BAB I

PENDAHULUAN

1.1.LATAR BELAKANG

Kromatografi adalah sebuah nama yang diberikan untuk teknik pemisahan tertentu.

Cara yang asli telah diketengahkan pada tahun 1903 oleh Tsweet yang digunakan untuk

pemisahan senyawa-senyawa yang berwarna, dan nama kromatografi diambil dari senyawa

yang berwarna. Meskipun demikian pembatasan untuk senyawa-senyawa yang berwarna tak

lama, dan sekarang hampir kebanyakan pemisahan secara kromatografi digunakan juga

untuk senyawa-senyawa tak berwarna, termasuk gas. Pada dasarnya, semua cara

kromatografi menggunakan dua fase yaitu fasa tetap (stasionary) dan yang lain fasa bergerak

(mobile). Pemisahan-pemisahan tergantung pada gerakan relatif pada dua fasa ini. Fasa tetap

dapat berupa zat padat atau cair. Jika fasa tetap berupa zat padat, maka cara tersebut dikenal

dengan nama kromatografi partisi. Sedangkan fasa bergerak dapat berupa zat cair atau gas.

Berbagai jenis pemisahan yang sederhana dengan kromatografi kertas telah dikerjakan

dimana prosesnya dikenal sebagai analisis kapiler. Metode-metode seperti ini sangat

bersesuaian dengan kromatografi serapan, dan sekarang kromatografi kertas dipandang

sebagai perkembangan dari sistem partisi. Salah satu zat padat dapat digunakan untuk

menyokong fasa tetap yaitu bubuk selulosa.

Semakin berkembangnya zaman, manusia telah berpikir jauh untuk mengembangkan

apa saja yang menjadi kekurangan dari teknologi yang telah ada. Begitu juga untuk teknik

kromatografi telah mengalami perkembangan yang sangat pesat dengan tujuan utamanya

untuk memudahkan pekerjaan manusia, dalam hal ini memudahkan untuk menganalisa dan

1
pemisahan atau pemurnian suatu kandungan dari senyawa. Ada empat teknik kromatografi

yang berkembang saat ini yaitu Kromatografi Kertas (KKt), Kromatografi Lapis Tipis (KLT),

Kromatografi Gas Cair (GC) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC). Ada jugasize

exclusion chromatography atau yang disingkat SEC yang biasanya digunakan untuk

memisahkan molekul biologis, untuk menentukan bobot molekul, dan distribusi bobot

molekul dari polimer.

1.2.RUMUSAN MASALAH

1. Bagaimana definisi dan teori size exclusion chromatography (SEC)?

2. Bagaimana mekanisme SEC?

3. Bagaimana prinsip SEC?

4. Apa saja komponen dari SEC?

1.3.TUJUAN

1. Untuk mengetahui dasar-dasar pemisahan analitik size exclusion chromatography

2. Untuk mengetahui cara pemisahan campuran berdasarkan metode size exclusion

chromatography

3. Mengetahui mekanisme dan prinsip size exclusion chromatography

4. Mengetahui komponen-komponen pada sistem size exclusion chromatography

2
 BAB II

PEMBAHASAN

2.1. Definisi Dan Teori Size Exclusion Chromatography

Size exclusion chromatography (SEC) disebut juga gel permeation chromatography

(GPC), gel filtration chromatography (GPC), merupakan metode kromatografi yang

menggunakan partikel berpori untuk memisahkan molekul dengan ukuran yang berbeda.

Teknik SEC pertama kali ditemukan oleh Grant Henry Lathe dan Colin R Ruthven.
SEC umumnya diaplikasikan untuk kompleks makromolekul seperti protein, dan

industri polimer terutama digunakan untuk pemisahan molekul biologis, untuk menentukan

bobot molekul, dan distribusi bobot molekul dari polimer. Molekul yang lebih kecil dari

ukuran pori dapat memasuki partikel dan mempunyai jalur dan waktu transit yang lebih

3
panjang dibandingkan molekul besar yang tidak dapat memasuki partikel. Semua molekul

yang lebih besar dari ukuran pori tidak tertahan dan terelusi bersama. Molekul yang

memasuki pori akan mempunyai waktu tinggal dalam partikel yang tergantung pada ukuran

dan bentuk molekul. Molekul yang berbeda mempunyai waktu transit yang berbeda untuk

melewati kolom.
Kelebihan SEC :
Waktu pemisahan yang cepat dan hasil yang baik
Frekuensi tajam dan sensitivitas baik
Bebas dari kehilangan sampel, pelarut tidak berinteraksi dengan fase stasioner
Variasi larutan dapat diaplikasikan tanpa mengganggu proses filtrasi

Kekurangan SEC :

Hanya sejumlah frekuensi terbatas dapat diakomodasikan karena skala waktu

kromatogram pendek
Tidak dapat digunakan untuk sampel dengan ukuran seragam.

