Senyawa Alam Metabolit Sekunder Azis PDF

SENYAWA ALAM
METABOLIT SEKUNDER
TEORI, KONSEP DAN TEKNIK PEMURNIAN
ii
UU No 19 Tahun 2002 Tentang Hak Cipta
Fungsi dan Sifat hak Cipta Pasal 2

1. Hak Cipta merupakan hak eksklusif bagi pencipta atau pemegang Hak
Cipta untuk mengumumkan atau memperbanyak ciptaannya, yang
timbul secara otomatis setelah suatu ciptaan dilahirkan tanpa
mengurangi pembatasan menurut peraturan perundang-undangan yang
berlaku.
Hak Terkait Pasal 49

1. Pelaku memiliki hak eksklusif untuk memberikan izin atau melarang
pihak lain yang tanpa persetujuannya membuat, memperbanyak, atau
menyiarkan rekaman suara dan/atau gambar pertunjukannya.
Sanksi Pelanggaran Pasal 72

1. Barangsiapa dengan sengaja dan tanpa hak melakukan perbuatan
sebagaimana dimaksud dalam pasal 2 ayat (1) atau pasal 49 ayat (2)
dipidana dengan pidana penjara masing-masing paling singkat 1 (satu)
bulan dan/atau denda paling sedikit Rp 1.000.000,00 (satu juta rupiah),
atau pidana penjara paling lama 7 (tujuh) tahun dan/atau denda paling
banyak Rp 5.000.000.000,00 (lima miliar rupiah).
2. Barangsiapa dengan sengaja menyiarkan, memamerkan, mengedarkan,
atau menjual kepada umum suatu ciptaan atau barang hasil pelanggaran
Hak Cipta sebagaimana dimaksud dalam ayat (1), dipidana dengan
pidana penjara paling lama 5 (lima) tahun dan/atau denda paling banyak
Rp 500.000.000,00 (lima ratus juta rupiah)
iii
Azis Saifudin, Ph.D., Apt.
SENYAWA ALAM
METABOLIT SEKUNDER
TEORI, KONSEP DAN TEKNIK PEMURNIAN
iv
Jl. Elang 6, No 3, Drono, Sardonoharjo, Ngaglik, Sleman
Jl.Kaliurang Km.9,3 Yogyakarta 55581
Telp/Faks: (0274) 4533427
Hotline: 0838-2316-8088
Website: www.deepublish.co.id
E-mail: deepublish@ymail.com
Katalog Dalam Terbitan (KDT)
SAIFUDIN, Azis
Senyawa Alam Metabolit Sekunder Teori, Konsep, dan Teknik
Pemurnian/oleh Azis Saifudin.--Ed.1, Cet. 1--Yogyakarta:
Deepublish, November 2014.
vii, 113 hlm.; 25 cm
ISBN 978-602-280-472-7
1. Senyawa I. Judul
546
Desain cover : Unggul Pebri Hastanto

Penata letak : Rizky Selvasari
PENERBIT DEEPUBLISH
(Grup Penerbitan CV BUDI UTAMA)
Anggota IKAPI (076/DIY/2012)
Isi diluar tanggungjawab percetakan

Hak cipta dilindungi undang-undang
Dilarang keras menerjemahkan, memfotokopi, atau
memperbanyak sebagian atau seluruh isi buku ini
tanpa izin tertulis dari Penerbit.
v
KATA PENGANTAR
Pembelajaran ilmu bahan obat alam atau farmakognosi di

perguruan tinggi perlu dipikirkan ulang dan redidesain agar lebih
fundamental secara sains, integratif dengan ilmu terkait dan fleksibel
untuk membekali mahasiswa agar bisa berinteraksi dengan
penemuan terbaru dan berpikir lintas bidang/interdisipliner.
Sedangkan pelajaran fitokimia di farmasi yang selama ini terkesan
berdiri sendiri perlu dikembalikan ke induk aslinya yakni
farmakognosi. Dan farmakognosi dipertajam dengan kimia bahan
alam (natural product chemistry). Buku ini menggunakan jembatan
aspek kimia organik sebagai dasar dan bingkai pembahasan
farmakognosi. Di dalam buku ini dipaparkan teori dasar metabolit
sekunder, teknik isolasi dengan interface aspek farmakologi.
Beberapa konsiderasi akan inkonsistensi pola yang lazim dijumpai
pada pekerjaan metabolit ini juga dipaparkan, termasuk beberapa
problematika terkait kontroversi metabolit sekunder.
Semoga buku sederhana ini ikut memberikan bekal dan
menambah dasar keilmuan para mahasiswa yang kelak di masa
depan berpartisipasi mengelola kekayaan alam Indonesia. Penulis
berharap buku sederhana ini bermanfaat kepada para peneliti,
mahasiswa tingkat sarjana atau pasca sarjana untuk mendukung riset
bidang senyawa alami, metabolit sekunder. Bagi penulis dan
keluarga semoga menjadi amal kebaikan.
Terima kasih saya ucapkan kepada para guru, senpai dan
kolega yang memberikan bimbingan dan sharing akademik maupun
kehidupan sosial.
Akhirnya terima kasih disampaikan kepada ibu dan bapak
penulis, istri tercinta Anggrek Sekar, wonderful kids Nabilah, Kiki,
dan Ubay yang memberikan inspirasi serta semangat.
Solo, 2014
Penulis
vi
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ................................................................... vi

DAFTAR ISI .............................................................................. vii
BAB I PERAN BAHAN ALAM DALAM PENEMUAN
MOLEKUL OBAT ........................................................... 1
BAB II BIOSINTESIS DAN PENGGOLONGAN
METABOLIT SEKUNDER ............................................. 10
BAB III KELARUTAN METABOLIT SEKUNDER DAN
PEMILIHAN PELARUT .................................................35
BAB IV EKSTRAKSI, FRAKSINASI, DAN PURIFIKASI .................39
BAB V BIOASSAY/UJI BIOAKTIFITAS/UJI
FARMAKOLOGI (BIOASSAY GUIDED
FRACTIONATION) .....................................................69
BAB VI SKALING UP DAN DEREPLIKASI ..................................74
BAB VII EFEK SINERGISME, KOMPLEMENTER, DAN EFEK
PLAUSIBLE ...................................................................76
BAB VIII SENYAWA TARGET BERSIFAT POLAR (SANGAT
LARUT DALAM AIR ATAU METANOL) .......................78
BAB IX PENENTUAN STRUKTUR/ELUSIDASI STRUKTUR .......84
BAB X ELUSIDASI STRUKTUR BEBERAPA SPEKTRA
METABOLIT SEKUNDER ............................................. 91
REFERENSI ............................................................................. 103
GLOSARIUM .......................................................................... 105
INDEKS ................................................................................... 110
BIODATA PENULIS .................................................................. 113
vii
BAB I
PERAN BAHAN ALAM DALAM PENEMUAN MOLEKUL OBAT
Target belajar: Pembaca memahami secara fundamental peran bahan

alam sebagai sumber molekul aktif farmakologis. Memahami posisi
farmakognosi dalam rumpun ilmu kefarmasian. Memahami peran
penting kimia organik sebagai jembatan memahami senyawa aktif
dari bahan alam.
Obat berdasarkan besar molekulnya dibagi menjadi dua yakni

mikromolekul dan makromolekul.
HO O
O OH O
O
OH O
O
H
O O O
O O OH O O H H
H
O
OH
H2N O
Daunorubisin Artemisinin Lovastatin /statin

(anti kanker payudara) (anti malaria) (anti kolesterol)
N OH
O
O HO
O
N
O
OCH3 N NH O
O
O
H3CO HO
O O O
OH
N O OH
H
O OH O O
OCH3
Vinblastin (anti leukemia) Taxol (anti berbagai kanker)
Gambar 1.1. Contoh kisah sukses molekul alam. Senyawa-senyawa

tersebut diresepkan di klinik. Molekul-molekul ini
dimurnikan dari tumbuhan dan mikroba tanpa
modifikasi apapun. Statin adalah golongan obat yang
memiliki share market terbesar di dunia.
Metabolit Sekunder/Azis Saifudin|1

Obat Mikromolekul
Berat molekul obat golongan ini antara 100-1000 Dalton.
Molekul kecil ini kebanyakan diformulasikan dalam bentuk tablet,
kapsul, salep, sirup, serbuk, dan sejenisnya yang sangat mudah
dijumpai di apotek atau toko obat. Mikromolekul diperoleh dengan
cara sintesis total atau parsial dan dengan cara pemurnian dari
tumbuhan, bakteri, jamur.
Obat yang dibuat dari mikromolekul selama proses ekstraksi
dari bahan alam atau sintesisnya memerlukan bantuan pelarut
organik yakni metanol, etanol (alkohol), kloroform, heksana, aseton,
dan etanol dan lain-lain. Lebih dari 90% lebih molekul jenis
ini tidak larut air.
Obat Makromolekul
Kebanyakan obat makromolekul berupa protein dan
polisakarida. Produk ini berbagai vaksin dan produk imunologi.
Berat molekul golongan ini mayoritas lebih dari 1000 Dalton dan
memiliki kelarutan dalam buffer air. Kebanyakan protein merupakan
produk bioteknologi yang dihasilkan dengan rekayasa genetika
dengan bantuan mikrobia. Demikian pula produk obat protein dan
vaksin ini disiapkan dan disimpan dalam buffer.
Makromolekul diperoleh dengan cara ekstraksi serum
binatang, fermentasi bakteri atau jamur. Sifat obat makromolekul
larut dalam air atau buffer.
Baik mikromolekul kebanyakan merupakan produk alam.
Sedangkan makromolekul dihasilkan dari proses fermentasi/
bioteknologi.
Sejak kehidupan manusia pertama Nabi Adam AS hingga detik
ini manusia memanfaatkan bahan alam untuk hidup. Untuk
mendukung kehidupan: kelahiran, pertumbuhan, makan, minum,
pakaian, papan, keindahan, seni, beragama, dan kematian manusia
tidak bisa terlepas dari bahan alam. Kesemua aspek kehidupan
tersebut manusia sangat tergantung dengan zat alami yang dihasilkan
oleh makhluk hidup lain. Dari sisi makhluk produsen, senyawa alami
ada yang digunakan sebagai zat esensial untuk hidup dan ada zat
yang sekedar untuk mendukung kehidupan. Zat esensial untuk hidup
2 |Metaboli t Sekunder/ Azis Sa ifud in

digunakan untuk dasar-dasar kehidupan: tumbuh, berkembang, dan
bereproduksi. Sedangkan zat pendukung kehidupaan digunakan
sebagai zat pertahanan dari gangguan makhluk lain, menarik
(attractant) makhluk lain, dan alelopat untuk mendominasi suatu
kawasan, menetralkan racun, dll.
Senyawa alami secara umum adalah molekul kimia berupa
mineral, metabolit primer, dan metabolit sekunder. Secara famili
besar, metabolit primer dan metabolit sekunder adalah senyawa
organik.
Bahan alam dibedakan menjadi dua berdasarkan fungsi
terhadap makhluk hidup pembuatnya yakni:
1. Metabolit primer
2. Metabolit sekunder
Metabolit sekunder adalah senyawa yang disintesis oleh
makhluk tumbuhan, mikrobia atau hewan melewati proses
biosintesis yang digunakan untuk menunjang kehidupan namun tidak
vital (jika tidak ada tidak mati) sebagaimana gula, asam amino dan
asam lemak. Metabolit ini memiliki aktifitas farmakologi dan biologi.
Di bidang farmasi secara khusus, metabolit sekunder digunakan dan
dipelajari sebagai kandidat obat atau senyawa penuntun ( lead
compound) untuk melakukan optimasi agar diperoleh senyawa yang
lebih poten dengan toksisitas minimal (hit).
Metabolit Primer
Memiliki ciri:
Esensial untuk hidup: pertumbuhan normal, perkembangan dan
reproduksi. Berupa enzim fisiologis, menghasilkan energi misalnya
karbohidrat.
Terlibat langsung dalam fungsi fisiologis normal: protein dan
enzim
Terdapat di dalam organisme atau sel.
Dikenal dengan istilah metabolit sentral.
Berat molekul (BM) dari kecil dalam bentuk monomer hingga
sangat besar polimer ( > 1500 Dalton).
Contoh: glukosa, asam organik sederhana, asam lemak,
protein, hormon, enzim adalah metabolit primer.

Metabolit Sekunder
Memiliki ciri:
Tidak terlibat langsung dalam metabolism/kehidupan dasar:
pertumbuhan, perkembangan dan reproduksi.
Tidak esensial, ketiadaan jangka pendek tidak berakibat
kematian. Ketiadaan jangka panjang mengakibatkan
kelemahan dalam pertahanan diri, survival, estetika, menarik
serangga.
Golongan metabolit sekunder distribusi hanya pada spesies
pada filogenetik /familia tertentu.
Seringkali berperan di dalam pertahanan terhadap musuh.
Senyawa organik dengan berat molekul 50-1500 Dalton.
Sehingga disebut mikro molekul.
Penggolongan utama: terpenoid, fenil propanoid, poliketida,
dan alkaloid adalah metabolit sekunder.
Pemanfaatan oleh manusia: untuk obat, parfum, aroma,
bumbu, bahan rekreasi dan relaksasi.
Mikroba dan tumbuhan baik darat maupun laut merupakan
salah satu sumber utama bahan obat. Berbagai obat penting yang
diresepkan di dalam terapi klinik seperti antibiotik, statin, vinkristin,
taksol didapatkan dengan pemurnian dari sumber alami yakni
mikroba dan tetumbuhan. Demikian halnya beberapa jenis-jenis
senyawa yang berpotensi sebagai agen promosi kesehatan seperti
katekin, genistein, flavonoid, stilebenoid, dan lain-lain juga diisolasi
dari bahan alam, baik dari mikroba, tumbuhan, jamur maupun
sarang serangga seperti propolis (sarang lebah) atau pun sarang
semut.

