Lap.

Mikroteknik

TINJAUAN PUSTAKA

Metode paraffin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena hampir semua
jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu
jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat diamati atau diteliti
melalui preparat permanen yang dibuat dengan metode paraffin. Pembuatan preparat dengan
metode paraffin adalah metode yang paling umum digunakan untuk pembuatan preparat
permanent, baik pada tumbuhan ataupun pada hewan.
Pembuaatan preparat jaringan tumbuhan yang dilakukan dengan metode parafin melalui
beberapa tahapan, yaitu:
A. Pembiusan (Narcose)
Pembiusan merupakan proses yang bertujuan khusus untuk preparat hewan yaitu untuk
memudahkan pengambilan jaringan atau bagian jaringan pada hewan. Pembiusan tidak perlu
dilakukan jika yang akan diambil atau diamati adalah jaringan yang menyangkut kelenjar-
kelenjar(endokrinologi), karena mungkin akan berpengaruh terhadap hormon-hormon yang
terkandung di dalamnya.
Senyawa kimia yang umumnya digunakan untuk pembiusan adalah:
1. Eter, biasanya digunakan untuk membius tikus, kelinci, marmut, dan anjing
2. Kloroform, biasanya digunakan untuk membius kucing dan kera.
Senyawa kimia lainnya yang dapat digunakan untuk pembiusan adalah prokain, aseton-
CHCl3, Morfin HCl, methane, alcohol, klereton, kloral hidrat, kokain, dan garam
magnesium.

B. Pengambilan jaringan (Diseksi/Collecting)

Diseksi merupakan proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari sumber alami baik
berupa tumbuhan ataupun hewan yang akan digunakan sebagai bahan dasar dalam
mikroteknik. Pada jaringan hewan setelah dilakukan pengambilan diperlukan proses
pencucian (washing).
Pencucian (washing) adalah suatu tahap yang membedakan metode paraffin hewan dengan
tumbuhan. Percobaan ini perlu dilakukan karena jaringan yang diambil pada hewan dengan
tumbuhan.pencucian ini perlu dilakukan karena jaringan yang diambil pada hewan sering kali
dalam keaadaan kotor oleh darah atau kotoran seperti pada organ pencernaan. Selain itu
jaringan hewan lebih cepat mengalami dehidrasi yang merusak jaringan, sehingga perlu
secepat mungkin dimasukan ke dalam larutan fisiologis sebagai fiksasi sementara. Pencucian
pada pembuatan preparat hewan menggunakan larutan garam fisiologis. Larutan garam
fisologis yang bisa dipakai:
1. NaCl 0.8-0.9%
2. Larutan Ringer, dapat digunakan untuk hewan berdarah panas dan dingin. Komposisi
larutan ringer adalah:
o NaCl, CaCl, KCl, K2CO3, air untuk hewan berdarah panas.
o NaCl, CaCl, KCl, Na2CO3, air untuk hewan berdarah dingin.
NaCl merupakan larutan fisologis yang umumnya digunakan, biasanya dalam waktu 15
menit. Perlu diperhatikan, jangan sekali-kali dicuci dengan air, karena akan menyebabkan
pembengkakan sel.
Syarat dalam pengambilan objek ini adalah sebagai berikut:
1. objek yang diambil dalam kondisi sehat
2. objek yang diambil tidak boleh rusak saat proses pengambilan
3. menggunakan pisau yang tajam
4. ukuran jaringan yang diambil kurang lebih 0.5 cm
5. langsung dicuci dan difiksasi.

C. Fiksasi (Fixation)
Fiksasi adalah usaha yang dapat mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan agar tetap
berada pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran.. media yang
digunakan untuk fiksasi disebut dengan fiksatif. Fiksatif terdiri dari unsur-unsur kimia yang
dibuat dalam bentuk larutan atau gas yang berfungsi agar Jaringan tidak membusuk, dan
dapat mempertahankan struktur jaringan.
Fiksatif yang sering digunakan dalam pembuatan preparat tumbuhan adalah FAA
(Formaldehyde Acetic Acid). Formula FAA untuk jaringan tumbuhan adalah:
Ethil alcohol . 50 ml
Asam asetat grasial . 5 ml
Formalin . 10 ml
Akuadest . 35 ml
FAA ini juga dapat digunakan untuk jaringan hewan. Formula FAA untuk jaringan hewan
adalah:
Formalin . 10 ml
Alkohol 70% . 90 ml
Asam asetat grasial . 2 ml
Lama fiksatif 3 jam, tanpa pencucian.
Lama jaringan disimpan dalam larutan fiksatif tergantung pada:
o Jenis jaringan, misalnya jaringan tendon perlu waktu lebih lama dari jaringan intestinum
o Tebal atau tipisnya jaringan atau ukuran jaringan, makin tebal dan besar jaringan yang
difiksasi maka semakin lama waktu yang diperlukan
o Jenis fiksatif, setiap fiksatif memiliki kecepatan penetrasi yang berbeda.
Tujuan dilakukan fiksasi dalam pembuatan preparat dengan menggunakan metode paraffin
adalah:
1. mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme)jaringan dengan cepat, sedangkan
keadaan sedikit banyaknya mendekati keadaan semula.
2. mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabkan oleh mikroorganisme ataupun
kerusakan oleh jenis enzim yang terkandung oleh jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan
autoloisis.
3. Meningkatkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras (mordant) yang
merupakan komponen jaringna fiksatif.