Teori

Kolom SEC mengandung partikel berpori dengan diameter pori yang berbeda. Linarut

yang disuntikkan ke dalam kolom tersebut berdifusi ke dalam pori yang diameternya lebih

besar daripada diameter efektif linarut. Walaupun bobot molekulnya sama, diameter

efektifnya berbeda, dan komponen yang diameternya paling besar akan terelusi lebih dahulu.

Dengan bertambah besarnya diameter linarut, jumlah pori yang dapat dimasuki dan

kemampuannya berdifusi dalam pori menjadi menurun. Jadi, jika linarut berdiameter

sedemikian rupa sehingga tidak dapat berdifusi ke dalam pori yang manapun, maka linarut

tersebut dikatakan tereksklusi sempurna dan tidak tertahan, artinya linarut tersebut terelusi

dalam volume kolom. Linarut yang mampu berdifusi sempurna ke dalam semua pori

dikatakan bermeasi sempurna ke dalam kemasan. Linarut jenis ini memerlukan volume

pelarut yang jauh lebih besar untuk mengelusinya dari kolom.

4
2.2.Mekanisme SEC

Mekanisme kerja dari size exclusion chromatography adalah buffer dipompa melewati

kolom oleh alat yang diatur oleh komputer. Saat campuran molekul dan ion-ion yang terlarut

dalam pelarut diaplikasikan pada ujung atas kolom, molekul-molekul yang lebih kecil dan ion

didistribusikan melalui volume pelarut yang lebih besar daripada yang tersedia untuk molekul

besar. Molekul yang lebih kecil dari ukuran pori dapat masuk ke dalam partikel dan

karenanya memiliki jalur yang lebih panjang serta waktu transit yang lebih panjang

dibandingkan molekul besar yang tidak dapat memasuki partikel. Seluruh molekul yang lebih

besar ukurannya dibandingkan ukuran yang tidak tertahan dan akan dielusi bersamaan.

Molekul yang dapat masuk ke dalam pori akan memilikiwaktu tinggal rata-rata dalam

partikel, yang bergantung dari bentuk serta ukuran molekulnya. Karena itu, molekul besar

bergerak lebih cepat melewati kolom, dan dengan inilah campuran tersebut dapat dipisahkan

menjadi komponen-komponennya.

5
2.3.Prinsip SEC

Prinsip dari kromatografi eksklusi adalah terjadinya pemisahan molekul polimer

sesuai dengan volume hidrodinamiknya ketika sampel diinjeksikan ke dalam kolom. Volume

hidrodinamik yang dihasilkan dari sistem kromatografi ini terbagi menjadi tiga macam

volume, yaitu :
1. Volume interstisial (Vi)
Merupakan volume elusi yang diperoleh jika molekul polimer memiliki ukuran

yang lebih besar daripada ukuran pori-pori sehingga tidak mampu masuk ke pori-

pori.
2. Volume interstisial dan Volume pori (Vi+Vp)
Merupakan volume elusi yang diperoleh jika molekul polimer memiliki ukuran

yang lebih kecil daripada ukuran pori-pori sehingga mampu melewati dan masuk

ke dalam pori-pori.
3. Volume elusi (Ve)
Merupakan volume pori untuk molekul polimer yang memiliki ukuran diantara

kedua molekul polimer sebelumnya. Untuk volume ini dapat dirumuskan dengan

persamaan : Ve = Vi + Ksec.Vp
Dimana Ksec adalah nilai konstan dari kromatografi eksklusi (SEC) (0< Ksec <

1).

6
 Peralatan penting yang biasanya digunakan pada kromatografi eksklusi (SEC), antara

lain adalah pompa untuk mempertahankan aliran yang konstan, kolom dengan jenis molekul

tertentu, dan detektor untuk hasi kuantitatif.