4.4% Molekul alam
Modifikasi molekul alam
22.1%
0.4% Fitofarmaka
52.4%
14.9% Peptida
Vaksin
5.9%
Sintesis
Gambar 1.2. Dari 1355 obat yang digunakan di klinik pada rentang
tahun 1981-2010, hanya 4.4% molekul alami langsung
sebagai obat dan 0.4% ekstrak, namun sekitar 48% obat-
obatan lain diperoleh dengan modifikasi molekul alami,
atau berupa vaksin. (Diadaptasi dari Newman et al, 2012
Journal of Natural Products).
Pada rentang tahun 1981-2010, 4.4% dari 1355 buah obat-

obatan yang beredar berasal dari pemurnian bahan alam dan 0.4%
ekstrak da 43% merupakan senyawa alami yang dimodifikasi
(Newman, Cragg, and Snader, 2012). Terkhusus pada area obat
kanker, 74% obat yang digunakan secara klinik berasal dari ekstraksi
senyawa alami atau modifikasi senyawa alami. Jika digabungkan
dengan senyawa tiruan (mimick), vaksin, ekstrak maka kontribusi
bahan alam dalam penyediaan bahan obat lebih dari 50%. Dengan
demikian tampak sekali peran metabolit sekunder di dalam
penyediaan obat.
Perlu dicatat dengan baik-baik dan ditekankan di sini, bahwa
pemurnian molekul dari bahan alam bukanlah pekerjaan final dan
langsung bisa digunakan obat akan tetapi masih dan perlu langkah
lain. Jadi hanya sekitar 5% senyawa yang dihasilkan ekstraksi
langsung bisa digunakan untuk obat, kebanyakan menemukan
senyawa model untuk disintesis atau dimodifikasi lebih lanjut.
Farmakognosi
Farmakognosi berasal dari kata Yunani Pharmakon (obat) dan
gnosis (pengetahuan), yakni pengetahuan tentang bahan obat. Secara

khusus farmakognosi adalah salah satu rumpun ilmu farmasi yang
mempelajari sumber bahan obat yang berasal dari bahan alami
(tumbuhan, mikroba, sarang, mineral dan hewan). Jadi awal mula
farmakognosi mempelajari bahan mentah obat atau crude drug.
Di waktu lampu (.-1800 M) ketika ilmu kimia organik belum
berkembang farmakognosi berforkus melakukan identifikasi spesies
tanaman, klasifikasi taksonomi, mempelajari morfologi dan
penggunaan bahan-bahan alami untuk pengobatan penyakit.
Tonggak sejarah farmakognosi modern dimulai dengan pemurnian
molekul tunggal dari tanaman.
Gambar 1.2 Morfin senyawa organik pertama dimurnikan oleh Fredrick

Serturner (Merck GmBH) dari kuncup bunga Papver
somniverum. Hingga hari ini masih digunakan di klinik
untuk analgetik umum.
Kelahiran farmakognosi modern (farmakognosi kimiawi)

dimulai dengan pemurnian molekul morfin (analgetik) oleh Friedrich
Sertuner pada tahun 1804 dari kuncup bunga (poppy) Papaver
somniverum dan dikomersialkan oleh pabrik farmasi Jerman, Merck.
Selanjutnya isolasi morfin itu memberikan ide ilmuwan modern lain
untuk melakukan pekerjaan pemurnian molekul-molekul lain dari
bahan alam yang mungkin digunakan untuk obat seperti:
Striknin (pestisida hewan Nikotin (stimulant)
kecil)
Kuinin (anti malaria kuno) Atropin (relaksan otot polos)
Kafein (stimulant) dan Kokain (stimulan penekan
lapar, halusinogen)

Dengan ribuan spesies hayati tumbuhan tingkat tinggi,
mikroba, jamur, bakteri adalah sumber molekul-molekul penting
untuk kehidupan manusia dan lingkungan. Dengan ditemukan
metode kromatografi dan spektroskopi, farmakognosi memulai
babak baru yakni fokus dengan aspek pemurnian senyawa organik
tunggal. Jadi dalam farmakogos modern, kimiawi organik bukan
sekedar aspek lagi melainkan menjadi paradigma farmakognosi
modern. ScFinder, suatu portal kimia, ratusan ribu senyawa telah
ditemukan hingga kini dan ratusan senyawa baru ditemukan setiap
tahun. Senyawa tersebut diteliti dan dipelajari sebagai kandidat obat.
Jadi di dalam farmasi modern metabolit sekunder merupakan
sumber molekul obat. Pada kimia medisinal, metabolit sekunder
tersebut dipelajari dan diteliti untuk digunakan sebagai kandidat obat
modern. Di tingkat perguruan tinggi dan pasca sarjana metabolit
sekunder dijadikan sebagai obyek pembelajaran secara khusus karena
beberapa pertimbangan:
1. Aspek farmakologi: keanekaragaman struktur kimia metabolit
sekunder yang tinggi mengindikasikan potensi keragaman efek
farmakologinya dan merupakan sumber kandidat senyawa
obat yang tidak terbatas.
2. Stabilitas: molekul kecil memiliki stabilitas lebih tinggi
dibandingkan makromolekul. Makromolekul baik polisakarida
maupun protein rawan terhadap berbagai reaksi perusak.
Misalnya hidrolisis yang menyebabkan struktur pecah.
3. Aspek kimia medisinal dan teknologi pemisahan: senyawa
metabolit sekunder cenderung bersifat semipolar sehingga lebih
mudah berinteraksi atau melewati barrier/jaringan biologis.
Kimia medisinal secara praksis membangun paradigma berpikir
kompromis antara struktur senyawa obat dan aktifitas
farmakologis, pertimbangan polaritas obat terhadap
kemampuan menembus barrier jaringan dan sel. Dalam
prakteknya, aspek teknologi pemisahan juga menjadi unsur
penting kimia medisinal. Senyawa yang bersifat semi polar
lebih mudah dipisahkan dan dimurnikan dengan teknologi
kromatografi yang dikembangkan saat ini (silika, ODS,
sephadex).

4. Aspek farmasetik dan teknologi farmasi: berat molekul yang
kecil memungkinkan takaran dosis yang kecil dan lebih bisa
diterima (acceptable) untuk manusia dan hewan. Berat
molekul kecil lebih fleksibel terkait bentuk sediaan yang akan
diformulasi obat (tablet, kapsul, powder, injeksi), lebih
kompromis dan harmonis dengan pilihan bahan
pengisi/pembantu. Aspek teknologi farmasi: konsekuensi dari
poin 3, bobot molekul yang kecil lebih mudah, efisien dan
ekonomis dalam proses produksi di industri farmasi. Begitu
juga terkait dengan wadah dan pengepak juga lebih
ekonomis.
5. Aspek struktur: struktur senyawa aktif farmakologis seringkali
berstruktur kompleks dengan cukup banyak kiralitas (orientasi
letak gugus dalam 3 dimensi). Metode sintesis seringkali
menghasilkan campuran rasemis dan memiliki tahapan panjang
dilakukan untuk menghasilkan senyawa berstruktur kompleks.
Sehingga ekstraksi dan pemurnian masih merupakan jalan
paling ekonomis dan efisien terkhusus untuk senyawa
berstruktur rumit tersebut.
Pertanyaan
1. Apa keuntungan metabolit sekunder jika digunakan sebagai
bahan baku obat dibandingkan dengan molekul-molekul
besar?
2. Bandingkan sifat metabolit sekunder pula terhadap senyawa-
senyawa yang sangat mudah larut air? dapatkan Anda
memikirkan kelemahannya?

Tumbuhan, bakteri, jamur,
dan hewan
Ekstrak aktif, gubal, Kimia Organik (termasuk

crude drug Farmakognosi Fitokimia)
Molekul Kimia medisinal
Kimia sintesis
Molekul semi
Standardisasi dan kontrol Farmakologi alami
kualitas (kimia analisis)
Molekul
Sintesis
Farmasetika
Tablet, serbuk, kaplet, sirup dll
Gambar 1.4 diagram Kedudukan farmakognosi di dalam eksplorasi

material aktif.

BAB II
BIOSINTESIS DAN PENGGOLONGAN METABOLIT
SEKUNDER
Target Pembelajaran: Pembaca ditargetkan mampu membedakan

golongan terpenoid, poliketida, fenil propanoid, alkaloid atau
campuran berdasarkan kerangka kimia yang diberikan. Mampu
menyebutkan jalur biosintesis dan tahapan umum di dalam jalur
biosintesis terpenoid, poliketida dan fenil propanoid. Sedangkan
metode klasik dengan reagen tertentu bersifat dekstruktif sehingga
sudah mulai ditinggalkan. (Untuk pembaca tingkat master
diharapkan mampu memperkirakan golongan metabolit sekunder
berdasarkan clue spektra NMR).
Jika manusia dibekali akal budi dan gerak pindah koordinasi

tubuh, makhluk hidup selain manusia dibekali oleh Allah SWT untuk
menghasilkan senyawa metabolit sebagai alat untuk survival
mendukung kehidupan mereka. Misal alkaloid sebagai senyawa
pertahanan dari musuh dan hama, flavonoid senyawa penghias,
senyawa pewarna, terpenoid sebagai atraktan atau penarik, atau
polifenol dalam rangka menetralkan senyawa beracun.
Kenyataannya manusia manusia juga menghasilkan metabolit
kategori alkaloid. Berbagai neurotransmitter adalah alkaloid. Tanpa
alkaloid endogen hidup manusia cacat dan tidak sempurna.
Pembahasan khusus ada di golongan alkaloid.
Sifat-sifat kimiawi metabolit sekunder tersebut umumnya
memiliki berat molekul yang kecil (antara 50-1500 Dalton),
umumnya tidak larut air karena bersifat semi polar, dan struktur
kimianya sangat beragam, jika saling bersenyawa jarang membentuk
molekul besar.
Gambar 2.1 Glukosinolat salah satu senyawa untuk senjata pertahanan

tumbuhan dari serangan virus, bakteri dan jamur.
10 | M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n
Selain melakukan biosintesis sekunder, makhluk hidup
melakukan biosintesis primer sebagai proses kimiawi vital untuk
dasar untuk melakukan aktifitas hidup. Biosintesis ini dilakukan untuk
menghasilkan senyawa-senyawa esensial dan dasar reaksi-reaksi
kehidupan misalnya gula (karbohidrat) untuk menghasilkan energi,
asam amino untuk membangun jaringan dan biokatalis, asam lemak
untuk membangun dinding sel dan cadangan energi. Tanpa
metabolit primer ini dasar-dasar hayati tidak ada dan metabolit
sekunder juga tidak bisa diproduksi.
Metabolit primer terdiri dari 3 golongan utama yakni
karbohidrat, protein dan lemak. Glukosa esensial untuk
menghasilkan energi, asam amino vital untuk menghasilkan berbagai
hormon dan neuro transmitter, lemak untuk membangun jaringan.
Setiap metabolit primer ini akan bersenyawa membentuk polimer
atau ikatan yang lebih kompleks membentuk jaringan tubuh.
Jaringan otot tersusun dari pensenyawaan kompleks protein, dinding
sel tumbuhan atau cangkang binatang dibentuk dari persenyawaan
antar karbohidrat, jaringan lemak disusun oleh persenyawaan lemak.
Antar metabolit primer ini juga akan saling membentuk
persenyawaan dalam membangun sel-sel dan jaringan kemudian
organ.
Adapun sifat-sifat kimiawi metabolit primer, memiliki berat
molekul kecil mulai dari 80-300 Dalton/amu, larut dalam air (gula
dan asam amino) atau tidak larut air misalnya asam lemak, jika saling
berikatan membentuk senyawa dengan berat molekul sangat besar
(BM >1000-100.000 d). Secara farmakologis, senyawa metabolit
sekunder memiiliki berbagai aktifitas biologis: anti bakteri, anti
infeksi, anti kolesterol, anti kanker, anti diabetes dll.
Pertanyaan: apakah hubungan antara metabolit sekunder dengan
metabolit primer ?
Gambar 2.2 Glukosa, adalah metabolit primer untuk bahan energi

kehidupan dan darinya berbagai metabolit sekunder juga
berasal.
M e t a b o l i t S e k u n d e r / A z i s S a i f u d i n | 11
Karena metabolit sekunder berjumlah jutaan di alam dan akan
terus ditemukan ratusan senyawa baru setiap tahun maka tidak
mungkin seseorang bisa menghafalnya, walaupun setiap golongan
struktur. Diperlukan frame work dan metode berpikir yang mampu
mencakup garis besar metabolit sekunder. Untuk itu pemahaman
dasar-dasar biosintesis diperlukan.
Tujuan memahami biosintesis metabolit sekuder:
1. Senyawa di alam berjumlah jutaan dan tidak mungkin dihafal.
Setiap tahun ditemukan ratusan senyawa baru. Bahkan antar
senyawa satu sama lain membentuk senyawa yang lebih
kompleks. Biosintesis digunakan untuk membangun paradigma
berpikir dan meringkas keterhubungan antar senyawa.
2. Keteraturan pola struktur. Dengan memahami kerangka dan
jalur asal biosintesis suatu golongan senyawa bisa digunakan
untuk membantu menentukan struktur kimia. Inti kerangka
senyawa-senyawa metabolit sekunder memiliki keteraturan
pola dan memiliki bentuk yang seragam di dalam keragaman
sehingga penentuan struktur (elusidasi struktur) cukup terbantu
dengan pemahaman kerangka biosintesis.
3. Desain obat modern. Dengan memahami jalur biosintesis dan
mekanisme penyakit dimungkinkan desain obat (sintesis obat
dan QSAR (Quantitative-Structure Activity Relationship) atau
HKSA (Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas)) berdasarkan
pola interaksi penyakit dan target obat yang lebih selektif.
4. Aspek selektifitas. Terkait kondisi patologis (biokimiawi
penyakit), biosintesis terkait dengan berbagai mekanisme
penyakit dan pengobatan. Dengan memahami mekanisme dan
jalur biosintesis pembentukan senyawa penyebab penyakit
maka dimungkinkan memilih target, mengeblok atau
meminimalkan senyawa biologis penyebab penyakit. Misalnya
menurunkan jumlah kolesterol, merusakkan kapsul dari virus,
mengeblok protein penyebab diabetes, meminimalkan
pembentukan NO (nitrit) pada penyakit jantung atau
menyebabkan jejas kerusakan jaringan. Berbagai penyakit
masih menjadi misteri dan kini jalur biosintesis, pathway/ dan
jalur komunikasi sel menjadi topik penting di bidang
kedokteran dan pengobatan karena biosintesis seringkali terkait
dengan pembentukan agen degeneratif di dalam tubuh.
5. Aplikasi bioteknologi untuk produksi. Dengan diketahuinya
jalur biosintesis senyawa tertentu, melalui bioteknologi
kuantitas produk senyawa bermanfaat seperti obat yang
dihasilkan bisa dinaikkan. Jika senyawa kimia hanya bisa
dihasilkan dalam jumlah amat kecil misal taksol atau vinkristin
maka produksinya bisa ditingkatkan melalui potensi rekayasa
genetika atau manipulasi media fermentasi.
Berbagai mekanisme penyakit dan target obat baru ditemukan
dengan biosintesis, misalnya target biosintesis kolesterol, target enzim
pengganggu insulin, target penggangu asetil kolin pada Alzhaemers .
Ilmu biosintesis bukanlah ilmu yang mati dan statis namun berbagai
misteri besar kehidupan ada di dalamnya dan akan terus
berkembang dan ditemukan terutama di dunia biologi/kedokteran.
Untuk memahami dasar biosintesis metabolit sekunder maka
terlebih dahulu diperlukan beberapa istilah kunci:
1. Starting material: adalah senyawa sederhana yang biasanya
cukup stabil secara kimiawi dan menjadi bahan baku biosintesis
misalnya asam laktat glukosa, fruktosa, dan senyawa gula lain.
2. Prekursor: adalah senyawa yang terbentuk dari starting
material namun bukan produk akhir, seringkali prekursor ini
ditambahkan dari luar untuk meningkatkan produk. Prekursor
kebanyakan merupakan asam amino.
3. Biokatalis: sebagaimana pengertian katalis pada umumnya
namun katalis di dalam biosintesis secara khusus adalah enzim-
enzim pembantu reaksi.
4. Jalur biosintesis atau pathway: adalah rangkaian tahapan reaksi
perubahan starting material menjadi metabolit.
5. Produk: senyawa terakhir yang dihasilkan, yakni senyawa
senyawa poliketida (C2), terpenoid (C5), senyawa fenil
propanoid (C9) sebagai kerangka utama, senyawa alkaloid,
dan senyawa campuran.
Metabolit sekunder berasal dari biosintesis primer. Umumnya
starting material paling awal adalah senyawa metabolit primer
sederhana dan stabil secara kimia dan fisika, yakni gula.
Penelitian biosintesis di dalam laboratorium:
Media hidup yang digunakan adalah kultur sel tumbuhan, kultur
jamur, kultur bakteri atau tumbuhan utuh.
H2O +
CO2
O2 +
Eritrose 4-P
Glukosa
FOTOSINTESIS
L-fenilalanin,
tirosin, triptofan
(C9)
Asam
Sikimat
Berbagai asam amino

alifatik
Benzoik dan
fenolik (C7)
Turunan asetat
Dioksiselulosa (C5)
Turunan poliketida
Asetil-CoA (C2)
Asam mevalonat (C5)
Gambar 2.3 Alur biosintesis metabolit sekunder. Starting mula-mula
adalah air dan CO2 (fotosintesis) yang menunjukkan bahwa
fotosintesis adalah proses biokimiawi dasar yang mendasari
kehidupan. Dari fakta ini tampak sekali bahwa air adalah
starting material mula-mula semua makhluk hidup.
Dengan demikian berdasarkan jalur biosintesis, metabolit

sekunder digolongkan menjadi:
1. Golongan asetat (C2): poliketida dan asam lemak.
2. Golongan mevalonat dan deoksisilulosa (C5): terpenoid
3. Golongan sikimat: fenil matanoid (C7) dan fenil propanoid
(C9)
4. Golongan alkaloid
5. Golongan campuran: kombinasi antar metabolit sekunder atau
metabolit sekunder dengan metabolit primer.
Golongan senyawa poliketida dan asam lemak (C2)
Gambar 2.4 Tetrasiklin adalah antibiotik dihasilkan oleh biosintesis

asetat. Di tahap akhir mengalami aminasi
Senyawa C2 digolongkan menjadi 2 yakni golongan poliketida

dan turunan asam lemak. Asam asetat adalah building block dan
kerangka dasar golongan ini. Sehingga jumlah karbon golongan
metabolit sekunder ini berjumlah 2 dan kelipatannya (C2 x n).
Senyawa ini sangat luas distribusinya. Mulai dari makhluk jasad renik,
tumbuhan dan vertebrata menghasilkan senyawa golongan ini.
Berbagai golongan antibiotik, asam lemak, bahkan aflatoksin
penyebab hepatitis adalah senyawa-senyawa poliketida. C2 jika
membentuk struktur siklik maka ia menjadi poliketida dan jika
membentuk rantai alifatik panjang maka membentuk kerangka asam
lemak. Dengan demikian C2 berkontribusi membentuk metabolit
primer
Ciri-ciri senyawa poliketida adalah:

- Strukturnya tersusun dari rantai karbon dengan kelipatan 2
sehingga disebut C2, karena berasal dari starting material
asetat: nCH3CO2H -[CH2CO]n-. Adapun jumlah karbon
akhir bisa kehilangan 1 atau kelebihan bisa terjadi.
- Kadang membentuk cincin benzen aromatis
- Jika cincin benzen biasanya mengandung lebih dari satu gugus
hidroksil (-OH) atau alkoksi (-OR) maka gugu-gugus tersebut
akan berposisi meta satu sama lain.
Gambar 2.5 Posisi meta antara dua gugus alkoksi adalah salah
satu ciri khas dari senyawa golongan poliketida.
- Jika membentuk rantai panjang dan berakhiran dengan gugus

karboksilat maka disebut golongan asam lemak.
- Rantai panjang tersebut kadang mengalami siklisasi
Ciri sekunder:
- Semakin panjang rantai karbon maka semakin larut dalam
pelarut non polar, namun semakin banyak gugus hidroksil
maka kelarutan makin tinggi pada pelarut polar seperti
metanol.
Catatan: jumlah karbon di dalam struktur bisa kurang satu atau
kelebihan 1 ditoleransi dan tidak strict rumus C2, C5, C9.
Karena proses di alam oleh reaksi enzimatis.
- Diproduksi oleh hampir semua makhluk hidup, dari makhluk
tingkat rendah bakteri, alga, jamur, tumbuhan dan mamalia
hingga manusia.
Jalur biosintesis poliketida:
Gambar 2.6 Biosintesis golongan asam lemak dari starting material asam
asetat (C2)
Gambar 2.7 Mekanisme biosintesis golongan poliketida (diadaptasi dari

Dewick, 2006)
Identifikasi senyawa poliketida:
Secara kimiawi: dikarenakan beragam strukturnya, maka tidak ada
reagen khusus penciri golongan poliketida. Biasanya identifikasi
didasarkan pada reaksi gugus fungsional kemudian diidentifikasi
perubahan warna yang terjadi atau pergeseran pada panjang
gelombang tertentu. Contohnya jika bergugus fenolik maka potensial
dikopling dengan senyawa pengkelat sehingga larutan lebih gelap.
Sedangkan pencirian fisis dengan menggunakan lampu UV biasanya
akan memberikan pemadaman pada 254 nm dan warna tertentu
pada 366 nm. Jadi tidak terlalu spesifik. Walaupun reagen anilin bisa
mengidentifikasi cincin benzene namun akan bias dengan golongan
fenil propanoid. Untuk identifikasi modern penggunaan reagen
kimiawi destruktif era sekarang sudah dihindari
Untuk golongan asam lemak mudah dicirikan berdasarkan sifat fisis
yang meninggalkan noda semi transparan pada kertas. Di bawah
sinar UV asam lemak tidak memberikan pemadaman flouresensi.
Dengan spektra NMR: jika memiliki proton pada gugus aromatis
maka akan memberikan sinyal geseran kimia sekitar 6-8 ppm. Jika
mengadung proton rantai panjang karbon ikatan tunggal (-CH2-)
maka akan memberikan sinyal antara 1-2,8 ppm, beberapa
diantaranya overlap. Jika mengandung proton dengan ikatan ganda
maka akan menunjukkan peak sekitar 5-6,5 ppm.
Latihan:
Jelaskan mengapa senyawa-senyawa berikut disebut poliketida:
Golongan Senyawa Terpenoid (C5)
Gambar 2.8 Artemisinin adalah obat anti malaria yang diekstraksi dari
jamur Artemisinia annua, merupakan senyawa terpenoid.
Artemisinin menghambat pertumbuhan Plamodium
falciparum.
Terpenoid adalah senyawa yang tersusun dari kerangka

isopren (C5), yakni rantai beranggota lima karbon bercabang
(branching) metil pada karbon nomor 2 atau kelipatannya. Senyawa-
senyawa seskuiterpen (Zingiberaceae), asam ursolat yang terdapat
dalam berbagai tanaman dan bersifat penghambat kanker dan
menurunkan gula darah, asam betulinat yang tekandung dalam
berbagai tatanaman termasuk buah kayu putih yang bersifat
antidiabetes, azadiraktin dari biji mimba (Azadirachta indica) sebagai
pestisida, berbagai macam parfum dan aroma kebanyakan adalah
senyawa-senyawa terpenoid. Karotenoid dalam berbagai tanaman
sebagai pro vitamin A. Skualen suplemen kesehatan, bahkan
kolesterol yang jika kadarnya dalam tubuh berlebihan menyebabkan
penyakit jantung dan stroke adalah merupakan senyawa golongan
terpenoid.
Jalur Biosintesis
Isopentenil piropospat (IPP) atau dimetil alil piropospat
(DMAPP) adalah starting material paling awal dari terpenoid.
Jalur biosintesis terpenoid di mulai dari pembentukan
isopentenil piropospat (IPP) yakni isopren yang mengikat dua
buah pospat kemudian bergabung satu dengan yang lain dari
kepala-ekor membentuk monoterpen, seskuiterpen, diterpen,
triterpen dan seterusnya. Mengapa isoprene dalam reaksi ini
harus mengikat pospat ?.
Terdapat dua jalur biosintesis pembentuk terpenoid: 1 jalur
mevalonat dan 2. deoksiselulosa. Jalur biosintesis
deoksiselulosa adalah jalur biosintesis yang baru ditemukan.
Jalur deoksiselulosa ditandai lazim ada di dalam tumbuhan
atau bakteri, namun jarang terdapat di dalam makhluk
vertebrata termasuk manusia.
Minyak atsiri monoterpen dan seskuiterpen, steroid, kolesterol
merupakan senyawa terpenoid.
Apakah yang bisa Anda ambil pelajaran ?.
Dengan ketiadaaan atau tidak samanya jalur biosintesis
makhluk hidup, memungkinkan intervensi suatu obat cukup
selektif pada makhluk vertebrata.
Mekanisme pembentukan senyawa terpenoid:
Gambar 2.9 Dimetilalil piropospat (DMAPP) dan Isopentenil piropospat

(IPP) adalah starting material terpenoid. Terpenoid tersusun
dari rantai karbon tersebut atau kelipatannya.
Terdapat dua jalur biosintesis pembentuk terpenoid makhluk

hidup ada dua, yakni jalur mevalonat dan deoksiselulosa. Jalur
biosintesis deoksiselulosa adalah jalur biosintesis yang baru
ditemukan. Jalur deoksiselulosa lazim ada di dalam tumbuhan atau
mikroba namun jarang terdapat di dalam makhluk vertebrata
termasuk manusia.
Dengan ketiadaaan atau tidak samanya jalur biosintesis
makhluk hidup, memungkinkan intervensi suatu obat cukup selektif
pada makhluk vertebrata. Apakah yang bisa Anda ambil pelajaran?
Jalur biosintesis terpenoid dimulai dari pembentukan
isopentenil piropospat (IPP) atau dimetilalil piropospat (DMAPP)
yakni isopren yang mengikat dua buah pospat kemudian bergabung
satu dengan yang lain dari kepala-ekor membentuk monoterpen,
seskuiterpen, diterpen, triterpen dan seterusnya. Isoprene adalah unit
pembangun terpenoid bukan merupkan starting material paling awal
dari terpenoid. Mengapa isoprene dalam reaksi ini harus mengikat
pospat? Meskipun DMAPP dan IPP memiliki ikatan ganda namun
electron namun tidak terlalu reaktif untuk bereaksi dengan molekul
sejenis.
Gambar 2.10 Diagram skematik terbentuknya golongan terpenoid
Ciri-ciri senyawa terpenoid adalah:

1. Jumlah rantai atom karbon di dalam kerangka sebanyak 5 atau
kelipatannya. Sehingga disebut senyawa golongan C5.
2. Seringkali bercabang metil (branching CH3). Karena starting
materialnya memiliki gugus metil maka jelaslah terpenoid yang
dihasilkan mewarisi gugus metil ini.
3. Kadang mengandung gugus metilen (=CH2) terminal atau -
CH2OH. Disebabkan suatu reaksi pada cabang metil pada poin
2 gugus metil tersebut kadang mengalami modifikasi menjadi
gugus metilen terminal atau metil yang mengikat hidroksi.
4. Seringkali membentuk cincin atau rantai siklik yang unik
Ciri sekunder:
5. Semakin panjang rantai karbon (jumlah karbon) kelarutan
makin larut pada pelarut non polar.
6. Jarang memiliki gugus aromatis.
7. Jika memiliki rantai ikatan ganda umumnya berjumlah
terbatas.
Keberadaan senyawa terpenoid berbobot molekul rendah
berlimpah distribusinya pada tumbuhan dan makhluk tingkat rendah
seperti jamur/fungi, bakteri dengan struktur sangat beragam. Pada
makhluk vertebrata dan manusia jenis senyawa terpenoid didominasi
turunan steroid.
Identifikasi Terpenoid
Secara kimia: Karena terpenoid sangat beraneka ragam strukturnya
dan tidak memiliki gugus yang uniform terkait reaktifitas kecuali
ikatan gandanya maka secara kimia terpenoid diidentifikasi dengan
penyemprotan pereaksi vanillin-asam sulfat atau anisaldehida-asam
sulfat yang akan menghasilkan warna-warna ungu, kuning coklat,
hitam pada sinar tampak. Vanillin dan anisaldehida memperpanjang
rantai terkonjugasi dari senyawa target. Atau kadang dilakukan
reaksi oksidasi, yang diperkirakan terlepasnya beberapa hidrogen
meningkatnya jumlah ikatan ganda sehingga terbentuk warna violet
pada cahaya tampak. dengan pereaksi umum serium(IV)sulfat yang
akan menghasilkan warna ungu, biru atau kuning.
Secara fisika: Karena ikatan gandanya terbatas maka identifikasi non
spesifik terpenoid adalah dengan melihat bercak kromatografi lapis
tipis silica gel254 nm di bawah sinar lampu UV 254 akan menghasilkan
bercak warna ungu pemadaman, dengan warna latar lempeng
fluoresensi hijau (lempeng berwarna hijau). Dan di bawah lampu UV
366 mm tidak menghasilkan fuoresensi. Semakin terbatas ikatan
gandanya tentu intensitas akan lemah. Sehingga senyawa-senyawa
triterpen seperti asam ursolat, asam betulinat, kolesterol sulit tampak
dengan identifikasi fisis. Untuk memvisualkan bercak kromatografi
golongan terpenoid rantai panjang memerlukan derivatisasi dengan
penyemprotan vanillin, anisal dehida, serium sulfat kemudian
dipanaskan beberapa detik sehingga akan timbul warna dari kuning
hingga merah tua. Harap dicatat bahwa reaksi kimia seperti ini
terlalu umum.
O
OH
H
H H
103 0C, 3 menit

OR
OR
OR
Senyawa terpenoid
OR
Vanilin/Anisaldehid
Senyawa vanilin terpenoidal

Gambar 2.11 Vanilin dan anisaldehida, jika dengan bantuan asam sulfat
dan pemanasan 103 0C merupakan penampak bercak
umum untuk senyawa yang tidak nampak pada UV 254
atau 366 terutama turunan terpenoid: minyak atsiri,
senyawa terprenilasi, saponin bahkan steroidal/triterpen.
Secara spektroskopi proton NMR: karena terpenoid memiliki gugus

metil, maka jika dibaca pada spektra NMR akan tampak sinyal
tunggal tinggi pada geseran kimia (chemical shift) antara 0.8
sampai sekitar 2 ppm. Atau jika terdapat gugus ekso metilen terminal
(=CH2) maka akan terdapat puncak sinyal tinggi tajam antara 5
sampai 5,6 ppm berupa doublet).
Soal latihan:
a. Sebutkanlah mengapa senyawa-senyawa berikut ini adalah
termasuk terpenoid dan masuk pada golongan tepenoid yang
mana?
O
O
1. Citral 2. p-Cimen 3. Iridoid

OH
H H HO OH
4. -kariofilen 5. Heyneanol
OH
CO2H
HO
6. Steviol 7. Amrin
b. Sebutkanlah mengapa Mengapa senyawa artemisinin obat

malaria dengan struktur ini termasuk terpenoid dan masuk
golongan terpenoid apa?
Arteminisin obat malaria dari Artemisin:

c. Termasuk golongan terpenoid apakah senyawa dengan
struktur berikut ?
Andrografolid dalam herba sambiloto:
Catatan: jumlah karbon di dalam struktur bisa kurang

satu atau kelebihan 1 ditoleransi dan tidak strict
rumus C2, C5, C9. Karena proses di alam oleh reaksi
enzimatis. Asal ciri utama memenuhi dan sesuai golongan
metabolit.
Golongan fenil propanoid (C9) dan fenil metanoid (C7)
O O
HO
O
HO
O H O
O
H
O OCH3
O
H3CO OH
Gambar 2.12 Podofilotoksin adalah senyawa anti kanker kulit diisolasi

dari spesies tumbuhan Podophyllum spp. Podofilotoksin
bahan baku obat kanker etopsida (Inzet) yang digunakan
untuk kanker paru, testes, limfoma dll.
Senyawa fenilpropanoid adalah senyawa memiliki kerangka

aromatik fenil (C6) dengan rantai samping propanoid (C3) sehingga
jumlah total karbonnya adalah 9 dan disebut C9 atau fenil
propanoid dan kelipatannya.
Senyawa fenil propanoid terbentuk dari asam sikimat (Gambar
2.3 dan 2.11). Selain fenil propanoid, jalur asam sikimat
dihipotesiskan membentuk building block C7. Berbagai senyawa
golongan lignin, stilben, kumarin memiliki kerangka C9. Asam galat,
struktur benzoik, berbagai polifenol (bukan jalur tunggal) terbentuk
dari struktur C7.
Golongan Fenil propanoid adalah adalah senyawa yang
memiliki aktifitas farmakologi luas seperti antikanker
(podofilotoksin), filantin berefek sebagai hepatoprotektor dan
stimulan kekebalan dalam tanaman meniran (Phyllanthus niruri),
antiaterosklerosis (stilebenoid, resveratrol), antidiabetes
(sinamaldehide, terkandung dalam kulit kayu manis (Cinnamomum
burmani), eugenol bahan antiseptik gigi diperoleh dari kuncup bunga
cengkeh (Syzygium aromaticum). Berbagai bahan parfum atau aroma
aromaterapi merupakan senyawa fenil propanoid. Jadi minyak atsiri
disusun oleh golongan monoterpen, seskuiterpen, dan
fenilpropanoid.
Gambar 2.13 Flowchart pembentukan senyawa dengan kerangka C9 dan