D. Aerasi
Aerasi merupakan proses penarikan udara dari dalam jaringan dengan cara di vakum, yang
bertujuan untuk memudahkan fiksatif masuk ke dalam jaringan dengan sempurna,. Tahap ini
diutamakan pada jaringan tumbuhan, karena sel pada jaringan hewan hanya terdiri dari
membrane sel dan vakuola yang kecil, sehingga udara yang tersimpan dalam sel atau jaringan
hanya sedikit dan mudah keluar melalui membrane sel yang tipis saat fiksasi. Sedangkan
pada sel tumbuhan memiliki dinding sel dan vakuola yang besar, sehingga mengandung
banyak udara yang sulit secara alami keluar dari sel atau jaringan melalui dinding sel yang
tebal waktu fiksasi.

E. Dehidrasi (dehydration)
Dehidrasi adalah proses penarikan air dari dalam jaringan dengan menggunakan bahan-bahan
kimia tertentu. Dehidrasi bertujuan untuk mengeluarkan air dari dalam jaringan yang telah
difiksasi. Proses dehidrasi merupakan serangkaian proses dengan cara memasukan sample ke
dalam larutan dehidrasi secara berseri dari konsentrasi rendah sampai konsentrasi tinggi
dengan mengurai konsentrasi air.
Dehidran yang paling umum digunakan pada mikroteknik dengan metode paraffin adalah
alkohol. Jenis dehidran lain adalah dioksan, N-butyl alcohol, aniline oil dan bergamot oil.
Alcohol merupakan dehidran yang umum digunakan, karena relatife lebih murah dan mudah
diperoleh, tapi mampu menghasilkan hasil yang baik, bahkan untuk jenis-jenis jaringan-
jaringan lunak seperti otak, sumsum tulang belakang, dan embrio. Dalam penggunaan alcohol
dipakai serial dengan konsentrasi yang berbeda, dimulai dari konsentrasi rendah ke
konsentrasi tinggi (35%-50%-70%-80%-95%-100%). Lama perendaman tergantung untuk
masing-masing konsetrasi berkisar 1-6 jam. Alcohol 70% sebagai stoping point, jaringan di
malamkan.
Proses dehidrasi dalam berbagai konsentrasi alcohol dilakukan setingkat demi setingkat.
Tujuannya adalah untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan secara tiba-tiba dalam terhadap
sel jaringan, sehingga perubahan struktur sel yang terjadi sekecil mungkin. Apabila proses
dehidrasi ini tidak sempurna berarti masih ada molekul air dari dalam jaringan.
Ketidaksempurnaan proses dehidrasi ini dapat diketahui dengan jelas setelah jaringan
dimasukan ke dalam zat penjernih, dimana jaringan tidak menjadi transparan walaupun
jaringan telah lama dalam larutan penjernih. Jika terjadi hal yang demikian, maka jaringan
harus dikembalikan ke dehidran.

F. Penjernihan (Clearing)
Clearing merupakan proses harus segera dilakukan setelah dehidrasi. Tujuan dari penjernihan
ini adalah menggantikan tempat alcohol sementara dalam jaringan yang telah mengalami
proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih sebelum proses penanaman
dalam paraffin. Medium penjernih ini akan menjernihkan atau mentranparankan jaringan agar
kemudian dapat terwarnai dengan baik dan memperlihatkan warna sesuai dengan warna
pewarnanya.
Lama jaringan dalam medium penjernih tergantung pada:
1. Ketebalan dan tingkat kepadatan jaringan
2. jenis reagen yang dipakai
3. bila dehidrasi telah sempurna, maka lamnya xilol atau benzene adalah setengah hingga tiga
jam. Bila dibiarkan cukup lama dalam penjernih, maka jaringan akan mengeras dan rapuh
yang tentunya sulit untuk di sayat.
4. Jenis jaringan, seperti syaraf atau kelenjar limfa sebaiknya penjernih dalam menggunakan
minyak cadar atau kloroform, karena jaringan tersebut cenderung menjadi keras atau getas
bila dijernihkan dengan xilol atau benzene.
Bahan-bahan yang dapat digunakan sebagi penjernih:

1. minyak anilin
2. Benzene
3. karbon tetraklorida
4. karbon bisulfida
5. minyak kayu cadar
6. kloroform
7. minyak cengkeh
8. Xylol
G. Infiltrasi (Infiltration)
Infiltrasi adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman (embedding media) ke dalam
jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih (clearing
agents). Media penanaman yang digunakan dalam infiltrasi ini adalah paraffin. Proses
infiltrasi ini umumnya dilakukan di dalam oven yang suhunya dapat diatur sesuai titik leleh
jenis paraffin yang digunakan. Pada jaringan hewan bisa langsung digunakan paraffin keras
dengan titik leleh 56-58C.
Dalam proses infiltrasi sebaiknya jaringan jangsn langsung dimasukan ke dalam paraffin
murni, tetapi sebelum paraffin murni jaringan dimasukkan terlebih dahulu ke dalam
campuran bahan penjernih dan paraffin murni dengan perbandingkan yang sama. Waktu yang
diperlukan jaringan campuran ini terlalu lama cukup berkisar antara 10-30 menit saja
tergantung besar kecilnya jaringan. Tujuan dari semua ini adalah untuk menghindari jaringan
dsri prubshsn lingkungsn yang sangat mendadak. Perubahan-perubahan yang mendadak ini
dapat menimbulkan kerusakan pada jaringan itu sendiri, seperti jaringan menjadi sangat
mengkerut,dll.
Setelah dalam campuran paraffin dan bahan penjernih, jaringan baru dipindahkan ke paraffin
murni sebanyak tiga kali ganti yang masing-masingnya berkisar antara 30-60 menit.
Usahakan jaringan jangan terlalu lama ditinggalkan dalam oven.
Tujuan dari tahap infiltrasi ini adalah untuk mengisi jaringan dengan paraffin sebagi pengikat
jaringan agar tetap memiliki bentuk dan struktur yang sama seperti hidup.

