KROMATOGRAFI GEL

A. PENDAHULUAN
Kromatografi gel memiliki nama lain yaitu size exclusion chromatography
(SEC) yang disebut juga gel permeation chromatography (GPC), gel filtration
chromatography (GFC), merupakan metode kromatografi yang menggunakan
partikel berpori untuk memisahkan molekul dengan ukuran yang berbeda. Teknik
kromatografi ini pertama kali ditemukan oleh Grant Hendry Lathe dan Colin R.
Ruthven.
Kromatografi gel umumnya diaplikasikan untuk kompleks
makromolekuler seperti protein dan industri polimer terutama digunakan untuk
memisahkan molekul biologis, untuk menentukan bobot molekul dan distribusi
bobot molekul dari polimer. Molekul yang lebih kecil dari ukuran pori dapat
memasuki partikel dan mempunyai jalur dan waktu transit yang lebih panjang
dibandingkan molekul besar yang tidak dapat memasuki partikel. Semua molekul
yang lebih besar dari ukuran pori tidak tertahan dan terelusi bersama. Molekul
yang memasuki pori akan mempunyai waktu tinggal dalam partikel yang
tergantung pada ukuran dan bentuk molekul. Molekul yang berbeda mempunyai
waktu transit yang berbeda untuk melewati kolom. Ketika larutan aqueous
digunakan untuk transport sampel melalui kolom, teknik tersebut dinamakan gel
filtration chromatography yang digunakan ketika pelarut organik digunakan
sebagai fase gerak.

Gambar 1. Skema kolom kromatografi gel

B. KELEBIHAN DAN KEKURANGAN
1. Kelebihan kromatografi gel adalah :
a. Waktu pemisahan yang cepat dan hasil yang baik
b. Frekuensi tajam sehingga menghasilkan sensitivitas yang baik
c. Bebas dari kehilangan sampel, pelarut tidak berinteraksi dengan fase
stasioner
d. Variasi larutan dapat diaplikasikan tanpa mengganggu proses filtrasi,
sementara mempersiapkan aktivitas biologis partikel untuk memisah.
2. Kekurangan kromatografi gel adalah :
a. Hanya sejumlah frekuensi terbatas dapat diakomodasikan karena skala
waktu kromatogram pendek
b. Tidak dapat digunakan untuk sampel dengan ukuran yang seragam, seperti
isomer. Diperlukan sedikitnya perbedaan 10% dari berat molekul untuk
resolusi yang masuk akal.
C. PRINSIP
Prinsip dari kromatografi gel adalah terjadinya pemisahan
molekul polimer sesuai dengan volume hidrodinamiknya ketika sampel
diinjeksikan ke dalam kolom. Volume hidrodinamik yang dihasilkan dari sistem
kromatografi ini terbagi menjadi tiga macam volume, yaitu:
1. Volume interstisial (Vi) merupakan volume elusi yang diperoleh jika molekul
polimer memiliki ukuran yang lebih besar daripada ukuran pori-pori sehingga
tidak mampu masuk ke pori-pori.

2. Volume interstisial dan volume pori (Vi + Vp) merupakan volume elusi yang

diperoleh jika molekul polimer memiliki ukuran yang lebih kecil

daripada ukuran pori-pori sehingga mampu melewati dan masuk ke dalam
pori-pori.
3. Volume elusi (Ve) merupakan volume pori untuk molekul polimer
yang memiliki ukuran diantara kedua molekul polimer sebelumnya.
Untuk volume ini, dapat dirumuskan dengan persamaan: Ve = Vi + Ksec.Vp.
Dimana Ksec adalah nilai konstan pada kromatografi eksklusi (0 < Ksec < 1).
Prinsip kromatografi gel dijelaskan oleh skema di bawah ini :