2.4.Komponen Size Exclusion Chromatography

Komponen yang digunakan dalam sistem kromatografi ini adalah :

1. Kolom

Pemilihan ukuran pori kolom tergantung pada ukuran molekul linarut yang akan

dipisahkan. Sampel yang ukurannya (bobot molekul) bermacam-macam tidak mampu

dipisahkan jenis-jenis molekulnya jika digunakan satu ukuran pori-pori dalam kolom.
Setiap kolom eksklusi dengan ukuran pori tertentu hanya memiliki satu kurva

kalibrasi tertentu. Batas eksklusi dan rentang kerja BM tidak didefinisikan dengan tajam

karena distribusi pori kolom tidak sempit. Jika distribusi pori lebar maka akan dihasilkan

kurva dengan kemiringan yang tajam. Dengan demikian, senyawa-senyawa yang memiliki

ukuran molekul hampir sama akan dihasilkan daya pisah yang rendah jika rentang kerja BM-

nya besar. Sebaliknya, jika distribusinya sempit maka akan didapat kurva yang lebih

mendatar. Sehingga, rentang kerja BM akan menjadi lebih kecil tetapi daya pisah molekul

yang memiliki ukuran hampir sama akan meningkat. Pemisahan optimum komponen-

komponen suatu senyawa sampel yang memiliki distribusi bobot molekul lebar dapat

diperoleh jika kolom eksklusi memiliki rentang kerja BM yang berbeda. Pada setiap

rangkaian kolom dapat dihasilkan kurva kalibrasi tersendiri dimana perolehan kurva kalibrasi

ini didapat dengan menyuntikkan senyawa baku (standar baku) yang diketahui bobot

molekulnya, kemudian menentukan VR masing-masing. Dengan demikian, kromatografi

eksklusi merupakan suatu metode cepat yang dapat digunakan untuk memperoleh perkiraan

7
harga bobot molekul (BM) suatu sampel dengan membandingkan empirisnya pada senyawa

standar baku. Untuk memperoleh nilai perbandingan yang bagus, struktur antara sampel

dengan standar baku haruslah sama.

2. Fase gerak
Fase gerak SEC harus merupakan pelarut polimer yang baik untuk menghindari

efek noneksklusi. Sampel harus terdisolusi pada suhu yang sesuai dan bertahan cukup lama

sebelum akhirnya disuntikkan. Hal tersebut bertujuan agar pelipatan dapat mengembang

dalam fase gerak atau dengan kata lain memecahkan agregat. Bila sampel hanya terlarut

sebagian dalam fase gerak, maka dapat terjadi peningkatan tekanan pada kolom karena

ukuran partikel yang terlalu besar. Efek tersebut dapat diatasi dengan cara memilih pelarut

lain, atau meningkatkan temperatur kolom.

Pada beberapa kondisi, perlu adanya penambahan elektrolit agar terjadi

disagregasi. Beberapa polimer, seperti polyolefin, biasa digunakan untuk analisis pada suhu

tinggi (140-150C). Bila analisis dilakukan pada kondisi tersebut, maka fase gerak yang

bersifat toksik tidak dapat digunakan (contoh : triklorobenzen), sehingga perlu dipilih fase

gerak yang lain. Fase gerak dalam SEC terbagi dalam dua bagian besar, yaitu :

a. Fase gerak SEC untuk protein dan polimer larut air

SEC sering digunakan untuk mengisolasi prostein, menghilangkan agregat, desalting

sampel protein, memisahkan fraksi asam nukleat, atau untuk mengetahui sifat polimer larut

air yang digunakan dalam makanan, cat, sediaan farmasi, dan sebagainya. Fase gerak yang

digunakan disesuaikan dengan fase diam, antara lain :

Silika
Jenis kolom : SW, WxI, dan SuperSW digunakan untuk menganalisa protein

dan asam nnukleat menggunakan aqueous buffer sebagai fase gerak.

Polimetakrilat
Jenis kolom : PW dan PWxI digunakan untuk menganalisis polimer industri,

oligosakarida, asam nukleat virus, menggunakakan fase gerak berupa larutan buffer

8
 atau larutan garam. Kolom PWxI yang digunakan untuk menganalisa polimer kationik

menggunakan fase gerak berupa larutan garam encer.