H. Penanaman (Embedding)
Embedding atau penanaman merupakan proses memasukan atau penanaman jaringan ke
dalam balok-balik paraffin (cetakan) sehingga memudahkan proses penyayatan dengan
bantuan mikrotom. Tujuan dari tahap ini adalah untuk membuat balok paraffin yang berisi
jaringan yang akan dibuat preparat permanen.
Paraffin yang digunakan untuk menanam jaringan harus memiliki titik leleh yang sama
dengan paraffin yang digunakn waktu infiltrasi. Paraffin ketiga yang dipakai pada infiltrasi
dapat digunakan langsung untuk penanaman dengan syarat memang sudah bersih dari bahan
penjernih.
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam penanaman adalah:
o Paraffin yang digunakan benar-benar bersih dan murni
o Peralatan yang digunakan benar-benar khusu untuk prose situ saja
o Pembuatan balok sebaiknya dilakukan dekat oven atau lampu Bunsen agar lebih cepat,
susunjaringan sesuai dengan orientasi yang direncanakan.
o Jaringan sebaiknya diberi label untuk menghindari kesalahan atau bertukar.
o Untuk jenis-jenis jaringan yang halus perlu dikerjakan di bawah lup
o Jangan sampai ada gelembung udara pada balok paraffin yang dibuat terutama dekat
jaringan.

I. Penyayatan (Sectioning)
Proses penyayatan adalah pembuatan sayatan atau pita dari balok parafin yang telah terbentuk
dengan menggunakan mikrotom, yang bertujuan untuk membuat sayatan jaringan dan dapat
dilihat jelas dari dalam mikroskop.
Pembuatan irisan dengan metode parafin memiliki beberapa keuntungan, diantaranya adalah
yaitu proses embedding lebih cepat dan lebih simpel, material embedding dapat disimpan
dalam waktu yang lama pada kondisi kering, serta dapat membuat irisan yang tipis.
Embedding menggunakan paraffin sangat baik digunakan untuk studi embriologi, anatomi
dan sitologi (Khasim, 2002).
Mikrotom adalah mesin untuk mengiris spesimen biologi menjadi bagian yang sangat tipis
untuk pemeriksaan mikroskop. Beberapa mikrotom menggunakan pisau baja dan digunakan
untuk mempersiapkan sayatan jaringan hewan atau tumbuhan dalam histologi(Wikipedia).
Jenis-jenis mikrotom yang bisa dipakai pada mikroteknik adalah:
1. Rocking microtom, cara kerjanya seperti mengatam kayu, biasanya untuk organ-organ
keras seperti kayu
2. Rotary microtom atau mikrotom putar, cara kerjanya dengan di putar yang akan
mengerakan objek maju dan naik turun, sementara pisaunya tetap. Mikrotom ini biasanya
dipakai dalam mikroteknik metode paraffin
3. Sliding microtom atau mikrotom sorong, dimana jaringan tetap posisinya dan pisau yang
bergerak maju dan mundur. Mikrotom ini sering digunakan pada mikroteknik metode
paraffin, walau umumnya digunakan pada penyayayan jaringan yang di tanam dalam
celloidin. Biasanya digunakan pada objek-objek yang keras.
4. Freezing microtom atau mikrotom beku, sering digunakan untuk penyayatan jaringan yang
tidak ditanam dalam paraffin maupun dalam celloidin, jadi jaringan yang disayat adalah
jaringan yang tidak di tanam tetapi dibekukan dengan memakai gas CO2. Keuntungan dari
mikrotom ini adalah waktu yang dipakai lebih pendek, karena langsung disayat setelah proses
fiksasi. Kerugiannya adalah bila temperature kamar tinggi, objek menjadi lunak sehingga
sulit dipotong.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam proses penyayatan ini adalah:

o Mikrotom harus seberat mungkin
o Meja tempat mikrotom harus stabil
o Pisau harus cocok dengan mikrotom
o Posisi pisau harus stabil
o Mata bisau harus tajam, bersih dan suhunya harus sama dengan balok jaringan yang akan
disayat.