Gambar 2. Prinsip kromatografi gel

Gambar 3. Pemisahan Kromatografi Gel

D. TEORI
Kolom kromatografi gel mengandung partikel berpori dengan diameter
pori yang berbeda. Linarut yang disuntikkan ke dalam kolom tersebut berdifusi
ke dalam pori yang diameternya lebih besar daripada diameter efektif linarut.
Walaupun bobot molekulnya sama, diameter efektifnya berbeda, dan komponen
yang diameternya paling besar akan terelusi lebih dahulu. Dengan
bertambah besarnya diameter linarut, jumlah pori yang dapat dimasuki
dan kemampuannya berdifusi dalam pori menurun. Jadi, jika linarut
berdiameter sedemikian rupa sehingga tidak dapat berdifusi ke dalam pori yang
mana pun, maka linarut tersebut dikatakan tereksklusi sempurna dan tidak
tertahan, artinya linarut tersebut terelusi dalam volume kolom Vo. Linarut yang
mampu berdifusi sempurna ke dalam semua pori dikatakan bermeasi sempurna
ke dalam kemasan. Linarut jenis ini memerlukan volume pelarut yang jauh lebih
besar untuk mengelusinya dari kolom. Pemisahan komponen dapat dicapai jika

komponen itu terelusi dengan volume tambat antara Vo dan volume permeasi
total. Volume kromatografi gel ada tiga komponen yaitu,
1. Volume mati (Vo), volume ruang antar partikel yang ditempati fase gerak yang
mengalir.
2. Volume yang ditempati oleh bagian padat kemasan.
3. Volume pori (Vp), volume yang ditempati fase gerak yang tertahan.
Koefisien distribusi (K) linarut merupakan jumlah volume pori yang dapat
dimasuki linarut (VA) dan volume pori total (Vp), yaitu :
K=

VA
Vp

Maka, volume linarut yang tertahan (VR) dinyatakan sebagai; VR = Vo + K.Vp,

rentang K antara 0 sampai 1, karena jika linarut diekslusi seluruhnya, maka K = 0
dan jika pelarut berpermeasi ke dalam pori seluruhnya maka K = 1. Maka untuk
memperoleh pemisahan yang semaksimum mungkin diperlukan Vo yang lebih
kecil dan Vp yang lebih besar.

Gambar 4. Skema Perjalanan Partikel

E. MEKANISME KERJA KROMATOGRAFI GEL

Peralatan penting yang biasanya digunakan pada kromatografi gel, antara

lain pompa untuk mempertahankan aliran yang konstan, kolom dengan jenis
molekul tertentu, dan detektor untuk hasil yang kuantitatif.
Buffer dipompa melalui kolom oleh alat yang diatur oleh computer. Saat
campuran molekul dan ion-ion yang terlarut dalam pelarut diaplikasikan pada
ujung atas kolom, molekul-molekul yang lebih kecil (dan ion) didistribusikan
melalui volume pelarut yang lebih besar daripada yang tersedia untuk molekul
besar. Molekul yang lebih kecil dari ukuran pori dapat masuk ke dalam partikel
dan karenanya memiliki jalur yang lebih panjang serta waktu transit yang lebih
panjang dibandingkan molekul besar yang tidak dapat memasuki partikel. Seluruh
molekul yang lebih besar ukurannya dibandingkan ukuran yang tidak tertahan dan
akan dielusi bersamaan. Molekul yang dapat masuk ke dalam pori akan memiliki
waktu tinggal rata-rata dalam partikel, yang bergantung dari bentuk serta ukuran
molekulnya. Karena itu, molekul besar bergerak lebih cepat melewati kolom, dan
dengan inilah campuran tersebut dapat dipisahkan menjadi komponenkomponennya.

Gambar 5. Pemisahan kromatografi gel untuk dua ukuran makromolekul : (1).