C7 atau disebut golongan fenil propanoid dan fenil
metanoid
Ciri-ciri senyawa fenil propanoid dan fenil metanoid:
1. Selalu memiliki kerangka inti fenil dan propanoid sehingga
disebut C9 dan kelipatannya misalnya 2 x C9, 3 x C9 dst. Jika
C7 maka memiliki kerangka benzil dan 1 rantai karbon
samping
2. Pada kerangka aromatik jika memiliki gugus hidroksil (-OH)
atau alkoksi (-OR) biasanya akan berada pada posisi para
terhadap rantai samping propanoidnya.
3. Jika terdapat lebih dari satu alkoksi (-OR) atau hidroksil (-OH)
maka akan berposisi orto.
Keberadaanya berlimpah pada tumbuhan namun terbatas pada
jamur dan belum ditemukan pada manusia atau vertebrata.
Golongan ini melewati starting material asam amino L-tirosin dan L-
fenilalalin yang merupakan asam amino esensial (manusia tidak
memiliki jalur biosintesis ini). Sehingga potensi toksisitas kecil pada
manusia.
Identifikasi senyawa fenil propanoid:

Secara kimia: reaksi umum untuk identifikasi fenil propanoid
tidak ada reagen khusus untuk identifikasi. Sedangkan keberadaan
rantai samping propanoid atau gugus lain tentu tidaklah spesifik.
Tergantung dari berbagai gugus fungsional yang terikat. Jika
mengandung gugus hidroksil maka reagensia pengkopling semacam
FeCl2 yang berakibat warna larutan menjadi gelap.
Secara fisika: Senyawa ini biasanya jika dilihat di bawah sinar
UV 254 nm lempeng KLT silica gel254 akan mengalami pemadaman
fluoresensi (quenching). Khusus untuk golongan kumarin akan
memberikan flouresensi biru terang, sedangkan pada larutan
berflouresensi hijau. Adapun berbagai reagensia penciri gugus kimia
tentu tidak spesifik untuk mencirikan golongan fenilpropanoid.
Secara spektroskopi NMR. Tanda kurung di awal dan diakhir
alinea dibuang.: karena dipastikan memiliki kerangka aromatik,
biasanya proton pada aromatik akan memiliki geseran kimia antara
6 sampai 7 ppm. Pola pemecahannya mengikuti sistem ABX misalnya
dd (doublet of doublet) atau double dengan coupling constant kecil
antara 1-3 Hz yang menunjukkan coupling meta. Diukur pada
karbon NMR maka akan terdapat sinyal karbon sebanyak enam
buah pada geseran kimia di atas 100 ppm. Sedangkan rantai
samping tergantung gugus yang diikat, jika membuat proton fenil
maka akan memberikan sinyal pada geseran kimia antara 4,5- 6
ppm, jika berupa proton alifatik maka akan berada di antara 1-2
ppm, jika terikat pada karbon yang mengikat oksigen maka akan
berada di antara 3-4 ppm.
Tugas: Identifikasilah termasuk golongan senyawa apa golongan

berikut ini!
Golongan alkaloid
Gambar 2.14 Piculah Adrenalin mu! Adrenalin adalah salah satu

alkaloid yang diproduksi oleh makhluk vertebrata dari
asam amino tirosin. Adrenalin berfungsi mediator pada sel
saraf terkait rasa simpati dan kewaspadaan. Jadi tidaklah
betul alkaloid hanya terdapat pada tumbuhan melainkan
hampir semua kingdom termasuk manusia.
Definisi alkaloid klasik menyatakan
H
H O bahwa semua senyawa metabolit sekunder
N C yang mengandung unsur nitrogen di dalam
kerangkanya. Alkaloid diklasifikasi-kan
H R OH berdasarkan asam amino prekursornya
dan di dalam kerangkanya masih memiliki
atom nitrogen.
Adapun senyawa dengan kerangka asetat, terpenoid, shikimat
yang mengalami aminasi (pemasukan atom N) bukanlah alkaloid
secara definisi khusus.
Senyawa alkaloid memiliki peran yang sangat besar di dalam
bidang kedokteran. Senyawa yang pertama kali diisolasi secara murni
adalah morfin. Berbagai obat penting terutama obat syaraf adalah
alkaloid. Berbagai doping, bahan obat narkotik, kopi dikonsumsi
sehari-hari oleh manusia mengandung alkaloid yakni kafein, coklat
adalah alkaloid teobromin.
Namun secara dominan alkaloid adalah senyawa metabolit
sekunder yang berasal dari prekursor asam amino. Sehingga untuk
mempelajari alkaloid bisa ditelusuri berdasarkan building block atau
kerangka asam amino asalnya.
Golongan utama alkaloid:
alkaloid turunan ornitin
alkaloid turunan lisin
alkaloid turunan asam nikotinat
alkaloid turunan tirosin
alkaloid triptopan dan asam antranilat
alkaloid turunan histidin
alkaloid karena reaksi aminasi
Keberadaan dan fungsi alkaloid:

Keragaman struktur alkaloid sangat tinggi. Alkaloid berpotensi
sebagai sumber obat yang berlimpah dan berefek farmakologis
beragam. Sifat fisiko-kimia yang bersifat semipolar dan mampu
berinteraksi dengan membran sel. Kontribusi atom N di dalam
struktur memberikan efektifitas interaksi kimiawi dengan reseptor.
Secara farmakologis bersifat bioaktif lemah hingga kuat. Alkaloid
yang bersifat lemah bermanfaat sebagai zat rekresional, misalnya
kafein dalam teh dan kopi. Alkaloid yang berefek kuat bersifat
blocker atau stimulant berbagai reseptor atau protein fungsional.
Alkaloid yang sangat poten bersifat racun misalnya beberapa
alkaloid dari katak.
Obat-obatan seringkali dibuat dengan memodifikasi alkaloid
endogen. Terdistribusi luas dari tumbuhan, jamur, bakteri hingga
mamalia. Neurotransmitter kebanyakan merupakan alkaloid:
adrenalin, atropin, asetilkolin,glutamat, adenosin, dll.
Soal latihan:
identifikasilah mengapa senyawa-senyawa berikut merupakan
alkaloid !
HO
O
N
NMe H Me
H H
N
HO
Kodein (obat batuk kering) Nikotin (stimulant)

OH
HO
HO NH
Dopamin (neurotransmitter
Salbutamol (anti asma sintetis)
emosi dan memori)
Senyawa Golongan Campuran

Senyawa-senyawa fenil propanoid (C9), C7, terpenoid (C5),
poliketida (C2), alkaloid serta metabolit primer (umumnya
monosakarida) di alam bisa saling bereaksi dan berikatan sehingga
membentuk kerakaragaman baru baik struktur maupun aktifitas
farmakologi.
Jadi Jenis kombinasi bisa:
- Dua golongan metabolit sekunder.
- Tiga golongan metabolit sekunder.
- Semua golongan dengan metabolit primer (terutama
monosakarida glukosa, rhamnosa, fruktosa)
- Semua metabolit sekunder juga bisa melakukan reaksi
halogenasi, sulfurasi, dan aminasi.
Soal latihan: (Harap dipahami bahwa jumlah karbon kurang satu

atau kelebihan satu dari rumus umum bisa terjadi)
1. Senyawa kavibetol merupakan senyawa marker pada daun

sirih (Piper bettle). Merupakan senyawa golongan apakah
kavibetol?
2. Senyawa flavonoid adalah senyawa yang distribusinya sangat

luas pada berbagai familia dan spesies tanaman. Tersusun dari
kerangka apakah senyawa flavonoid?
3. Tetrahidrokanabinoid (THC) adalah senyawa aktif dalam

tanaman ganja (Cannabis sativa). Senyawa ini berpotensi untuk
mengobati multiple sclerosis. Tersusun dari kerangka apa saja
golongan tersebut?
4. Dounorubisin disari dari jamur Streptomyces peucetius

digunakan untuk mengobati kanker leukemia limfosit dan
myeloid akut. Termasuk golongan apakah senyawa taxol dan
dounorubisin?
5. Kurkumin adalah bumbu dapur yang berkhasiat untuk

mencegah keganasan (malignansi) kanker. Termasuk golongan
apakah kurkumin?
6. Lunamarin adalah senyawa yang terdapat pada daun maitan

atau sanrego (Lunasia amara Blanco). Termasuk senyawa
apakah senyawa lunamarin dan tersusun dari building block
apa saja?
7. Jeruk purut atau Citrus hystrix kaya dengan kumarin salah

satunya ada eupecindatin. Termasuk building block apakah
senyawa tersebut?
8. Saponin terdistribusi pada bererapa spesies. Digoksin

merupakan saponin. Lerak untuk mencuci kain batik tulis juga
merupakan saponin. Tersusun dari kerangka apa sajakah
senyawa saponin dengan struktur di bawah ini?
9. Kapsisin adalah senyawa yang terkandung di dalam buah cabai

(Capsicum sp), selain bermanfaat untuk memberikan rasa
pedas pada sambal, kapsisin berefek sebagai pengurang nyeri
(analgetik). Merupakan senyawa apakah dan tersusun dari
kerangka apa senyawa kapsisin tersebut?
Penggolongan metode lain:

Sebagian ilmuwan lain mengklasifikasikan metabolit sekunder
berdasarkan keluasan distribusinya dan kelimpahannya di alam.
Penggolongan ini biasanya memiliki tujuan pragmatis namun tidak
terlalu spesifik untuk melakukan kuantifikasi dan digunakan untuk
melakukan estimasi kasar golongan senyawa yang kemungkinan
bertanggung jawab secara farmakologis. Golongan senyawa itu
adalah:
1. Gol. Fenolik
2. Gol. Flavonoid
3. Gol. Saponin
4. Gol. Minyak atsiri
5. Gol. Tannin
6. Gol. Alkaloid (terbatas pada beberapa genus)
7. Gol. Steroid
Namun dengan kemajuan kimia organik selama 30 tahun ini,
pembagian golongan umum ini sudah tidak terlalu relevan. Seorang
peneliti akan cukup mudah menelusuri pustaka terakit golongan
metabolit sekunder yang dikandung oleh suatu tanaman dan
menegasikan golongan yang tidak perlu dianalisis. Jika ditelusuri
ketujuh metabolit sekunder tersebut sudah tercakup dari kerangka
molekul C2, C5, C7, C9, alkaloid, atau kombinasi.
Pertanyaan:
1. Termasuk golongan metabolit sekunder apakah senyawa
fenolik, flavonoid, dan golongan tannin?. Bagaimana
hubungan kekerabatan mereka?
2. Bagaimana hubungan kekerabatan antara saponin dengan
senyawa steroid?
3. Sebutkan komponen metabolit sekunder yang menyusun
golongan minyak atsiri?
4. Jelaskan kedudukan ketujuh golongan tersebut di dalam
khazanah metabolit sekunder?
BAB III
KELARUTAN METABOLIT SEKUNDER DAN
PEMILIHAN PELARUT
Target Pembelajaran: Pembaca diharapkan mampu memahami sifat

dasar metabolit sekunder dan memberikan overview pelarut yang
sesuai di dalam upaya ekstraksi.
Penggolongan metabolit sekunder berdasarkan kepolaran

secara tegas tidaklah tepat. Penggolongan metabolit sekunder
berdasarkan polaritas sangatlah kaku sehingga tidak mutlak bisa
diterapkan. Sifat polaritas antar golongan metabolit sekunder
kebanyakan tidaklah berbeda secara dramatis. Untuk mengisolasi
dan memurnikan metabolit sekunder harus dipahami sifat dasar
molekul metabolit sekunder. Mayoritas metabolit sekunder bersifat
semi polar sehingga larut dalam pelarut organik. Metanol dan
asetonitril adalah pelarut organik paling polar. Heksana, benzana,
dan petroleum eter bersifat non polar. Hanya sebagian saja dari
metabolit sekunder bersifat polar dan larut dalam metanol atau air.
Kebanyakan metabolit yang larut metanol adalah senyawa glikosida
yang mengikat satu atau lebih molekul gula heksosa/pentosa.
Adapun kebanyakan golongan terpenoid bersifat non polar sehingga
larut ke dalam pelarut non polar dan semi polar. Namun untuk
monoterpen dan seskuiterpen masih mampu larut dalam metanol.
Metode kromatografi baik fase normal atau terbalik yang saat
ini diterapkan dan berkembang kebanyakan kompatibel dengan
senyawa semi polar. Sehingga senyawa yang sangat polar atau non
polar tidak kompatibel dengan metode pemisahan kromatografi.
Begitu juga metabolit primer polisakarida, lemak, dan protein
tunggal dari bahan alam tidaklah tepat menggunakan metode
kromatografi konvensional. Demikian juga senyawa yang larut air
dan sangat larut metanol atau yang sangat non polar sangat sulit
memurnikan dan mengkarakterisasinya.
Untuk melakukan pemisahan awal senyawa alami dari matriks
nabati/hewani melibatkan pemisahan kasar dilanjutkan dengan
pemisahan halus. Pemisahan kasar melibatkan salah satu metode:
- ekstraksi
- fraksinasi partisi cair-cair
- atau fraksinasi cair-padat
Sedangkan pemisahan halus melibatkan salah satu:
- kromatografi kolom fase normal
- kromatografi kolom fase terbalik
- Kromatografi eksklusi/permeasi
Jenis dan kegunaan pelarut

Berbagai pelarut lazim digunakan pada berbagai pekerjaan
ekstraksi, fraksinasi, fase gerak kromatografi.
Tabel. Pelarut yang lazim dan penggunaannya