J. Penempelan dan Afiksasi (Afixing)

Affixing adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada kaca objek dengan
bantuan media pelekat tertentu. Tujuan penempelan ini adalah untuk menempelkan pita
paraffin yang sudah berisi sayatan jaringan pada kaca objek.
Media pelekat yang umumnya digunakan adalam mayers albumen yang formulanya adalah
sebagai berikut :
Putih telur sebanyak 50 bagian
Gliserin sebanyak 50 bagian
Kristal Tymol beberapa butir
Akuadest beberapa tetes

K. Deparafinasi dan Pewarnaan (Staining)

Deparafinasi adalah suatu tahap menjelang proses pewarnaan dengan menggunakan xilol
untuk membersihkan paraffin dari jaringan dan kaca objek. Pengerjaan deparafinasi aserial
atau berkelanjutan dengan pengerjaan pewarnaan. Tujuan dari tahap ini untuk membersihkan
jaringan dan kaca objek dari paraffin.
Pewarnaan merupakan suatu tahap dalam mikroteknik untuk mempertajam atau memperjelas
berbagai elemen jaringan, terutama sel-seknya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah
dengan mikroskop.tanpa pewarnaan, jaringan akan transparan sehingga sulit untuk diamati.
Pewarnaan akan memperjelas rinci suatu jaringan sehinnga mudah untuk dipelajari.
Pewarnaan dibedakan antara non vital dengan vital
a. Pewarnaan non vital, pewarnaan dilakukan setelah jaringan dimatikan melalui fiksasi.
Teknik ini merupakan teknik dan cara yang paling alzim digunakan, terutama untuk pekerjaan
rutin sehari-hari, terutama pembuatan preparat/sediaan praktikum bagi mahasiswa.
b. Pewarnaan vital, maka proses pewarnaan dilakukan selagi jaringan/sel masih dalam
keadaan hidup. Sel-sel yang masih hidup tersebut diharapkan mampu untuk menyerap warna
maupun mengikat/memfagosit partikel-partikel zat warna. Dengan demikian zat warna yang
hendaknya yang tidak bersifat toksik bagi sel-sel tersebut. Sebagai contoh, tinta china dan
lithium carmine secara umum digunakan untuk mengamati penyebaran sifat sel-sel RES,
karena sel-sel tersebut mampu memfagosit zat warna.
c. Pewarnaan supra-vital diharapkan pada hasil kultur sel dan jaringan
Dalam arti yang sangat luas, zat warna mencakup bahan organic dan bahan anorganik, yang
mengadakan ikatan dengan jaringan lebih jelas untuk diamati. Ditinjau dari berbagai segi,
maka zat warna dapat kita bedakan atau kelompokan pada kategori-kategori tertentu. Berikut
ini adalah pembagian zat warna bergasarkan berbagai kategori tersebut.
1. Berdasarkan sifatnya, meliputi:
a. Zat warna asam, adalah garam-garam dari asam-asam pembawa warna dengan radikal basa
yang tidak berwarna. Contoh: acid fuchsin, eosin, dan lain sebagainya
b. Zat warna basa, adalah garam-garam dari basa pembawa warna dengan radikal asam yang
tidak berwarna.
2. Berdasarkan asalnya, meliputi:
a. Zat warna alami, berupa zat warna yang diperoleh dari alam, baik dari tumbuhan maupun
dari hewan, contoh hematokillin, adalah zat warna yang berasal dari tumbuhan (Hehatoxylin
campechianum)
b. Zat warna sintetis, mencakup jenis-jenis zat warna yang dibuat di pabrik. Contoh: basic
fuchsin, dibuat dari campuran analin dan paratoluidin.

3. Berdasarkan kemampuan mengenai warna (staining power), meliputi:

a. Zat warna substantife
Jenis zat warna yang mampu mewarnai jaringan secara langsung. Contoh janus green B,
Neutral red.
b. Zat warna ajektif
Jenis zat warna yang pada penggunaannya, agar mampu mewarnai jaringan, harus
menggunakan bantuan mordan. Contoh hematoxillin dari formula Ehrlich. Pada formula
tersebut diberikan pula kalium alumunium secara berlebihan yang berfungsi sebagai mordan.
4. Berdasarkan jumlah/ komposisi zat warna yang digunakan,meliputi:
a. Pewarna tunggal (single staining), hanya menggunakan satu jenis zat warna, contohnya
untuk melihat polysacharida sulphate ester serta hyaluronic, maka digunakan zat warna
tunggal gentian violet.
b. Pewarna ganda/ rangkap (double staining, menggunakan dua jenis zat warna, contoh pada
system pewarnaan hematoxilin-eosin
c. Pewarnaan rangkap tiga (triple staining), menggunakan tiga jenis zat warna, contohnya
formula Marllory triple stai yang menggunakan zat-zat warna acid fuchsin, aniline blue serta
orange G.
d. Pewarnaan rangkap empat, jarang digunakan dalam kerja rutin, kecuali untuk tujuan
khusus.
5. Berdasarkan struktur jaringan yang akan diwarnai, meliputi:L
a. Pewarnaan umum, seperti Hematoxillin eosin, fastgreen safranin
b. Bewarnaan khusus, seperti pewarnaan jaringan ikat yaitu Molary azan, aniline blue, asam
phospatungistik, korhensen, dan lain-lain.
METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari senin dan jumat sepanjang semester 5, yang bertempat
di Laboratorium Terpadu lab.fisiologi, Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN
Syarif Hidayatullah Jakarta
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada pembuatan preparat tumbuhan dan hewan:
Botol film
Pinset
Skalpel
Mikrotom
Vakum
Kotak kertas kalender
Balok
Mikroskop
Kaca objek
Oven
Hotplate

Bahan yang digunakan pada pembuatan preparat tumbuhan dan hewan:

Jaringan daun anggrek
Jaringan pada Burung
FAA
Alkohol, dengan berbagai konsentrasi
Xilol
Parafin lunak dan keras
mayers albumin
Hematoksilin
Eosin
Safranin
Fastgreen

3.3 Cara kerja

A. Pembuatan Preparat Tumbuhan
Pembuatan preparat tumbuhan terdiri beberapa tahap:
1. pengambilan jaringan tanaman dengan mengambil bagian organ tanaman berukuran 0.5 cm
2. Dilakuakn fiksasi dengan menggunakan larutan fiksatif (FAA)
3. Aerasi dalam larutan fiksatif menggunakan pompa vakum sampai udara dalam jaringan
habis
4. difiksasi dengan larutan FAA 12jam
5. Didehidrasi dalam seri alkohol dari kosentrasi rendah ke konsentrasi tinggi (35%-40%-
45%-50%-60%-70%-80%-90%-96%-100%) masing-masing 1 jam, kecuali 70% boleh
dimalamkan.
6. Dimasukan ke dalam Alkohol 100%:Xilol (1:1) selama 1 jam sebagai perantara sebelum
proses penjernihan
7. Sisa alcohol dijernihkan dengan proses clearing, yaitu xilol 1 jam
8. Dilakukan tahapan perantara sebelum infiltrasi yaitu perendaman di dalam larutan Xilol :
paraffin (paraffin keras)(1:1) 1 jam di dalam oven
9. Dilakukan infiltrasi dengan paraffin lunak 3 kali masing-masing 30 menit dalam oven
10. Dilakukan infiltrasi dengan paraffin keras 3 kali masing-masing 30 menit dalam oven.
Paraffin ketiga boleh dimalamkan
11. Parafin berisi objek dipotong seperti balok dan ditempel pada balok untuk pegangan pada
mikrotom
12. Penyayatan dengan mikrotom
13. Afiksing atau diletakan sayatan jaringan ke kaca objek yang diolesi dengan mayers
albumin.
14. Setelah pengeringan dengan menggunakan hotplate yang sebelumnya telah diteteskan
oleh xilol (disebut proses deparafinasi) mulai memasuki ke dalam proses staining/pewarnaan,
dengan proses sebagai berikut, rendam preparasi ke dalam xilol:alcohol (1:1) selama 3 menit,
selanjutnya dilakukan dehidrasi dengan alkohol 100%-90%-80%-70% masing-masing selama
3 menit lalu masukkan dalam air lalu dilakukan pewarnaan dengan safranin selama 5-15
menit, kemudian bersihkan dengan air.
15. Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan eosin dengna cara sbb, setelah distaining
dengan safranin masukkan dalam alcohol 50%, 60%, 70%, 80%, masing-masing 3 menit, lalu
dimasukkan ke dalam fastgreen 15-30 menit, dilanjutkan dengan alcohol (90%-100% tiga
kali)masing-masing 3 menit. Selanjutnya penjernihan dengan menggunakan xilol 5-15 menit
serta dibersihkan
16. penyelesaian dengan ditutup pakai kaca penutup sebagai media pelekat
17. Amati preparat yang dibuat dengan menggunakan mikroskop

B. Pembuatan Preparat Hewan

1. Hewan percobaan (burung) dibius dengan menggunakan eter dan diambil organ-organ
dalamnya, seperti jantung, ginjal, lambung, hati, usus, testes, paru-paru dll. Potong organ-
organ tersebut dengan ukuran 0,5 cm.
Organ-organ yang diambil kemudian langsung dimasukan ke dalam larutan fiksasi (FAA)
sebanyak 15 menit sebanyak 3X.
2. Dilakukan dehidrasi dengan direndam dalam alcohol 30, 40%, 50%, 70%, 80%, 90%,
alcohol absolute. Masing-masing selama 60 menit,kecuali alkohol 70% boleh dimalamkan.
3. Dimasukan ke dalam Alkohol 100%:Xilol (1:1) selama 1 jam sebagai perantara sebelum
proses penjernihan
4. Sisa alcohol dijernihkan dengan proses clearing, yaitu xilol 1 jam
5. Dilakukan tahapan perantara sebelum infiltrasi yaitu perendaman di dalam larutan Xilol :
paraffin (paraffin keras)(1:1) 1 jam di dalam oven
6. Dilakukan infiltrasi dengan paraffin keras 3 kali masing-masing 1 jam dalam oven. Pada
paraffin ketiga boleh dimalamkan
7. Tahap selanjutnya adalah embedding atau penanaman, organ dimasukkan kedalam kotak
8. Parafin yang berisi objek dipotong seperti balik di tempel balok kayu untuk pegangan di
mikrotom
9. Selanjutnya ke proses sectioning atau pengirisan, setelah melalui pendiaman dalam blok
paraffin
10. Selanjutnya dilakukan Afiksing (membentuk sayatan jaringan ke kaca objek yang diolesi
dengan mayers albumin.
11. Setelah pengeringan dengan menggunakan hotplate yang sebelumnya telah diteteskan
oleh xilol (disebut proses deparafinasi) mulai memasuki ke dalam proses staining/pewarnaan,
dengan proses sebagai berikut, rendam preparasi ke dalam xilol:alcohol (1:1) selama 3 menit,
selanjutnya dilakukan dehidrasi dengan alkohol 100%-90%-80%-70% masing-masing selama
3 menit lalu masukkan dalam air lalu dilakukan pewarnaan dengan hematoxillin selama 5-15
menit, kemudian bersihkan dengan air.
12. Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan eosin dengna cara sbb, setelah distaining
dengan hematoxilin masukkan dalam alcohol 50%, 60%, 70%, 80%, masing-masing 3 menit,
lalu dimasukkan ke dalam eosin 15-30 menit, dilanjutkan dengan alcohol (90%-
100%)masing-masing 3 menit. Selanjutnya penjernihan dengan menggunakan xilol 5-15
menit serta dibersihkan
13. penyelesaian dengan ditutup pakai kaca penutup sebagai media pelekat
14. Amati preparat yang dibuat dengan menggunakan mikroskop