Campuran sampel sebelum memasuki colomn packing; (2). Campuran sampel
pada bagian atas kolom; (3). Pemisahan ukuran dimulai; (4). Hasil akhir
BAB II
SISTEM PERALATAN

I. FASE DIAM
Pemisahan dalam kromatografi gel sebagian besar ditentukan oleh jenis fasa
diam yang digunakan. Oleh karena itu, pemilihan gel atau fasa diam untuk suatu
pemisahan merupakan langkah penting.
Fasa diam yang banyak digunakan untuk kromatografi gel diberikan pada tabel di
bawah ini. Bahan ini digunakan untuk ukuran pori berbeda-beda setiap ukuran
cocok untuk pemisahan senyawa tertentu berdasarkan berat molekulnya.
Kebanyakan dengan kromatografi permeasi gel digunakan fasa diam polistirena
berpori yang mempunyai ikatan silang divinil benzene. Poragel dan Bio-Bead
dapat untuk memisahkan senyawa yang relative kecil sampai dengan molekul
sekitar 20.000. Styragel untuk memisahkan senyawa besar dengan berat molekul
20 juta. Gel vinil asetat berpori serupa dengan gel polistirena, tetapi untuk
senyawa dengan berat molekul rendah. Merckogels berpori kecil lebih baik
digunakan untuk pemisahan senyawa dengan berat molekul kurang dari 2000 dan
yang kurang dari sejuta.
Tabel 1
Fasa diam untuk kromatografi gel
Kromatografi permeasi gel (pelarut organik)
Polistirena
Poragel, Styragel
Bio-Bead-S
Gel vinil asetat
Merckogel-OR
Silika atau gelas berpori
Porasil
Bio-Glas
Merckogel-Si
Filtrasi gel (pelarut air)
Agak kaku (berat molekul rendah)
Sephadex

Waters
Bio-Rad Labs
E-Merck, EM Labs
Water
Bio-Rad Labs
E-Merck, EM Labs

Pharmacia

Bio-Gel-P
Tidak kaku
Spharose
Bio Gia-A
Gel untuk penggunaan khusus
Silika atau gelas berpori
Porasil deaktivasi
Aquapak

Bio-Rad Labs
Pharmacia
Bio-Rad Labs

Waters
Waters

Kromatografi permeasi gel dengan pelarut orgnik juga dapat dikerjakan dengan
fasa diam kaku dari silica atau gelas berpori. Bahan ini lebih stabil daripada gel
organic dan pengisian kolom pun lebih mudah. Tetapi kerap kali memberikan
retensi yang jelek karena terjadi serapan oleh permukaan silika.
Filtrasi gel dalam pelarut berair paling banyak dilakukan dengan gel yang agak
kaku atau yang tidak kaku. Senyawa dengan berat gel sampai beberapa ratus ribu
dapat dipisahkan dengan Sephadex atau Bio-Gel-P. Sephadex adalah dekstran
berikatan silang, sedangkan Bio-Gel-P adalah suatu poliakril amida berikatan
silang. Gel berpori kecil dari jenis ini digunakan untuk senyawa dengan berat
molekul sampai beberapa ribu, dengan tekanan kolom sampai 100-200 psi, tidak
lebih dari itu. Sepharosa dan Bio-Gia-A terdiri dari agarosa, suatu
poligalaktopiranosa. Ukuran pori ditentukan oleh kadar agarosa. Senyawa
dengan berat molekul antara 104-108 dapat dipisahkan pada gel agarosa, tetapi
dengan tekanan rendah (0,5 psi) untuk gel berpori besar.
II. FASE GERAK
Dalam kromatografi gel, tidak seperti pada metode kromatografi cairan lainnya,
fasa gerak tidak diubah-ubah untuk mengatur resolusi. Fasa gerak dipilih dengan
kekentalan rendah pada suhu pemisahan (supaya harga N tinggi) dan untuk
melaruutkan cuplikan. Fasa gerak dengan kekentalan rendah itu mempunyai titik