Solven Konstanta Penggunaan
dielektrik ()
Hekana 2,02 Untuk mengekstraksi lemak. Untuk
partisi paling awal terhadap larutan air
atau heksana. Heksana tidak bercampur
dengan metanol. Dengan rasio besar ke
kecil (0-10 %) dicampur etil asetat
digunakan untuk fase gerak KLT dan
kolom silika untuk memisahkan
senyawa semi polar-non polar.
CCl4 2,24 Racun. Tidak pernah dipakai untuk
ekstraksi atau pemisahan.
Benzana 2,28 Karsinogenik !!. Digunakan untuk
pemisahan isomer-isomer yang memiliki
cincin benzen, untuk tahap pemurnian.
Lakukan di lemari asam/fumehood.
Toluen 2,38 Fase gerak KLT dicampur dengan
metanol kadar rendah. Analisis KLT
senyawa bercincin benzana.
Trietil amina 2.43 Bersifat basa lemah. Dicampur (1-5 %)
dalam kloroform-metanol atau heksana-
etil asetat untuk menganalisis KLT
beberapa alkaloid.
dielektrik ()
Kloroform 4,81 Untuk partisi terhadap air. Dicampur
metanol kadar rendah (5-20 %) untuk
fase gerak KLT fase normal. Selalu larut
dengan metanol berapa pun kadarnya.
Cukup toksik. Direkomendasikan
diganti dengan diklorometan untuk
kromatografi kolom adapun KLT tidak
masalah. Dalam bentuk terdeutronasi
pelarut yang bersih untuk kebanyakan
senyawa semi polar-non polar.
Eter (dimetil 5,0 Toksik dan anestetik. Jika terpaksa
eter) digunakan dengan rasio 1-4 terhadap
heksana digunakan sebagai fase gerak
untuk pemurnian dan pemisahan
dengan KLT. Dilakukan di lemari asam.
Etil asetat 6,02 Untuk partisi cair-cair dengan air.
Dilakukan setelah heksana. Dicampur
dengan heksana (0-100%) untuk fase
gerak kromatografi kolom. Dicampur
dengan kloroform atau diklorometana
untuk kromatografi kolom senyawa-
senyawa non polar. Dilakukan sebelum
campuran heksana-etil asetat.
Asam asetat 6,15 Sedikit mengasamkan fase gerak pada
KLT pemisahan halus
Diklorometana 8,93 Untuk partisi cair-cair menggantikan
kloroform. Dicampur metanol kadar
rendah (5-20 %) untuk fase gerak KLT
fase normal.
n-butanol 17,8 Untuk partisi terhadap air setelah etil
asetat. Kadang dicampur sedikit asam
asetat atau asam lemah lain dan
dijenuhkan dengan air untuk analisis
KLT glikosida. Ditutup rapat. Bau
mengganggu pernapasan.
n-propanol 20,1 partisi cair-cair dengan air jika perlu
lebih halus ketika fraksi air setelah
dipartisi dengan n-butanol
Aseton 20,7 Ekstraksi senyawa semi polar. Kadang
dicoba dengan sedikit metanol untuk
KLT. Dalam bentuk terdeutronasi
sebagai pelarut semi polar NMR.
Etanol 25,3 Untuk ekstraksi awal simplisia baik
sendiri atau dicampur dengan air kadar
dielektrik ()
< 30%.
Metanol 33 Pelarut utama untuk ekstraksi simplisia.
Campuran dengan aseton atau
asetonitril untuk fase gerak fase terbalik.
Rasio sangat kecil terhadap klorofom
atau diklorometana untuk fase gerak
KLT fase normal.
Asetonitril 36,6 Dalam bentuk campuran dengan air
untuk fase gerak KLT fase terbalik dan
HPLC
DMSO 47,2 Pelarut untuk bioassay. Dalam bentuk
terdeutronasi sebagai pelarut NMR
Air 80 Pengekstraksi polar, membuat infusa,
membuat dekokta. Dalam bentuk
terdeutron sebagai pelarut NMR
Gambar 3.1 Diagram alur proses ekstraksi hingga diperoleh senyawa

aktif. Pengujian efek farmakologi harus dilakukan setiap
tahap. Sampel yang aktif yang diteruskan. Itulah inti dari
bioassay guided gractionation.
BAB IV
EKSTRAKSI, FRAKSINASI, DAN PURIFIKASI
Target Pembelajaran: Pembaca mampu memahami alur pemurnian

mulai dari proses ekstraksi, fraksinasi, dan purifikasi. Mampu memilih
fase diam dan fase gerak dalam setiap tahap serta menentukan bobot
minimal yang harus dimiliki pada setiap proses.
Ekstraksi
Metode ekstraksi paling sederhana dan menjadi pilihan adalah
maserasi (perendaman). Yakni merendam material di dalam pelarut.
Maserasi (merendam dalam pelarut) adalah metode ekstraksi pilihan
pada tahap pendahuluan ataupun ekstraksi perbanyakan. Selain
karena simple juga tidak banyak gangguan fisis.
Adapun metode dasar yang lain seperti perkolasi, Shoxleat, gas
superkritikal, counter current chromatography, microwave dll
digunakan menyari bahan yang targetnya sudah jelas.
Tahapan ekstraksi melewati dua mekanisme dasar yakni:
Disolusi : proses terendamnya senyawa target oleh solven.
Difusi : proses terbawanya senyawa-senyawa oleh solven keluar
sel atau matriks alami.
Agar solven bisa menjangkau tempat senyawa di dalam sel
atau ruang antar sel maka penyerbukan harus dilakukan. Serbuk yang
terlalu halus menyebabkan larutan keruh atau terbentuk dispersi
yang mengganggu kedua proses itu. Pembatas proses difusi adalah
gradien difusi yang mendekati ~1. Artinya kadar senyawa di dalam
pelarut dan di dalam material alami sama. Biasanya setelah 1 malam
diganti pelarut baru.
Pada pekerjaan skrining seringkali hanya dibutuhkan 1-10 gram
serbuk bahan untuk diekstraksi. Barulah jika setelah bioassay
diketahui sampel yang paling poten maka yang diperbanyak.
Bioassay secara in vitro modern hanya membutuhkan bobot ekstrak
sekitar 1 mg. Untuk mempercepat ekstraksi seringkali dikombinasi
dengan sonikasi 1 jam, menaikkan suhu 30-400C. Tidak perlu dalam
jumlah besar.
Polarisasi dan Depolarisasi
Konsep interaksi kimiawi pada ekstraksi, fraksinasi kasar, dan
sub fraksinasi berdasarkan derajat polaritas pelarut-pelarut. Di sisi
lain harus dimengerti bahwa tidaklah tepat mengandalkan konsep
kelarutan like dissolves like belaka. Seseorang harus memiliki
pemahaman yang cukup dengan prinsip ikatan kimia dan batas
kelarutan. Tidaklah benar bahwa senyawa polar hanya larut di
dalam pelarut polar atau sebaliknya. Pada batas tertentu sekelompok
metabolit sekunder dapat mengalami polarisasi atau depolarisasi
pada suatu kuantitas pelarut berlebih sehingga terjadi peristiwa like
dissolves unlike. Contohnya etanol dalam jumlah besar mampu
melarutkan glikosida (polarisasi). Heksana yang bersifat non polar
dalam jumlah besar juga mampu menarik polifenol karena fenomena
depolarisasi. Untuk itulah pekerjaan pengawalemakan ( defatting)
bukanlah pekerjaan yang dianjurkan karena menyebabkan cukup
banyak metabolit terlarut hilang. Contohnya senyawa xanton
(ksanton) kadar akan berkurang dari ekstrak jika heksana digunakan
untuk pengawalemakan ekstrak kulit manggis.
Interaksi Kimiawi
Konsep yang harus dikuasai adalah pada fase pemisahan halus
adalah interaksi antara fase diam, pelarut, dan analit. Pada fase diam
normal interaksi kimiawi yang paling penting adalah ikatan hidrogen
antara tiga komponen.
Untuk menghasilkan senyawa aktif secara farmakologis
diperlukan kerja yang sistematik dengan melakukan pendekatan
bioaktifitas. Untuk itu diperlukan target biologis yang sesuai sebagai
representai penyakit tertentu. Demikian pula pemilihan bahan hayati
dilakukan secara random (acak) dengan jumlah jenis sampel (spesies)
banyak. Semakin banyak spesies yang diuji semakin besar peluang
untuk memperoleh bahan aktif yakni jumlah spesiesnya Untuk
pemilihan sampel secara random, sampel tidak harus pernah
dilaporkan untuk penyakit yang ingin diteliti. Di industri, sampel
random ini dilakukan secara HTS (high throughput screening), yakni
penapisan dengan uji farmakologis secara cepat dengan jumlah stok
sampel sangat kecil (<0,5 mg). Pendekatan ini juga berdasarkan
penggunaan tradisional untuk penyakit yang sesuai
(etnofarmakologi) dari pengamatan empiris, data empiris dari
record, daftar obat tradisional atau dari publikasi, dan laporan
ilmiah. Bahkan bisa dari buku resep tradisional atau pustaka lokal
yang bisa dipertanggung jawabkan artinya tidak hanya 1-2 buku
resep saja.
Untuk isolasi skala proyek penelitian uji aktifitas in vitro lebih
sesuai karena akan menyesuaian jumlah fraksi yang dihasilkan.
Namun demikian harus selalu dipikirkan penyesuaian bobot sampel
yang tersedia jika ingin dilakukan uji secara in vivo / in vitro.
Dengan setiap langkah ekstraksi, fraksinasi, dan purifikasi
semua material selalu dipantau dengan pengujian aktifitas
farmakologis. Paradigma kerja ini disebut bioassay-guided
fractionation. Pendekatan ini menjadi standard dalam penemuan
obat baik dari bahan alam maupun sintesis.
Secara kuantitas ada tiga macam metabolit sekunder yakni
yang ditemukan sebagai senyawa utama (major compound),
senyawa minor (minor compound), dan senyawa kelumit (trace
compound)*.
Adapun perinciannya adalah sebagai berikut:
- Senyawa utama jika ditemukan dalam prosentasi lebih besar
dari 0,01 % dari berat simplisia(>100 mg/kg simplisia.
- Senyawa minor jika ditemukan dalam prosentase kurang dari
0,01-0,0001 % (75-20** mg/kg simplisia)
- Senyawa kelumit jika ditemukan dalam prosentasi kurang dari
0,0001 % (5-0,5 mg/kg simplisia)
* Berdasarkan limit of identification dengan NMR 400 MHz.

** Angka-angka ANTARA tidak eksak karena mempertimbangkan
kehilangan selama proses ekstraksi.
Pentingnya Dokumentasi
Pemastian spesies atau disebut otentikasi dengan
mengkonsultasikan kepada taksonomis jika merupakan spesies yang
bukan merupakan domain umum. Namun jika sudah jelas dan
merupakan public domain misalnya pohon jati (Tectona grandis),
bawang merah (Alium cepa), melinjo (Gnetum gnemon) tentu
mudah menentukan spesiesnya. Voucher atau contoh bagian
tanaman atau tanaman utuh (herba) wajib disimpan untuk
dokumentasi jika sewaktu-waktu untuk konfirmasi atau penelusuran
kembali demikian deskripsi tempat pengambilan sampel. Teknologi
dokumentasi elektronik pribadi juga bisa digunakan, misalnya
menyimpan dalam bentuk fotonya. Tanpa dokumentasi dan
otentikasi yang baik bisa menimbulkan keraguan hasil atau kesulitan
untuk memperoleh hasil yang sama.
Bahan Simplisia (Crude Drug)

Untuk mendapatkan ekstrak yang poten dilakukan berdasarkan:
1. Pendekatan data empiris: mengamati bahan yang secara
empiris memberikan efek positif pada penderita penyakit
tertentu.
2. Sampling random: sampel diseleksi dari berpuluh-puluh
(hingga ratusan) bahan hayati. Skrining haruslah dilakukan
sehemat dan seefisien mungkin. Era sekarang bioassay
didasarkan pada target molekul in vitro atau kultur sel yang
membutuhkan jumlah bahan uji sangat sedikit. Cukup
disediakan 1-10 gram bahan mentah. Semuanya dimaserasi
hingga didapatkan 1-10 mg ekstrak. Kemudian diuji pada dosis
tunggal misalnya mengacu 25 g/mL (replikasi atau triplikasi).
Sampel yang menunjukkan efek poten lalu ditentukan ED 50
atau IC50-nya. Setelah diperoleh ekstrak paling poten maka
simplisia ekstrak yang paling poten tersebut diperbanyak
setidaknya 1 kg.
Saran: Untuk mahasiswa tingkat skripsi sebaiknya bekerja dalam

rangka untuk membuktikan data empiris atau dari 10 sampel
random. Untuk tesis sekitar 25 sampel agar lebih mungkin untuk
mendapatkan bahan poten. Adapun untuk tingkat desertasi
seharusnya menghasilkan karya yang sangat berbobot temuan baru
baik senyawa baru atau senyawa sangat poten untuk itu tingkat
disertasi diperlukan jumlah sampel yang jauh lebih banyak.
Ekstraksi dan Uji Farmakologi Pendahuluan
Untuk melakukan isolasi dan pemurnian metabolit sekunder
terlebih dahulu perlu diketahui apakah suatu ekstrak memiliki
aktifitas biologis yang menjanjikan. Untuk itu perlu dilakukan
farmakologis pendahuluan. Hal itu tidak terlepas dari model
penyakit yang diteliti atau dijadikan sasaran pengobatan. Sebagai
ketentuan umum ekstrak dikatakan memiliki aktifitas farmakologi
yang menjanjikan jika memiliki kemampuan hambat atau dosis
efektif lebih dari 75% populasi pada kadar 25 g/mL terhadap
aktifitas molekul (enzim/protein) penyebab penyebab penyakit, sel
kanker, bakteri atau jamur dengan Semakin kecil dosis efektif maka
semakin poten dan promising. Biasanya jika dosis efektif terlalu besar
maka tidak dilanjutkan. Beberapa peneliti melakukan eksepsi tetap
melakukan pemurnian pada spesies-spesies yang belum diketahui
kandungan metabolit sekundernya.
Gambar 4.1 Maserasi dilakukan 10 bagian pelarut: 1 bagian simplisia.

Misal 1 kg bahan dalam 10 L metanol.
Pada era sekarang, pada dasarnya isolasi senyawa dari bahan

alam tidaklah sulit terlebih jika targetnya adalah major compound
(senyawa utama). Akan tetapi untuk melakukan isolasi terlebih
dahulu perlu dipahami sifat-sifat bahan secara umum. Biasanya
bahan yang berasal dari ekstrak daun adalah paling sulit untuk
mendapatkan senyawa dikarenakan matriks nabati dan kompleksnya
jaringan. Material yang berupa ekstrak dari biji atau rimpang-
rimpangan tentu lebih sederhana dan jauh lebih mudah untuk
mendapatkan senyawa. Demikian bahan dari kayu memiliki jaringan
dan kerumitan kandungan metabolit yang lebih sederhana
dibandingkan organ daun. Sehingga beberapa peneliti ada yang
secara pragmatis menghindari penggunaan daun.
Berikut ini adalah sifat-sifat bahan secara umum:

(Adapun pertimbangan utama pemilihan harus didasarkan
pada sejauh mana potensi sampel terhadap target).
Organ Keuntungan Kerugian