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Pembahasan
Pada praktikum mikroteknik ini, dilakukan pembuatan preparat tumbuhan dan hewan. Bahan
yang digunakan pada pembuatan preparat tumbuhan adalah anggrek (Dendrobium sp.) dan
bahan yang digunakan untuk pembuatan preparat hewan adalah burung dara(. Pembuatan
preparat pada praktikum ini dilakukan dengan metode parafin. Metode ini dilakukan dengan
beberapa tahap yang dilakukan secara berurutan dan terus-menerus, yaitu pembiusan(untuk
hewan), collecting, fiksasi, aerasi, dehidrasi, clearing, infiltrasi, embedding, sectioning,
afixing, deparafinasi dan pewarnaan. Metode ini digunakan karena hampir semua jaringan
dapat disayat dengan metode ini.
Pada proses pembuatan preparat tumbuhan tidak diawali dengan pembiusan, karena tahap ini
hanya untuk preparat hewan, yaitu untuk memudahkan pengambilan jaringan. Pembuatan
preparat tumbuhan diawali dengan pengambilan jaringan atau collecting, pengambilan
jaringan biasanya menggunakan pisau atau gunting yang tajam dengan ukuran kurang lebih
0,5 cm. Sampel jaringan yang telah diambil, sebaiknya langsung dimasukan ke dalam larutan
fiksatif agar dapat mempertahankan bentuk sel atau jaringan seperti dalam keadaan hidup.
Larutan fiksatif yang digunakan adalah FAA.
FAA (Formaldehyd Acetic Acid) yang digunakan dalam fiksasi merupakan larutan fiksatif
campuran dan sebagai fiksatif koagulan yang lebih banyak digunakan untuk studi dalam
aspek anatomi dan morfologi, serta studi pencocokan kromosom. Tujuan digunakan FAA
yaitu untuk menjaga sel dalam waktu tertentu atau tidak terbatas dan tanpa mengalami
kerusakan. Waktu minimal yang diperlukan untuk fiksasi dengan FAA adalah 18 jam.
Komposisi dari FAA adalah sebagai berikut (Khasim, 2002 dalam Imran,2008):
" Ethyl alcohol 70 % 90 ml
" Glacial acetic acid 5 ml
" Formalin 5 ml
Acetic acid berfungsi untuk membunuh jaringan, selanjutnya formalin dan etil alkohol
berperan dalan modifikasi gambar atau tampilan, pada intinya FAA untuk fiksasi yang
memberikan tampilan yang tajam. Untuk material daun, waktu minimal fiksasi yang harus
digunakan adalah sekitar 12 jam. Untuk daun yang sangat tipis atau batang yang kecil
diperlukan waktu 24 jam (Khasim, 2002 dalam Imran, 2008).
Tahap selanjutnya adalah aerasi, yang digunakan khusus untuk preparat tumbuhan, karena sel
pada jaringan hewan hanya terdiri dari membrane sel dan vakuola yang kecil, sehingga udara
yang tersimpan dalam sel atau jaringan hanya sedikit dan mudah keluar melalui membrane
sel yang tipis saat fiksasi. Sedangkan pada sel tumbuhan memiliki dinding sel dan vakuola
yang besar, sehingga mengandung banyak udara yang sulit secara alami keluar dari sel atau
jaringan melalui dinding sel yang tebal waktu fiksasi. Pada tahap aerasi digunakan vakum
sampai udara dari dalam jaringan sudah keluar.
Tahap selanjutnya adalah dehidrasi yang menggunakan alkohol secara bertahap dari
konsentrasi rendah sampai tinggi, agar dapat menjaga bentuk jaringan dari perubahan secara
tiba-tiba dan untuk memaksimalkan pengeluaran air dari dalam jaringan. Penggunaan alkohol
70% sebagai stopping point karena alkohol 70% juga dapat digunakan sebagai desinfektan.
Dehidrasi berfungsi untuk membuat preparasi permanen, sehingga ketika dipotong tidak
rusak dan dapat disimpan dalam waktu yang lama. Alkohol digunakan karena alkohol bersifat
menarik air sehingga jaringan mengkerut dan mengeras (Khasim, 2002 dalam Imran,2008).
Setelah tahap ini adalah tahap infiltrasi yang digunakan untuk menggantikan tempat alkohol
di dalam jaringan dengan bahan penjernih yaitu xilol. Sebelum menggunakan xilol, jaringan
dimasukan dahulu ke dalam larutan alkohol dan xilol dengan perbandingan 1:1 agar tidak
terjadi perubahan pada jaringan secara tiba-tiba dari alkohol ke dalam xilol.
Tahap selanjutnya adalah embedding, embedding adalah penanaman jaringan ke dalam kotak
dengan menggunakan parafin murni. Kotak yang dibuat dengan menggunakan adalah kertas
yang berasal dari kalender. Tahap ini dilakukan agar mempermudah proses penyayatan. Yang
harus diperhatikan adalah pada saat penanaman tidak boleh ada gelembung.
Setelah tahap embedding, baru bisa dilakukan penyayatan (sectioning). Proses penyayatan
(sectioning) adalah pembuatan sayatan atau pita dari balok parafin yang telah terbentuk
dengan menggunakan mikrotom, yang bertujuan untuk membuat sayatan jaringan dan dapat
dilihat jelas dari dalam mikroskop. Mikrotom yang digunakan pada praktikum ini adalah
Sliding microtom atau mikrotom sorong, dmana jaringan tetap posisinya dan pisau yang
bergerak maju dan mundur. Setelah sayatan jaringan telah terbentuk, sayatan tersebet
ditempelkan di kaca objek (afixing) yang sebelumnya telah dioleskan mayers albumin secara
merata. Selanjutnya sayatan ditetesi oleh xilol dan dipanaskan sampai kering atau tahap ini
disebut deparafinasi. Setelah itu preparat bisa disimpan di dalam kotak sampai akhirnya nanti
dilakukan proses pewarnaan (Staining).
Tahap staining pada tumbuhan dengan menggunakan Pewarna ganda/ rangkap (double
staining, karena dengan menggunakan dua jenis zat warna, yaitu safranin-fastgreen. Tahap
pewarnaan menggunakan beberapa langkah yang dilakukan bertahap yaitu pertama yaitu
preparat direndam dalam xilol:alkohol (1:1), selanjutnya berturut-turut adalah dehidrasi
dengan alkohol 100%-90%-80%-70%, pewarnaan I (Safranin), dibersihkan dengan air,
alkohol 50%-60%-70%-80%, pewarnaan II (fastgreen), alkohol 90%-100% tiga kali,
penjernihan dengan xilol, dan dibersihkan dengan air.
Hasil dari pewarnaan tumbuhan yaitu pada daun anggrek kalajengking (Arachis flos-aeris)
adalah nampak kurang jelas dan sebagian besar rusak ketika dilihat di mikroskop. Hal ini
dimungkinkan karena beberapa hal kemungkinan kesalahan dalam melakukan prosedur
sehingga sample daun menjadi lebih kering dan mengkerut.
Suku anggrek-anggrekan atau Orchidaceae merupakan satu suku tumbuhan berbunga dengan
anggota jenis terbanyak. Jenis-jenisnya tersebar luas dari daerah tropika basah hingga
wilayah sirkumpolar, meskipun sebagian besar anggotanya ditemukan di daerah tropika.
Kebanyakan anggota suku ini hidup sebagai epifit, terutama yang berasal dari daerah tropika.
Anggrek di daerah beriklim sedang biasanya hidup di tanah dan membentuk umbi sebagai
cara beradaptasi terhadap musim dingin. Organ-organnya yang cenderung tebal dan
"berdaging" (sukulen) membuatnya tahan menghadapi tekanan ketersediaan air. Anggrek
epifit dapat hidup dari embun dan udara lembab. Daun anggrek biasanya oval memanjang
dengan tulang daun memanjang pula, khas daun monokotil. Daun dapat pula menebal dan
berfungsi sebagai penyimpan air.
Kingdom : Plantae (tumbuhan)
Subkingdom : Tracheobionta (berpembuluh)
Superdivisio : Spermatophyta (menghasilkan biji)
Divisio : Magnoliophyta (berbunga)
Kelas : Liliopsida (berkeping satu / monokotil)
Sub-kelas : Liliidae
Ordo : Orchidales
Familia : Orchidaceae (suku anggrek-anggrekan)