didih sekitar 25-50oC di atas suhu kolom. Jika cuplikan sukar larut, fasa gerak
dipilih supaya dapat melarutkan cuplikan.
Pengaruh fasa gerak pada fasa diam yang tidak kaku untuk kromatografi gel
harus dipertimbangkan. Dalam filtrasi gel, harus ditambahkan garam pada fasa
gerak untuk menjaga kekuatan ion supaya tetap. Sebaliknya perjalanan ion
cuplikan melewati fasa diam dapat menyebabkan penyusutan gel dan penurunan
permeabiliitas kolom. Berbagai gel untuk kromatoografi gel dapat tahan terhadap
berbagai pelarut organic, tetapi ada pengecualian pada aseton dan alcohol tidak
boleh digunakan dengan fasa diam polistirena.
Fase gerak dalam kromatografi gel harus merupakan polimer yang baik untuk
menghindari efek noneksklusi. Sampel harus terdisolusi pada suhu yang sesuai
dan bertahan cukup lama sebelum akhirnya disuntikkan. Hal tersebut bertujuan
agar pelipatan dapat mengembang dalam fase gerak atau dengan kata lain
memecahkan agregat. Bila sampel hanya terlarut dalam fase gerak, mmaka dapat
terjadi peningkatan tekanan pada kolom karena ukuran partikel yang terlalu
besar. Efek tersebut dapat diatasi dengan cara; 1) memilih pelarut lain, atau 2)
meningkatkan temperature kolom. Pada beberapa kondisi, perlu adanya
penambahan elekttrolit agar terjadi disagregasi. Beberapa polimer, seperti
polyolefin, biasa digunakan untuk analisis pada suhu tinggi (140-150oC). bila
analisis dilakukan pada kondisi tersebut, maka fase gerak bersifat toksik tidak
dapat digunakan (contoh; triklorobenzene), sehingga perlu dipilih fase gerak
yang lain. Fase gerak dalam kromatografi gel terbagi menjadi dua bagian besar,
yaitu :
1. Fase gerak kromatografi gel untuk protein dan polimer larut air, dan
2. Fase gerak kromatografi gel untuk polimer polar dan polimer larut dalam
pelarut organic.

Gambar 5. Sistem peralatan kromatografi gel

Peralatan penting yang biasa digunakan pada kromatografi gel antara lain pompa
untuk mempertahankan aliran yang konstan, kolom dengan jenis molekul tertentu,
dan detector untuk hasil yang kuantitatif.

Gambar 6. Skematis dari system kromatografi gel

BAB III
APLIKASI
Kromatografi ekslusi atau filtrasi gel digunakan untuk memurnikan protein/enzim
berdasarkan ukuran molekulnya. Pemisahan dicapai dengan menggunakan matriks
berpori, misalnya Sephacryl S-300 HR; dimana molekul, memiliki tingkat akses

yang berbeda. Molekul yang lebih kecil memiliki akses yang lebih besar dan molekul
yang lebih besar tidak termasuk dalam matriks. Oleh karena itu, protein dielusi dari
kolom filtrasi gel berdasarkan urutan ukuran (Shibahara et al., 1985). Berat molekul
dan bentuk tiga dimensi berkontribusi pada waktu retensi dalam kolom.
Protein dapat dipisahkan sehubungan dengan ukuran pada kolom filtrasi gel. Dengan
memilih porositas media filtrasi, protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran. Dasar
untuk jenis pemisahan adalah bahwa molekul (dalam hal ini adalah protein) akan
berdifusi ke dalam pori-pori butiran-butiran gelas. Ukuran molekul yang berbeda
akan tertunda dengan waktu yang berbeda. Idealnya, molekul kecil berdifusi ke dalam
fase diam; sehingga akan dielusi lebih lambat dari molekul besar. Molekul besar akan
berpindah tanpa hambatan melalui kolom, terutama jika tidak bisa masuk ke pori-pori
kolom. Molekul muncul dari kolom urutan penurunan berdasarkan berat molekul.
Bila menggunakan filtrasi gel itu sangat penting untuk memiliki volume sampel kecil
dan solusi terkonsentrasi.
Kromatografi untuk analisa karakteristik enzim dan derivate enzim yaitu alkali
fosfatase. Alkaline fosfatase merupakan metalloenzyme, yang menghidrolisis
nonspesifik fosfat monoester.