Daun Biasanya organ daun memiliki Kompleksitas jaringan dan
ketersediaan material yang matriks nabati paling kom-
tinggi. pleks dan kandungan kimia
Keragaman golongan meta- sangat beragam sehingga
bolit sekunder di dalam daun mempersulit pemisahan.
bermacam-macam mulai dari Kandungan asam lemak
yang non polar seperti tinggi sehingga paling sulit
steroid,triterpene. Semipolar dalam preparasi.
seperti flavonoid hingga se- Defatting dengan pelarut
nyawa polar seperti polifenol heksan atau petroleum eter
dan glikosida atau terpenoid bisa dilakukan namun perlu
terhidroksilasi. diwaspadai kehilangan se-
nyawa yg larut pada solven
tersebut (depolarisasi).
Cukup sulit mendapatkan
isolat metabolit sekunder
dalam jumlah banyak dan
beragam.
Jika isolasi metabolit se-
kunder maka harus berhati-
hati adanya positif palsu
yang disebabkan oleh asam
lemak.
Buah Matriks nabati dan jaringan Pembuatan simplisia ribet
sel tidak terlalu kompleks. karena harus diiris dirajang
Target metabolit semi polar dan butuh waktu penge-
mudah lebih mudah di- ringan lebih lama.
pisahkan. Kandungan metabolit se-
kunder lebih rendah. Butuh
bobot simplisia banyak.
Kebanyakan berisi metabolit
primer (karbohidrat) bersi-
fat polar larut metanol atau
air. Kromatografi fase
normal atau terbalik tidak
terlalu kompatibel dan bisa
diaplikasikan.
Keberadaan asam lemak
kadang mengakibatkan po-
sitif palsu pada beberapa uji
farmakologi yang bertarget
protein/enzim
Kayu Jaringan lebih sederhana dari
daun
Mudah mendapatkan senya-
wa semipolar seperti senyawa
golongan fenil propanoid dan
modifikasinya yaknia lignan
dan juga terpenoid kompleks.
Tergantung spesies dan
familinya jaringan kayu
mengandung alkaloid.
Biasanya adsorben untuk
pemisahan dengan kolom
silika dengan sistem solven
kombinasi antara heksana
dengan etil asetat.
Kulit buah Jaringan lebih sederhana dari
daun.
wa semi polar seperti xanton,
polifenol dan terpenoid
Biji Jaringan termasuk paling
sederhana
Meskipun jaringan biji sering
mengandung karbohidrat dan
asam lemak. Dengan peng-
ekstraksi etanol atau etil
asetat atau diklorometana
(CH2Cl2) karbohidrat akan
minimal.
wa golongan terpenoid,
lignan
Bunga Mudah mendapatkan senya- Negatif palsu, hati-hati
wa golongan pilifenol, dengan senyawa berwarna
flavonoid dan modifikasinya yang menggangu uji
bioassay dengan metode
kolorimetri
Rimpang Matriks tidak kompleks
dengan karbohidrat rendah
wa golongan fenil propanoid,
terpenoid seperti seskuiterpen
atau diterpen dan polifenol
glikosida
Propolis, Matriks dan residu nabati Kandungan kimia bervariasi
sarang tidak kompleks tergantung geografi. Konse-
serangga, kuensinya bisa berbeda
bekatul, potensi aktifitas farma-
dan kologisnya.
metabolit
binatang
dll
Ekstraksi
Ekstrak/sari adalah material hasil penarikan oleh pelarut air
atau pelarut organik dari bahan kering (dikeringkan). Hasil penyarian
tersebut kemudian pelarutnya dihilangkan dengan cara penguapan
dengan alat evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental jika
pelarutnya pelarut organik. Jika pelarutnya air, pada tahap akhir
dilakukan penghilangan total dengan cara liofilisasi menggunakan
alat freeze dryer. Hasil liofilisasi akan berupa serbuk. Akan tetapi
teknologi liofilisasi di Indonesia tergolong komersial dan sangat
mahal serta terbatas dimiliki institusi ilmiah di Indonesia. Untuk itu,
cara lain bisa ditempuh dengan pengentalan dengan waterbath
dengan temperature kurang dari 60 0C.
Metanol, etanol 70 %, dan etanol 96% adalah pelarut pilihan
utama untuk mengekstraksi metabolit sekunder yang belum diketahui
strukturnya dan untuk tujuan skrining. Ketiga pelarut ini memiliki
extracting power (daya ekstraksi) yang luas sehingga semua
metabolit sekunder tersari dalam tiga kali maserasi. Jika tujuannya
mengisolasi dan memurnikan senyawa target sudah jelas bisa
menggunakan pelarut organik lain (butanol, etil asetat, kloroform,
aseton, atau heksana) yang memiliki sifat ekstraksi terbaik (melalui
trial and error dan dipantau dengan plat KLT atau HPLC atau
densitometer dengan detektor UV/Vis). Tujuan pemurnian tertarget
tersebut dinamakan dereplikasi.
Biasanya ekstraksi dilakukan dengan maserasi atau perendaman
bahan dengan pelarut terpilih karena maserasi merupakan cara
ekstraksi yang paling mudah dengan rendemen ekstraksi tinggi.
Seringkali maserasi dikombinasi dengan digesti dan refluk selama 1-2
jam dengan suhu 40-60 0C untuk untuk meningkatkan efisiensi
penyarian. Biasanya ekstraksi dilakukan 2-3 kali atau sampai material
tidak mengandung senyawa terlarut lagi (dicek dengan KLT dan
lampu UV 254/366 nm). Jika penggunaan tradisional, masyarakat
secara turun temurun menggunakan bahan dengan cara direbus atau
dekok maka pelarut yang digunakan adalah air dengan cara merebus
atau mendekoktasi. Namun jika uji pendahuluan dilakukan secara
skrining pada berbagai material maka ekstraksi menggunakan pelarut
metanol atau etanol 70 % atau etanol 96 % (dalam air). Bobot
simplisia yang digunakan untuk skrining farmakologis sebanyak 10-
100 gram. Berdasarkan penelitian, ketiga jenis solven itu memiliki
ekstraktabiliti terbaik. Hampir semua metabolit sekunder akan
terlarut sempurna oleh ketiga solven tersebut dengan maserasi tiga
kali. Metode ekstraksi lain seperti perkolasi, perkolasi
berkesinambungan, gas superkritis dll bukanlah metode terpilih
untuk ekstraksi pendahuluan. Metode-metode ekstraksi tersebut
lebih tepat menjadi topik pembahasan untuk aplikasi industri atau
perbanyakan rendeman atau scaling up.
Adapun pelarut organik etil asetat, butanol,
diklorometan/kloroform, dan heksana lazim digunakan untuk tahap
fraksinasi dengan metode partisi cair-cair atau enap tuang (padat-
cair). Penggunaan langsung salah satu jenis pelarut organik itu juga
tidak bisa disalahkan asal cukupnya pertimbangan pustaka.
Jika skrining telah dilakukan dan menunjukkan salah satu
sampel aktifitas poten maka dilakukan pekerjaan isolasi. Untuk
tujuan isolasi direkomendasikan bobot bahan simplisia awal
sebaiknya minimal 1 kg agar peluang mendapatkan senyawa aktif
farmakologis secara secara kualitatif maupun kuantitatif lebih tinggi.
Seringkali (hampir selalu) tahap fraksinasi belum mendapatkan
senyawa tunggal. Fraksinasi tahap II biasanya dilakukan dengan cara
kromatografi kolom. Kromatografi kolom pilihan utama adalah fase
normal. Kemudian jika masih belum mencapai target dilakukan
fraksinasi tahap ke III dengan fase terbalik. Kromatografi permeasi
dengan fase diam polisakarida sering dilakukan setelah fraksinasi
tahap II.
Fraksinasi Kasar
Fraksinasi dengan Partisi
Ekstrak (metanol, etanol 70%, atau etanol 96%) yang
diperoleh masih kasar dan sangat kompeks isinya. Untuk itu perlu
dilakukan fraksinasi cair-cair atau partisi.
Lazimnya untuk ekstrak metanol atau etanol 70% dilarutkan
ke dalam air hingga tepat larut. Kemudian dipartisi bertingkat mulai
dari:
1. Butanol
2. Etilasetat
3. Kloroform/diklorometana
4. Heksan
Sebaiknya heksana digunakan terakhir untuk mencegah
pengambilan metabolit sekunder yang kurang selektif.
Untuk semua pelarut organik akan berada fase atas kecuali
kloroform akan berada di bawah air.
Masing-masing fraksi kental harus diperoleh setidaknya 10 gram agar
bisa dilakukan tahap fraksinasi lanjut. Selain itu semua fraksi partisi
tersebut juga harus segera diuji kembali aktifitasnya.
Catatan: Gunakan corong pisah yang berbentuk buah pear/lebih

bulat untuk mempartisi dua pelarut yang tetapan dieliktrikumnya
sangat berbeda (polaritasnya sangat beda misal air dengan heksana).
Corong pisah yang berbentuk lebih memanjang digunakan untuk dua
pelarut yang polaritasnya berdekatan misalnya air dengan butanol
Gambar 4.2 Diagram partisi cair-cair. Ekstrak kering dari metanol atau
etanol berair dilarutkan terlebih dahulu dalam air. Heksana,
kloroform, etil asetat, dan butanol adalah yang digunakan
untuk mempartisi. Selain kloroform pelarut organik selalu
di lapisan atas air.
Setelah mendapatkan ekstrak kental atau ekstrak kering maka

dilakukan pemisahan kasar dari ekstrak berdasarkan tingkat
polaritasnya yakni mulai dari non polar, semi polar dan polar.
Fraksinasi biasanya dilakukan untuk ekstrak pola: air, metanol atau
etanol 70%.
Fraksinasi ekstrak air bisa dilakukan dengan cara partisi atau
pelarutan pada solven organik. Jika fraksinasi dilakukan secara
partisi, ekstrak air dilarutkan kembali dengan air pada volume tepat
larut kemudian dilakukan partisi secara berturutan dengan butanol,
etil asetat, diklorometana atau heksana jika perlu. Partisi
menggunakan alat corong pisah (separatory funnel). Jika fraksinasi
dilakukan dengan cara pelarutan maka ekstrak air dilarutkan secara
berturutan dengan metanol, etilasetat dan diklorometan atau
heksana. Pelarutan cukup dilakukan dengan menggunakan alat
berbahan gelas, bahan yang larut dipisahkan dan prosedur diulangi
2-3 kali. Semua fraksi yang dihasilan dipantau potensinya dengan uji
farmakologi.
Kasus yang sama bisa dilakukan untuk ekstrak metanol dan
ekstrak etanol 70%. Partisi untuk ekstrak metanol sebaiknya
ditambahkan air 1-2% untuk meningkatkan efektifitas pemisahan.
Jika ekstraksi dilakukan secara langsung dengan menggunakan
kloroform atau diklorometana atau heksana biasanya tidak
dilakukan fraksinasi karena pelarut-pelarut ini biasa digunakan untuk
mengekstraksi kayu dan kulit buah. Pada sampel tersebut lemak
pengganggu atau sakarida tidak terlalu banyak. Sehingga setelah
kering bisa langsung dilakukan kromatografi kolom. Meskipun
metanol seringkali juga digunakan untuk mengekstraksi bahan-bahan
tersebut.
Mengapa fraksinasi pada ekstrak air penggunaan pelarut
diklorometan atau heksana jika perlu saja?.
Tidak semua fraksi yang diperoleh harus dilanjutkan untuk
purifikasi. Hanya fraksi yang prospektif saja yakni memiliki aktifitas
farmakologi cukup tinggi saja yang dilanjutkan. Misal jika kita telah
memperoleh berbagai fraksi metanol, fraksi etil asetat, fraksi
diklorometan, fraksi heksana dan residu, untuk itu wajib dipantau
aktifitas biologisnya. Untuk itu, uji farmakologi wajib dilakukan
untuk memandu/memilih bahan mana yang layak untuk dilanjutkan.
Selain itu juga harus memperhatikan bobot fraksi kering yang ada.
Pengentalan/Pengeringan:
Pada dasarnya pengeringan dilakukan setelah tiap tahap
ekstraksi, fraksinasi, dan pemurnian. Ada beberapa metode
pengeringan:
1. Diuapkan di atas water bath (penguapan): Baik sistem terbuka
maupun tertutup. Sistem tertutup mencegah solven meracuni
ke mana-mana
2. Diuapkan dengan rotaroy evaporator: Digunakan untuk semua
pelarut organik. Tidak cocok untuk bahan berair. Air
membutuhkan waktu penguapan yang sangat lama. Saat ini
beredar multirotaroty evaporator. Lebih efisien karena enam
sampel dikeringkan bersamaan.
3. Liofilisasi (freeze dryer): Digunakan untuk bahan yang berair
tidak untuk pelarut organik.
4. Dialiri dengan gas N2: Untuk bahan yang termolabil, harga
mahal, jumlah rendemen kecil.
Pada tahap ekstraksi, fraksinasi, atau sub fraksinasi dengan
kromatografi kolom akan dihasilkan sekitar 50 botol dengan volume
sekitar 100 ml fraksi, kemudian dipekatkan dengan cara evaporasi.
Pekerjaan pada tahap ini sangat ribet karena jumlah sampel yang
sangat banyak. Untuk mempermudah pekerjaan beberapa peneliti
membiarkan sampel-sampel di dalam fume hood (lemari asam)
sampai beberapa hari, ada yang mengeringkan dengan suatu
rotatory evaporator berhari-hari. Alat terbaru untuk meringkas
pekerjaan adalah dengan multi evaporator misal buatan Buchi yang
mampu mengeringkan 6 botol sekaligus dengan volume masing-
masing 100 mL.
Untuk fraksi yang mengandung air (karena fase gerak
menggunakan kombinasi air) merupakan masalah tersendiri karena
cukup lama. Jika tidak tersedia multivaporator yang kuat,
pemekatan bisa dilakukan dengan rotatory evaporator dengan suhu
water bath 500C, dengan volume pengisian labu 1/3 bagian untuk
mencegah terjadinya buih yang mudah tersedot ke atas. Beberapa
peneliti menambahkan propanol pada labu untuk mempercepat
penguapan.
Perlu dihindari penguapan pelarut organik dengan waterbath
yang tidak tertutup materialnya untuk menghindari toksisitas. Anda
bisa melakukan modifikasi alat waterbath agar cairan pelarut tidak
menguap bebas.
Sebisa mungkin pengentalan material dengan cara penguapan
menggunakan suhu serendah mungkin. Air adalah solven yang paling
sulit dihilangkan. Penggunaan suhu yang terlalu tinggi beresiko
degradasi konsitutuen di dalamnya. Direkomendasikan suhu
pengentalan di bawah 600 C. Penggunaan freeze dryer hanya
ditujukkan untuk material berair. Tidak direkomendasikan untuk
material yang mengandung pelarut organik. Gas N 2 digunakan
dengan cara dialirkan pada material yang mengandung pelarut
organik. Cara ini hanya efisien untuk jumlah bahan yang tidak stabil
panas. Pengeringan dengan cara liofilisasi dan pengaliran N 2 akan
menghasilkan material dalam bentuk serbuk.
Gambar 4.3 Rotaroy single evapotor (a), multivaporator (b) buatan
Buchi (Jerman)
Mayoritas sediaan jamu dan obat tradisional digunakan

dengan cara perebusan. Dengan demikian senyawa-senyawa aktif di
dalamnya adalah senyawa larut air. Biasanya setelah ekstrak air
dipekatkan atau dikeringkan dengan liofilisasi dilarutkan kembali ke
dalam pelarut semi polar etil asetat. Purifikasi dilakukan dari fraksi
larut pelarut semipolar tersebut. Jadi secara praktis sampel yang
diekstraksi dengan pelarut organik lebih untuk pemurnian. Para
peneliti hingga sekarang menyadari bahwa memurnikan senyawa
larut air atau sangat larut metanol membutuhkan teknologi baru.
Dasar-dasar kromatografi untuk pemisahan

Di dalam isolasi senyawa, kromatografi sangat penting dan
fundamental untuk identifikasi, deteksi pemisahan, deteksi optimasi
fase gerak, deteksi kemurnian, dll. Jadi kromatografi adalah metode
dasar. Ada dua tipe kromatografi berdasarkan pengepakan fase
diam. Yakni kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kolom.
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah fundamental untuk
mendapatkan visi terkait metode pemisahan yang akan kita pilih.
KLT cenderung bersifat analitis, hanya pekerjaan tertentu untuk
isolasi (preparatif). KLT akan memvisualkan senyawa-senyawa yang
terkandung di dalam bahan sehingga bisa diketahui sifat-sifatnya
terutama polaritas. Sistem yang dipilih fase diam dan fase gerak
sebisa mungkin memberikan jumlah bercak sebanyak mungkin. Fase
diam seringkali disebut dengan penjerap atau adsorben.
Kromatografi kolom adalah alat utama untuk pemisahan.
Jenis kromatografi melibatkan interaksi:
a. kromatografi adsorbsi: Pemisahan berdasarkan interaksi kimia
antara fase diam normal atau terbalik baik dengan lapis tipis
maupun kolom (fase normal dan terbalik).
b. kromatografi ekslusi: Pemisahan berdasarkan ukuran partikel
senyawa terhadap fase diameter pori antar fase diam (ekslusi),
hampir dikatakan tidak terjadi interaksi kimia antara fase diam
dengan analit. Fase diam umumnya terbuat dari polisakarida
misal selulosa (Sephadex LH)
Untuk orientasi dan pendahuluan, dimensi plat penjerap cukup
2x5 cm. Untuk melakukan KLT kita perlu memahami aspek:
1. Fase diam tipe normal: Fase diam/penjerap yang banyak
diandalkan digunakan adalah silika. Interaksi dasar yang terjadi
adalah ikatan hidrogen. Untuk fase diam silika maka fase gerak
harus dipilih antara kombinasi: 1 metanol-kloroform atau 2.
heksana-etilasetat. Jika digunakan metanol-kloroform maka
jumlah metanol antara 0-20% dalam kloroform. Jumlah
metanol > 30% membawa senyawa sangat polar dan sulit
diprofilkan dengan KLT fase normal. (kloroform memang agak
toksik sehingga bisa diganti dengan diklorometana karena sifat
polaritasnya hampir sama). Jika kombinasi metanol-kloroform
tidak bisa memberikan pemisahan yang baik atau jumlah
bercak tidak banyak maka fase gerak diganti dengan kombinasi
heksana-etilasetat. Heksana biasanya dibutuhkan dalam rasio
yang rendah, 95-50%. Disarankan rasio heksan dari kadar
tinggi ke rendah (etil asetatnya tinggi) tetap di coba misal
heksana berkadar antara 10-30%.
Tahap ini dilakukan untuk memilih pemisahan kasar dengan
kolom kromatografi kolom biasanya silika.
Catatan: Para ilmuwan telah sepakat secara umum memiliki
model fase gerak utama untuk profiling metabolit sekunder
yakni kombinasi antara kloroform-metanol atau heksana-etil
asetat. Kedua formula itu menjadi mainstream. Kedua fase
gerak ini juga diterapkan untuk fase gerak kromatografi kolom
fase normal.
2. Fase diam terbalik (RP = reversed phase). Kebanyak fase diam
yang digunakana dalah okta desil silika (ODS). Interaksi dasar
yang terjadi antara fase diam dengan sampel adalah gaya
London dan van der Waals. Pada fase diam tipe ini dibutuhkan
fase gerak yang bersifat polar antara lain kombinasi air-
metanol, air-metanol-acetonitril, air-metanol-aseton dll.
Semakin tinggi jumlah air maka semakin lama rambatan fase
gerak. Maksimal rasio airnya adalah 50%. Jumlah air yang
terlalu tinggi akan mengelupas lapisan fase diam. Untuk
orientasi awal biasanya dibutuhkan solven-solven tersebut
dengan rasion 1:1 atau 1:1:1.
3. Pemisahan alkaloid: membutuhkan fase diam silika dengan fase
gerak dengan orientasi seperti poin 1 akan tetapi perlu
ditambahkan basa lemah: misalnya CHCl3 - metanol
ammonia (atau basa lemah lain)= 7: 3 : 0.1.
Kromatografi Kolom dan Subfraksinasi