Genus : Arachis
Spesies : Arachis flos-aeris J.J.S

Jaringan pada daun dapat dibedakan menjadi:

1. Jaringan epidermis
Merupakan lapisan daun yang paling luar. Jaringan epidermis ada dua yaitu; epidermis atas
dan epidermis bawah. Epidermis umumnya transparan karena tidak memiliki kloroplas. Di
epidermis terdapat stomata (tunggal: stoma) yang berperan sebagai alat respirasi tumbuhan.
Stomata umumnya terletak di epidermis bawah. Pada tumbuhan air, biasanya stomata banyak
terdapat di epidermis atas.
2. Jaringan mesofil
Jaringan mesofil terletak di antara epidermis atas dan epidermis bawah. Pada tumbuhan
dikotil, jaringan mesofil terdiri dari dua jaringan yaitu: jaringan palisade (jaringan tiang) dan
jaringan spons (jaringan bunga karang).
Jaringan palisade (jaringan tiang)
Sel-sel jaringan palisade berbentuk memanjang seperti tiang dan tersusun rapat. Pada jaringan
palisade, terdapat banyak kloroplas. Oleh sebab itu fotosintesis terjadi di jaringan ini.
Jaringan spons (jaringan bunga karang)
Berbeda dari jaringan palisade, jaringan spons sel-selnya tidak tersusun rapat. Karena sel-
selnya tidak tersusun rapat, jaringan spons digunakan untuk menyimpan cadangan makanan.
Pada tumbuhan monokotil, jaringan mesofil tidak terdiri atas jaringan palisade dan jaringan
spons. Fotosintesis terjadi pada jaringan mesofil.

