapat mengekstrak protein, sedangkan molekul RNA
didegradasi dengan menggunakan RNase. Tingkat kemurnian DNA diukur
menggunakan spektrofotometer sinar UV pada panjang gelombang 260
dan 280 nm. Karakterisasi DNA plasmid dilakukan dengan elektroforesis
gel agarosa dengan konsentrasi gel 0,8%. Konsentrasi larutan DNA
plasmid hasil isolasi dapat diperkirakan dengan membandingkan intensitas
warna pitanya dalam gel agarosa dengan intensitas pita standar yang telah
diketahui ukuran dan konsentrasinya.
d. Pemotongan DNA kromosom dan DNA plasmid.
Pemotongan DNA plasmid, DNA asing, dan DNA rekombinan
dilakukan menggunakan enzim restriksi tertentu dengan kondisi tertentu
(Sambrook et al., 1989). Enzim restriksi yang dipergunakan adalah enzim
HindIII untuk memotong DNA plasmid dan DNA asing. Hasil
pemotongan DNA dengan enzim restriksi diamati dengan elektroforesis
gel agarosa.
e. Ligasi DNA kromosom ke dalam DNA vektor (pHB201).
Ligasi fragmen DNA asing ke dalam vektor plasmid PHB201
dilakukan menggunakan enzim T ligase. Hasil ligasi ini merupakan DNA

41
 plasmid rekombinan yang siap untuk ditransformasikan ke dalam E coli
JM 109.
f. Transformasi ke E.coli JM109 dengan DNA rekombinan.
Terdapat dua tahap penting dalam prosedur transformasi, yaitu
penyiapan sel kompeten dan pemasukkan DNA ke dalam sel inangnya.
Pembuatan sel kompeten E.coli JM 109 dilakukan menurut metode
Mendel dan Higa yang telah dimodifikasi (Sambrook et al., 1989).
3. Hasil

Gambar 2.19: Hasil transformasi klon rekombinan

dalam E.coli JM 109.

Uji aktivitas PVA dalam kultur Bacillus sp. BAC4 dilakukan untuk
membuktikan bahwa bakteri tersebut benar-benar menghasilkan enzim PVA
secara ekstraseluler.
Hasil uji menunjukkan bahwa Bacillus sp. BAC4 menghasilkan enzim PVA,
diperlihatkan dengan adanya aktivitas PVA dari bakteri tersebut. Aktivitas
PVA tertinggi dicapai pada jam ke-12. Pada grafik hubungan antara aktivitas
PVA dengan waktu (Gambar 1), terlihat adanya pola naik dan turun. Hal ini
diduga karena enzim PVA yang dihasilkan bersifat ektraseluler, sehingga
kestabilannya tidak dikendalikan lagi oleh sel, melainkan oleh lingkungannya.
4. Kesimpulan
Dari hasil penelitian ini diketahui bahwa DNA kromosom Bacillus sp
BAC4 dan pemotongan DNA kromosom hasil isolasi dengan enzim restriksi
HindIII menghasilkan fragmen yang berukuran lebih besar dari 23 kb dengan
tingkat kemurnian 1,3. DNA plasmid yang diisolasi dari bakteri E. coli dan
pemotongan DNA plasmid hasil isolasi dengan enzim estriksi HindIII

42
menghasilkan fragmen berukuran 6,5kb. Plasmid rekombinan hasil ligasi
digunakan untuk mentransformasi sel inang E. coli JM109. Hasil transformasi
ditandai dengan tumbuhnya koloni biru dan putih. Disarankan untuk dilakukan
kloning dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) dan dilakukan
transformasi menggunakan inang lain.

43
 BAB III
PENUTUP

A. Kesimpulan
Genetika sebagai titik sentral bioteknologi modern.Bioteknologi dikembangkan
untuk meningkatkan nilai tambah suatu bahan dengan memanfaatkan
mikroorganisme atau sel tumbuhan dan sel hewan. Contoh bioteknologi lama:
pembuatan tempe, tape, roti pengomposan sampah dll. Contoh bioteknologi
modern: produksi antibiotika, vaksin, monosodium glutamate, hormone insulin, zat
warna insektisida dll. Perkembangan bioteknologi sangat pesat dengan adanya
rekayasa genetika.
Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metode yang
digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi. Teknik-teknik
tersebut meliputi :
a. Teknik untuk mengisolasi DNA.
b. Teknik untuk memotong DNA.
c. Teknik untuk menggabungkan atau menyambung DNA.
d. Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup
B. Saran
Kami menyadari bahwa penyajian materi dalam makalah ini belum lengkap.
Untuk itu kami sarankan agar para pembaca bisa mencari referensi tambahan dari
sumber lainnya juga.Semoga makalah ini bisa menambah pengetahuan bagi para
pembaca khususnya bagi mahasiswa pendidikan biologi.

44