Contoh pelarut yang mengandung air yang sering digunakan sebagai fase gerak dalam

SEC yaitu buffer pospat (Ph 7,0), dan larutan NaCl.

b. Fase gerak SEC untuk polimer polar dan polimer larut dalam pelarut organik
Fase gerak SEC untuk polimer polar dan polimer larut dalam pelarut organik SEC

sering digunakan untuk mengetahui sifat polimer organik polar dan polimer larut dalam

pelarut organik. Pemilihan pelarut organik didasarkan pada efek partisi dan adsorpsi pelarut.

Jenis fase gerak yang digunakan disesuaikan dengan fase diam, antara lain :
Polimetakrilat
Jenis kolom : Alpha dan SuperAW menggunakan fase gerak berupa pelarut organik

polar, seperti methanol, asetonitril, DMF, DMSO, THF, dan HFIP.

Polistirena
Dapat menggunakan pelarut yang terbatas

3. Detektor

Setelah pemisahan sampel polimer, molekul dapat dideteksi dengan sistem detektor
yang berbeda-beda, misalnya dengan refraktometer atau detektor UV-Vis. Intensitas detektor
direkam sebagai fungsi volume pelarut eluen. Sistem dikaliberasi dangan menggunakan
polimer sampel yang diketahui berat molekulnya, dapat dilakukan dengan evaluasi berat
molekul dan distribusi berat molekul menggunakan detektor sinar menyebar (light scatter
detector), berat molekul polimer dapat ditentukan secara langsung dan tidak perlu dikaliberasi
terlebih dahulu. Detektor berfungsi sebagai pendeteksi komponen-komponen
yang telah dipisahkan dari kolom secara terus-menerus, cepat, akurat,
dan dapat melakukan pada suhu yang lebih tinggi. Detektor harus dapat
dipercaya dan mudah digunakan. Fungsi umumnya mengubah sifat-sifat
molekul dari senyawa organik menjadi arus listrik kemudian arus listrik
tersebut diteruskan ke rekorder untuk menghasilkan kromatogram.
Detektor yang umum digunakan:

a. Detektor hantaran panas (Thermal Conductivity Detector_ TCD)

b. Detetor ionisasi nyala (Flame Ionization Detector_ FID)
c. Detektor penangkap elektron (Electron Capture Detector _ECD)
d. Detektor fotometrik nyala (Falame Photomertic Detector _FPD)
e. Detektor nyala alkali

9
f. Detektor spektroskopi massa

Detektor yang peka terhadap senyawa organik yang mengandung fosfor

adalah FID, ECD, dan FPD.

10
 BAB III

PENUTUP

3.1.KESIMPULAN

Size exclusion chromatography (SEC) disebut juga gel permeation chromatography

(GPC), gel filtration chromatography (GFC), merupakan metode kromatografi yang

menggunakan partikel berpori untuk memisahkan molekul dengan ukuran yang berbeda.

Komponen dari size exclusion chromatography adalah kolom, fase gerak, dan

detektor.

Volume hidrodinamik yang dihasilkan dari sistem kromatografi ini terbagi menjadi

tiga macam volume, yaitu : Volume interstisial (Vi), Volume interstisial dan Volume pori

(Vi+Vp) , Volume elusi (Ve).

11
3.2. SARAN
Demikian makalah ini di susun, tentunya banyak kekurangan baik dalam segi isi atau
penyampaiannya. Oleh karena itu, saya mengharap kritik dan saran demi kesempurnaan
makalah kami. Semoga makalah ini bermanfaat bagi pembaca.
Penulis juga berharap size exclusion chromatography yang telah disajikan dalam bab
pembahasan dapat dijadikan referensi ataupun tambahan wawasan bagi pembaca sehingga
dapat membedakannya dan dapat menerapkannya secara tepat.

DAFTAR PUSTAKA

Wen Jie, Tsutomu Arakawa, and John S. Philo. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY:

Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbanc

and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions.

Protein Chemistry Department, Amgen Inc., Thousand Oaks, California. 1996

Chi-san Wu. Handbook of Size Exclusion Chromatography. MARCEL DEKKER,

INC. New York. 1995

12
http://www.polymer.uni-karlsruhe.de/english/310.php

http://www.impactanalytical.com/applications/sec.aspx

http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/sep/lc/size-exc.htm

http://www.kfunigraz.ac.at/~trathnig/2032-_a.pdf

http://www.separations.us.tosohbioscience.com/Products/HPLCColumns/ByMode/Siz

eExclusion/

13