3. Jaringan pembuluh
Jaringan pembuluh terletak pada jaringan spons. Jaringan pembuluh pada daun merupakan
kelanjutan dari jaringan pembuluh pada batang. Ada dua jenis pembuluh yaitu:
o Pembuluh kayu (xylem).
Merupakan pembuluh yang berperan untuk mengangkut air dan mineral yang diserap akar
dari tanah menuju daun.
o Pembuluh tapis (floem)
Merupakan pembuluh yang berperan untuk mengangkut hasil fotosintesis ke seluruh bagian
tumbuhan.
Pada tumbuhan dikotil, terdapat kambium yang membatasi pembuluh kayu dan pembuluh
tapis. Tapi pada tumbuhan monokotil, tidak terdapat kambium yang membatasi pembuluh
kayu dan pembuluh tapis. Akibat adanya kambium, memungkinkan batang tumbuhan dikotil
bertambah lebar dan terbentuknya lingkaran tahun pada batang.

Daun terbagi menjadi 4 susunan anatomi, yaitu daun bifacial/dorsiventral (bentuk permukaan
atas dan bawah tidak sama karena palisade hanya pada permukaan atas), daun
unifacial/isolateral (bentuk permukaan atas dan bawah sama; palisade terdapat pada kedua
sisi), daun rumput-rumputan pada monokotil (mesofil hanya berupa spons), dan daun jarum
pada gymnospermae (mesofil bentuk bunga, penampang melintang bulat membulat, setengah
lingkaran atau segitiga sehingga sulit ditentukan atas dan bawahnya(Priyanti&Puji,2007).
Pada hasil dari pembuatan preparat hewan, yaitu pada hati, otak dan paru-paru hasil yang
didapatkan juga kurang bagus. Sehingga masih tidak dapat dibedakan bagian-bagiannya.
Kadang preparat yang dihasilkan kurang bagus. Jaringan kadang melipat sehiingga sulit
diamati bagian-bagiannya. Hal ini dikarenakan pada proses pengirisan kurang berhasil
dimana pita menggulung dan jaringan yang melekat pada parafin hanya sedikit. Warna
jaringan yang pudar karena setelah perendaman di larutan pewarna terlalu lama dibiarkan di
udara bebas. Hal lain yang sangat mungkin adalah pewarna kualitasnya sudah menurun atau
terlalu lama. Jaringan yang teramati kadang rusak aatu terkoyak hal ini dapat dikarenakan
pita sobek sehingga jaringan ikut rusak. Proses infiltrasi dengan xilol kurang maksimal
sehingga jaringan rapuh (Affuwa, 2007).
Salah satu preparat hewan adalah hati. Hati adalah sebuah organ dalam vertebrata, termasuk
manusia. Organ ini memainkan peran penting dalam metabolisme dan memiliki beberapa
fungsi dalam tubuh termasuk penyimpanan glikogen, sintesis protein plasma, dan penetralan
obat. Preparat yang lain adalah preparat otak dan paru-paru. Pada otak sebagiannya terdiri
atas sel syaraf.

PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Pembuaatan preparat jaringan tumbuhan yang dilakukan dengan metode parafin melalui
beberapa tahapan, diantaranya adalah Fiksasi, pencucian, dehidrasi, penjernihan, infiltrasi,
penyelubungan (embeeding), pengirisan (sectioning), penempelan (affixing), pewarnaan
(staining), penutupan (mounting). Berdasarkan hasil pembuatan preparat tumbuhan yaitu
pada daun Anggrek, struktur yang teramati tampak kurang jelas dan sebagian besar rusak.
Sedangkan hasil dari preparat hewan tidak dapat dibedakan bagian-bagiannya.

5.1 Saran
Saran yang ingin disampaikan yaitu sebaiknya untuk praktikum selanjutnya harus lebih
diperhatikan dalam melakukan setiap langkah prosedur agar hasilnya lebih baik dan
maksimal.

DAFTAR PUSTAKA

Dasumiati, 2008. Diktat Kuliah Mikroteknik. Prodi Biologi Fak.Sains dan Teknologi UIN
Syarif Hidayatullah Jakarta
Daun. Http: http://fionaangelina.com/2008/04/01/daun/. Di akses tanggal 29 Desember 2008
jam 14.24

Imron,Tamyis Ali.2008. Pembuatan Preparat Jaringan Tumbuhan Dengan Metode Parafin.

Lap.prak mikroteknik Universitas Brawijaya. http://cyber-biology.blogspot.com. Di akses
tanggal 29 Desember 2008 jam 14.02

__________________ . Pembuatan Preparat Jaringan Hewan Dengan Metode Parafin.

Lap.prak mikroteknik Universitas Brawijaya. http://cyber-biology.blogspot.com. Di akses
tanggal 29 Desember 2008 jam 14.17

Mikroteknik. http: wikipedia.com. Di akses tanggal 29 Desember 2008 jam 14.35

Priyanti dan Puji. 2007. Penuntun Praktikum Struktur dan Perkembangan Tumbuhan
(Morfologi dan Anatomi Tumbuhan). Laboratorium Terpadu. UIN Jakarta