Untuk memilih kapan menggunakan fase diam tipe terbalik
atau tipe normal maka KLT baik dengan fase diam normal atau
terbalik harus dilakukan terlebih dahulu. Jika KLT tipe silika mampu
memberikan pemisahan terbanyak maka kolom silika digunakan.
Akan tetapi jika fase diam terbalik memberikan pemisahan maksimal
maka fase terbaliklah yang digunakan.
Fraksinasi adalah upaya pemisahan yang dilakukan setelah
mendapatkan fraksi aktif atau ekstrak aktif. Untuk fraksinasi
dilakukan dengan cara kromatografi kolom dengan adsorben/fase
diam/penjerap berupa silika atau fase terbalik C-18. Yang
dimaksudkan C-18 di sini adalah oktil dekana yang terikat dengan
silika. Adsorben dengan silika disebut fase normal sedangkan
adsorben C-18 bersifat terbalik (reversed phase/RP) seringkali disebut
ODS (okta desil silika). Perlu dicatat disini bahwa ODS adalah bahan
yang mahal sehingga untuk menggunakan perlu hati-hati.
Bagaimanakah polaritas fase normal silika dan C-18 ini?. Bilamana

memilih silika atau ODS sebagai fase diam?
Agar potensi mendapatkan senyawa target lebih tinggi, untuk
melakukan kromatografi kolom ini sebaiknya minimal bobot bahan
adalah 5-10 g. Kemudian bahan tersebut dibuat serbuk dengan
mencampurkan dengan silika atau ODS. Untuk membuat serbuk
yang baik ekstrak dilarutkan dengan aseton karena mudah menguap
lalu dicampurkan fase diam. Jika bobot > 8 gram dicampur dengan
fase diam dan serbukkan dengan rotaroty evaporator. Kemudian
dan dikepak pada pre kolom.
Kromatografi kolom: digunakan untuk memisahkan/fraksinasi
ekstrak kasar maupun halus. Untuk pemisahan kasar, fase diam
umumnya terbuat dari serbuk silika yang dikepak/dimasukkan ke
dalam kolom dalam bentuk larutan dalam pelarut organik atau
serbuk kering. Sedangkan pemisahan halus biasanya melibatkan fase
diam non polar misal okta desil silika atau polikasakarida misal
Sephadex.
Ukuran Partikel:
Khusus untuk kromatografi kolom silika, Ukuran partikel silika
yang digunakan untuk tahap fraksinasi adalah:
40-63 m (230-400 Mesh). Luas penggunaan dan lazim
digunakan
63-200 m (70-230 Mesh) untuk kolom yang mengandalkan
gravitasi.
Ukuran lebih kecil dari 40 m digunakan untuk KLT
Sub Fraksinasi dengan Kromatografi
Pekerjaan pemurnian dan pemisahan molekul kecil di bidang
kimia farmasi, pemurnian hasil sintesis organik, ekstraksi campuran
sampel, pemurnian senyawa alami diawali dengan kromatografi
kolom silika menggunakan metode kromatografi kolom sebagai
golden standard.
Gambar 4.4 Struktur partikel silika dan gugus fungsional yang dimiliki.
Siloksan dan silanol adalah gugus penting dalam interaksi
adsorbsi.
Catatan: Isolasi senyawa yang sudah diketahui /known compound.
Banyak sekali senyawa major compound yang sudah diketahui
strukturnya. Untuk mendapatkan senyawa yang sudah dikenal
terlebih merupakan major compound dengan cepat bisa dilakukan
dengan melakukan KLT ekstrak, mengacu angka Rf dengan senyawa
standard. Kemudian mengerok dan melarutkan kembali senyawa
dengan solven yang sesuai.]
Interaksi pada Kromatografi Fase Normal (Normal Phase)

Fase diam silika adalah pilihan utama dan paling banyak
digunakan. Silika cukup kompatibel dengan kebanyakan metabolit
sekunder. Fase diam silika (Gambar) kaya dengan gugus silanol dan
siloksan. Hidroksil yang terikat silika disebut silanol sedangkan
oksigen yang terikat oleh dua atom silika disebut siloksan. Kedua
jenis gugus ini bersifat polar dan atom oksigen padanya berifat
proton aseptor.
Interaksi pada Kromatografi Fase Terbalik (Reversed Phase)

Fase diam okta dekanil (C-18) adalah pilihan utama pada
pemisahan halus. Fase ini lazim dilakukan setelah kromatografi fase
normal. Walaupun juga tergantung dari profil KLT yang paling
banyak memberikan bercak pemisahan. Interaksi yang terjadi antara
adsorben dengan analit adalah interaksi hidrofobik terutama gaya
van der Waals atau ikatan London. Pada keadaan normal adsorben
memiliki simetris. Keberadaan fase gerak yang umumnya bersifat
polar (biasanya campuran metanol, asetonitril, air) menyebabkan
terjadinya induksi muatan lemah pada permukaan fase diam terbalik.
Senyawa yang bersifaat lebih polar lebih larut terbawa fase gerak
sedangkan senyawa yang bersifat kurang polar akan
berinteraksi/terjerab lebih lama dengan fase diam sehingga dengan
gaya London tersebut sehingga memiliki waktu tinggal ( retention
time) lebih panjang.
Gambar 4.5 Modifikasi adsorben silanol (polar) dengan cara reaksi
ksilaasi mengikat rantai karbon panjang (C-18) yang
berakibat adsorben mula-mula fase normal/polar berakibat
bersifat non polar. Interaksi induksi muatan lemah gaya
London atau van der Walls dominan atau gaya London
terjadi
Gambar 4.6 Permukaan fase diam normal dan terbalik. Pada fase diam
normal terdapat berbagai gugus polar yang bisa
menyumbangkan lone pair elektron untuk ikatan
hidrogren. Pada fase diam terbalik rantai karbon panjang
menyumbang interaksi van der Waals. Harap dipahami
perbedaannya.
Setelah beberapa tahap pemisahan belum tentu setiap tahapan
langsung menghasilkan senyawa murni. Beberapa tahapan harus
dilalui. Demikian juga jika suatu laboratorium telah dilengkapi
dengan HPLC preparatif. Meskipun pemisahan lebih selektif
pemisahan harus dilakukan beberapa tahap. Tahap terakhir setelah
melewati fraksinasi kasar dan fraksinasi halus, pada tahap akhir jika
belum murni dan tunggal maka dilakukan kromatografi preparatif.
Yakni pemisahan pada sejumlah sampel dengan bobot yang cukup
dengan metode KLT fase normal atau terbalik atau dengan HPLC.
Pemantauan hasil fraksinasi:

Secara klasik, fraksi pekat hasil pemisahan dengan kolom
tersebut dipantau profilnya dengan menggunakan KLT. Agar
ekonomis, untuk pemantauan dengan KLT ini digunakan dimensi
plate 5 x 8 cm dengan jarak penotolan 0.4 cm sehingga diperlukan
kapiler untuk menotolkan dengan diameter sekecil mungkin. Akan
tetapi perlu diingat bahwa tidak semua fraksi akan terpisah dengan
penjerap silika. Sehingga perlu juga dipikirkan untuk penggunaan
adsorben non polar (C-18). Hasil tampungan yang memiliki pola
kromatogram yang sama dijadikan satu dan dipekatkan kemudian
ditimbang. Seringkali pada tahap akhir kromatografi kolom pelarut
yang digunakan adalah pelarut yang paling polar yakni metanol.
Pelarut ini akan mengandung komponen-komponen yang sangat
polar. Walaupun kadang poten namun cukup sulit untuk
dimurnikan.
Pada tahap fraksinasi ini akan diperoleh fraksi dengan bobot
bervariasi antara 0.1 gram sampai 4 gram. Biasanya padah tahap ini
jarang diperoleh fraksi yang mengandung senyawa tunggal.
Demikian juga kita harus tetap memperhatikan aspek farmakologis
yakni fraksi mana yang aktif secara farmakologis.
Catatan:
Perlu disadari bahwa pada tahap proses pemisahan kasar dengan tipe
kolom terbuka, VLC (vacuum liquid chromatography) dan MPLC
(medium pressured liquid chromatography) sangat jarang langsung
menghasilkan senyawa tunggal (senyawa murni) sehingga perlu
dilakukan pemurnian lebih lanjut. Akan tetapi hal ini juga tergantung
dari kompleksitas ekstrak awalnya. Misalnya jika bahan kita dari
ekstrak heksana dari spesies Garcinia spp maka cukup mudah
memperoleh senyawa tunggul atau beberapa rimpang Zingiberaceae.
Terdapat beberapa tipe kolom kromatografi:

Rasio bobot antara sample dan ekstrak dengan fase diam umumnya
adalah antara 30-100 kali bobot ekstrak (n x [30 100]).
Kolom tradisional atau open column. Tipe ini adalah tipe yipe klasik
dengan menggunakan kolom terbuka/open column. Interaksi
pemisahan terjadi karena adsorbsi dan gravitasi. Rasio antara ekstrak
dengan adsorben biasanya 1-5%. Solven dimasukkaan ke kolom
dengan cara dituang melewati bibir kolom agar tidak merusak eluasi
atau aliran fase. Tipe ini tidak bisa untuk adsorben fase terbalik mis.
ODS karena hampir tidak bergerak. Jika bahan yang dipisahkan tidak
terlalu banyak sebaiknya langsung diselesaikan karena pendiaman 1
malam dengan kolom kecil berakibat sampel dalam kolom
cenderung bercampur kembali.
Kolom dengan vakum. Untuk mempercepat proses dibantu dengan
pompa vakum yang menekan aliran solven sehingga interaksi/retensi
dengan adsorben senyawa-senyawa lebih cepat. Agar efisiensi
pemisahan lebih baik kolom tipe ini sambung dengan pipa yang
menghubungkan pre kolom yang berisi serbuk ekstrak. Sistem ini
kadang disebut VLC (vacuum liquid chromatography). Jika preparasi
dan optimasi baik, jumlah penggunaan fase diam lebih sedikit dan
ekstrak yang dipisahkan bisa lebih banyak. Panjang pre kolom (7x4
cm) bisa digunakan untuk 10 gram bahan yang dicampur silika,
sedangkan ukuran kolom (15x4 cm). Dikarenakan peralatan ini
biasanya home made dan diassembling sendiri maka perlu dilakukan
optimasi dan trial terutama sekali untuk mendapatkan tekanan
pompa dari diesel dan aliran solven yang terbaik. Solven dimasukkan
ke dalam kolom secara manual tergantung bentuk kolom. Untuk
melakukan assembling, hati-hati dalam memilih gelas untuk kolom
untuk menghindari pecah karena tekanan).
Kromatografi cair bertekanan medium: Medium Pressured Liquid
Chromatography (MPLC). Peralatan ini hampir sama dengan tipe
VLC di atas akan tetapi disempurnakan dengan regulator tekanan
dan dilengkapi dengan regulator pengatur rasio fase gerak. Rasio
bahan yang ingin dipisah menyesuaikan ukuran kolom. Bahan
ditempatkan pada pre kolom yang disambung pada kolom.
Pemisahan dengan alat ini jauh lebih efisien dan dengan kapasitas
bisa maksimal. Terdapat beberapa supplier Buchi Jerman dan
Yamazen dari Jepang. Seringkali MPLC dilengkapi detektor UV.
HPLC preparative (p-High Performance Liquid Chromatography).
Beberapa peneliti menggunakan HPLC untuk melakukan pencarian
senyawa target dengan lebih cepat, efisien dan lebih aman secara
kesehatan. Solven organik yang digunakan di dalam pemisahan
sering kali terbawa udara di dalam ruangan sehingga sedikit banyak
akan terhirup oleh peneliti. Untuk itu, HPLC preparatif dipilih untuk
pertimbangan aspek kesehatan yang lebih baik. Dengan sistem ini
jumlah bahan yang digunkan cukup dalam bobot mg saja. HPLC
preparatif secara prinsip sama dengan HPLC secara umum akan
tetapi ukuran kolom lebih besar dengan kapasitas pompa lebih besar.
Kemudian senyawa yang dihasilkan akan diperoleh dalam level
mikro gram dan cukup terbaca dengan 150 kali scanning dengan
NMR 800 MHz. Sistem ini dimudahkan dengan detekor UV atau
FID.
Acuan antara rasio dimensi kolom versus bobot sampel
Dimensi kolom Bobot sampel Volume elusi fase gerak
Kolorm tradisional/open 1-5 % dari berat
column silika
VLC/MPLC (fase normal)
3 x volume adsorben
4 x 7 cm 1-5 g
4 x 15 cm 5-10 g
4 x 30 cm 15-20 g
VLC/MPLC (fase terbalik)
2 x 15 cm 0,25 g 3 x volume adsorben
3 X 15 cm 0.5-1 g
4 x 15 cm 2g
HPLC preparatif 50 -300 mg
Pengepakan adsorben:
Homogenitas dan kompaknya susunan fase gerak di dalam kolom
akan menentukan efektifitas pemisahan. Demikian juga panjang
kolom juga akan menentukan efektifitas pemisahan. Ada dua cara
pengepakan penjerap:
1. Pengepakan kering: serbuk adsorben dimasukkan ke dalam
kolom yang ujungnya sudah disumbat dengan kapas atau
glasswool. Cara ini hanya sesuai
2. pengepakan secara basah: fase diam dilarutkan dengan solven
paling awal kemudian dituang ke dalam kolom. Untuk selulosa
karbohidrat sebaiknya direndam terlebih dahulu semalam agar
cukup mengembang.
Gambar 4.7 Penyiapan kolom dan penampungan fraksi. Pada tahap

kolom kasar volume tiap fraksi adalah 100 mL. Setelah
pemisahan halus termasuk kromatografi ekslusi sekitar 50
mL. Metode ini adalah metode paling klasik namun masih
digunakan hingga hari ini.
Teknik elusi fase gerak:

Fase gerak dipilih berdasarkan orientasi atau uji pendahuluan.
Misalnya salah satu dari kombinasi antara kloroform-metanol,
diklorometane-metanol, heksana-etil asetat, heksana-aseton, jika
penjerap kolomnya silika, asetonitril-air, asetonitril-metanol-air,
metanol-air jika penjerapnya non polar.
Meski demikian hendaknya tidak memilih fase gerak isokratik
yakni fase gerak dengan rasio tetap. Sistem isokratik tidak bisa
digunakan untuk pemisahan ekstrak kasar atau sub fraksi.
Elusi fase gerak harus menggunakan sistem gradien yakni
dimulai dari pelarut non polar terlebih dahulu kemudian bertingkat
pada kombinasi yang paling polar jika penjerapnya silika. Sebaliknya
jika fase diamnya non polar dimulai dengan kombinasi yang paling
polar terlebih dahulu misalnya metanol-air (1:2). Contoh: untuk
kombinasi CHCl3-metanol atau CH2Cl2-metanol biasanya dimulai
dengan 100% CHCl3/CH2Cl2, kemudian 98%, 96%, 94%, 96%
sampai kadar 70%. bisa juga lebih rendah lagi misalnya 50% atau
20%. Untuk penjerap tipe terbalik eluent terakhir dipilih MeOH-
asetronitril dengan perbandingan 1:1 atau jika perlu dengan rasio 1:4.
Demikian juga untuk kombinasi yang lain. Terkait volume fase gerak,
setiap kombinasi dibuat dengan volume 3 x volume kolom, dan
minimal 2 x volume kolum.
Untuk setiap penampungan tetesan dikumpulkan sekitar 100
mL, biasanya jika dari fraksi kasar maka jumlah akhir sekitar 50-70
botol, dan 50 mL jika dari fraksi halus biasanya berjumlah antara 25-
40 buah botol.
Permasalahan dalam elusi:
1. Cracking: Pada kromatografi kolom klasik, seringkali setelah
beberapa waktu elusi dilakukan, susunan fase diam terlihat
pecah dan berpori (cracking): hal ini terjadi karena masuknya
udara ke dalam sistem atau elusi fase gerak tidak kontinyu
(kekeringan karena teledor). Walaupun cracking terjadi proses
kromatografi kolom tetap dilanjutkan sampai akhir.
2. Adsorben masih berwarna: Seringkali walau dieluasi dengan
solven terakhir yang paling polar, fase gerak masih berwarna
dan terkesan masih mengandung senyawa. Silika seringkali
menjerap senyawa polifenol atau ODS seringkali mengikat kuat
senyawa yang sangat tidak polar. Untuk itu tidak ada cara lain
membiarkan.
Gambar 4.8 Untuk mempercepat pemisahan bisa dikombinasi dengan
tekanan (A). Namun perlu hati-hati jika kaca tidak tahan
tekanan!. Peralatan modern MPLC (medium pressured
Liquid Chromatography) telah diaplikasikan selama 20
tahun (B). Produk terbaru dari Buchi (Jerman) kolom
terbuat dari plastik. Kolom tersedia berbagai ukuran. Sangat
efisien dan aman. Selain itu terdapat produk Yamazen
(Jepang).
Purifikasi
Tahap purifikasi ini dilakukan setelah dihasilkan beberapa sub
fraksi dengan bobot antara 0.1-4 g pada tahap sub fraksinasi dengan
kromatografi kolom. Berikut ini adalah beberapa metode dasar
untuk pemurnian:
Kromatografi preparatif
Jika hanya memiliki sub fraksi dengan bobot 100-300 mg
sebaiknya langsung dimurnikan dengan KLT preparative. Sedangkan
kapasitas maksimal per plat KLT adalah 10-25 mg untuk fase terbalik.
10-50 mg untuk fase normal.
Purifikasi dengan KLT

Fraksi yang kurang dari 0.6 gram dipisahkan/dimurnikan
kandungan senyawanya dengan KLT preparatif, tetapi harus
diperhatikan aspek berikut:
- Untuk KLT preparatif dengan penjerap silika dengan ketebalan
0.5 mm kapasitas maksimal sampel adalah 50 mg, sedangkan
KLT RP kapasitas maksimal sampel adalah 25 mg. Biasanya
250 mg akan dibutuhkan 5 buah plate KLT.
- Jika lebih dari 0.8 gram biasanya dipurifikasi/pisahkan kembali
dengan kromatografi kolom dengan dimensi yang lebih kecil,
namun juga tergantung jumlah bercak yang ada, jika ternyata
sudah cukup sederhana cukup dengan KLT preparatif.
Purifikasi dengan kromatografi kolom kembali:

Jika fraksi aktif yang dihasilkan berbobot lebih dari 1 gram dan
berdasarkan profil KLT-nya masih kompleks sebaiknya dilakukan
kromatografi kolom kembali baik normal atau fase terbalik
tergantung dari profiling kLT yang dilakukan.
Purifikasi dengan kromatografi eksklusi:

Sephadex 20-LH (GE) merupakan fase diam emas (golden
standard) untuk kromatografi tipe ekslusi pemisahan/pemurnian/
memekatkan molekul kecil. Sephadex ini sangat menguntungkan
untuk isolasi polifenol misalnya berbagai flavonoid dari daun
sembung (Blumea balsamifera) (Nessa et al., 2004; Saifudin et al,
2102). Sephadex merupakan modifikasi selulosa. Material tersedia di
pasaran dengan packing 50, 100, dan 500 g. Sephadex berharga
sangat mahal sehingga harus sangat
hati-hati menggunakan. Hindarkan
pH ekstrim, ekstrak yang terlalu
kasar, dan ekstrak yang masih
terlalu kompleks.
Rasio antara sampel dengan
serbuk Sephadex adalah maksimal
4% (4 gram ekstrak, 100 gram
serbuk).
Penyiapan: Kolom Sephadex
sama saja dengan jenis kolom lain
yakni terbuat dari kaca. Sedangkan
Gambar 4.9 Struktur
Sephadex LH-20 dimensinya memperhatikan asas
kromatografi. Sejumlah gram ser-buk yang akan digunakan direndam
dalam pelarut yang digunakan sebagai fase ferak minimal 4 jam.
Lalu dituang ke dalam kolom yang bagian dalam bawahnya
sudah ditutup (jangan terlalu ketat) dengan kapas atau glass wool.
Pelarut harus selalu tersisa pada bagian atas kolom (tidak boleh
kehabisan pelarut!). Sisakan ujung atas 5-10 cm tidak terisi. Lalu
dibiarkan 2 jam sebelum memasukkan ekstrak. Alirkan kran di
bawah hingga pelarut berda tersisa tepat di permukaan. Ekstrak
dimasukkan dalam bentuk cairan (larutkan ekstrak tepat larut)
dengan pipet. Lalu alirkan perlahan sehingga ekstrak tepat masuk 1
mm di bawah permukaan atas. Tambahkan berlahan beberapa mL
fase gerak hingga 5-10 ruangan terisi. Penampungan tetesan setiap 50
mL. 200-300 mL tetesan pertama biasanya belum mengandung
analit.
Untuk pemurnian dengan Sephadex tetesan fraksi dikumpulkan
dengan volume kurang dari 50 mL. Kemudian dipekatkan dan
divisualkan kembali itu dengan KLT.
Purifikasi dengan HPLC Preparatif

Jika tersedia HPLC preparatif, pemurnian akan lebih cepat
dilakukan. HPLC tipe ini memilik dimensi dan kekuatan pompa yang
besar. Pemisahan dan pemurnian lebih efisien dibanding cara
manual.
Setiap pemurnian dipisahkan berdasarkan HPLC analisis
pendahuluan dan ditampung berdasarkan puncak-puncak serapan
pada layar monitor.
Pada tahap pemurnian sebaiknya senyawa yang dihasilkan
minimal 3 mg untuk mempermudah analisis kualitatif terkait batas
analisis dengan NMR serta ketersediaan sampel untuk uji
farmakologis.
Pada tahap ini harus difahami bahwa jumlah sampel seringkali
memiliki keterbatasan pada tahap pemurnian dikarenakan senyawa
aktif diproduksi oleh makhluk hidup dalam kadar rendah. Sehingga
pekerjaan isolasi bahan alam sering tidak tepat disebut dengan isolasi
obat akan tetapi disebut isolasi senyawa penuntun (lead finding).
Problem yang Sering Terjadi
Isolasi polifenol dan flavonoid: untuk pemisahan kasar sebisa
mungkin bobot ekstrak minimal 15 gram jika menggunakan kolom
silika. Untuk pemisahan halus sebaiknya tidak menggunakan KLT
preparatif silika. Karena silika akan menjerab dengan kuat senyawa
tipe polifenol.
Pemisahan glikosida: Jika menggunakan KLT preparatif bisa
ditempuh dengan fase gerak kloroform-metanol-air= 7: 3: 0.5.
Sistem fase gerak ini biasa digunakan juga untuk memisahkan tanin.
Rekristalisasi
Adalah upaya pemurnian dengan solven yang sedikit larut,
penurunan suhu pelarut, atau penguapan pelarut. Rekristalisasi
ditempuh jika hasil isolasi senyawa target lebih dari 50 mg. Jika
terlalu rendah beresiko senyawa target hilang. Kombinasi klorofom-
MeOH, heksana-klorofom, heksana-etilasetat, aseton-klorofom
seringkali dipilih untuk melakukan rekristalisasi. Rekristalisasi
dilakukan beberapa kali. Dengan cara menambahkan solven tepat
larut kemudian didinginkan pada suhu 4oC. Seringkali proses
rekristalisasi jarang dilakukan sebab rendeman senyawa target
ditemukan dalam jumlah yang kecil.
Uji Kemurnian
Meskipun pada pemantauan dengan KLT telah menunjukkan
bercak tunggal atau analisis HPLC menunjukkan puncak tunggal yang
simetris belum kita telah diperoleh senyawa murni. Uji purity atau
kemurnian adalah upaya untuk menunjukkan senyawa terisolasi
sudah tunggal atau belum. Kemurnian sangat penting untuk
meminimalkan gangguan pada uji farmakologis. Seringkali impurities
atau senyawa pencemar ikut memberikan aktifitas farmakologis.
Berikut ini adalah beberapa metode uji pemurnian:
1. Uji kemurnian dengan KLT kembali dengan berbagai fase gerak
dan adsorben yang berbeda. Metode ini adalah cara yang
paling klasik dan murah. Fase diam sebaiknya tidak hanya
tunggal atau satu tipe. Untuk golongan glikosida sebaiknya
setelah dicek dengan plat silika kemudian dicek dengan fase
diam selulosa.
2. Uji kemurnian berdasarkan HPLC. HPLC sistem terbalik adalah
metode paling baik untuk mengecek kemurnian. Metode ini
untuk menunjukkan indikator kemurnian melihat berupa
puncak tunggal, tajam dan simetrisnya puncak dan keberadaan
impurities yang masih ada bersama senyawa target. Detektor
HPLC kebanyakan menggunakan UV dan sebagian kecil
menggunakan RI (refraktif index) untuk senyawa target yang
miskin/tidak memiliki kromofor. Untuk memastikan dilakukan
analisis berdasarkan sistem gradient fase gerak atau flow rate
fase gerak.
3. Uji kemurnian berdasarkan 1H NMR. Jika suatu lab memiliki
mesin NMR maka uji kemurnian 1 dan 2 di atas tidak perlu
dilakukan. Metode ini paling cepat dan otentik. Senyawa
dikeringkan dan langsung dimasukkan pada pelarut
terdeuteronasi (tidak mengandung proton) kemudian langsung
dibaca dengan mesin. Senyawa target dan kadar pencemar
akan langsung terlihat.
Analisis Kemometrik
Berbagai analisis kimiawi modern yang dilakukan untuk
menentukan sifat umum kimiawi terutama struktur. Analisis kimiawi
klasik yang bersifat merusak seperti penentuan gugus fungsional
dengan reaksi kimia menggunakan reagen harus dihindari. Metode
modern yang standard adalah sifat kimia pada HPLC, keberadaan
gugus fungsional pada IR (Infra Red) spektrometri, keberadaan
ikatan penyerab energi cahaya pada UV spektrometri.
Elusidasi struktur atau penentuan struktur (lihat bab elusidasi

struktur)
Untuk menghasilkan suatu senyawa aktif dan prospektif untuk diteliti
lebih lanjut, sifat farmakologi, interaksi molekuler, sifat
farmakokinetika dan upaya optimasi aktifitas dengan modifikasi
sintesis/semi sintesis, maka struktur senyawa target harus diketahui.
Untuk itu dilakukan penentuan struktur atau elusidasi struktur.
Penentuan struktur ada 2 cara:
1. Dengan metode spektroskopi: Langkah pertama sekali yang
dilakukan adalah analisis NMR (nuclear magnetic resonance),
IR, MS, UV, rotasi aktif. Adapun spektroskopi IR, MS dilakukan
pada tahap yang paling akhir. Penentuan UV atau rotasi aktif
dilakukan jika perlu, bilamana diperlukan spectra UV dan
rotasi aktif?
2. Dengan metode kristalografi: Difraksi sinar X bisa diterapkan
untuk memberikan gambaran molekul target tanpa merusak
atau mengkontaminasi kemurniannya.
BAB V
BIOASSAY/UJI BIOAKTIFITAS/UJI FARMAKOLOGI
(BIOASSAY GUIDED FRACTIONATION)
Untuk memperoleh senyawa aktif, uji farmakologi/bioaktifitas

dilakukan saat: 1 setelah ekstraksi, 2. Setelah fraksinasi, dan 3. setelah
memperoleh senyawa murni. Uji aktifitas yang obyektif bukan
dilakukan diakhir setelah memperoleh senyawa murni karena akan
berakibat kehilangan komponen aktif sesungguhnya.
Uji farmakologi harus mengandung unsur blanko, standard,
control positif dan jika diperlukan suatu control positif. Adapun
berdasarkan tingkatannya in vitro, in vivo dan uji klinik.
Untuk memantau keberadaan suatu senyawa poten di dalam
suatu ekstrak, uji farmakologi dilakukan untuk memandu dari tingkat
ekstrak, fraksi, sub fraksi hingga senyawa-senyawa murni akhir.
Dikarenakan efisiensi dan juga muncul kesadaran animal right
maka dikembangkan uji in vitro. Uji in vitro adalah metode skrining
untuk sebelum dilakukan uji in vivo. Jika suatu senyawa dinyatakan
aktif senyawa in vivo dan secara statistik lebih baik atau setidaknya
sama dengan control positif maka disebut dengan senyawa potent.
Uji in vitro dengan target protein dikembangkan dan lebih disukai
karena efisien secara waktu dan material. Uji in vivo dengan hewan
uji tetap dibutuhkan dengan komite etik yang dibuat pada suatu
universitas atau institusi berwenang sebagai acuan.
Tipe uji in vitro in situ in vivo

Target protein/enzim, sel in situ (potongan Hewan uji
kultur, bakteri, jaringan tertentu),
jamur, atau organ
terisolasi
Sampel 1 mg 100- mg-1 g 10 - 100 g
minimal
DOSIS AKTIF: 1-20 g/mL 20-50 g/mL 10-50 mg/kg
ED50 atau IC50 ( kurang dari 10 (atau minimal BB
M, atau minimal sama dengan
sama dengan kontrol positif)
kontrol positif
Tipe uji in vitro in situ in vivo
Signal Western blot hasil up regulasi protein pada jalur
transduksi patologi tertentu atau signal pathway tertentu
Kontrol positif Senyawa poten yang dilaporkan oleh peneliti lain atau
senyawa yang telah terbukti secara klinis
Beberapa konsep dasar yang harus dimengerti untuk

melakukan uji farmakologi, bahwa ada target kelompok populasi
yang dijadikan target perlakuan oleh ekstrak, sub fraksi atau senyawa
murni, ada kelompok populasi yang tidak dikenai perlakuan, ada
kelompok populasi yang tidak dikenai perlakuan oleh suatu obat
sudah dikenal (marketed drug) dengan aktifitas farmakologi yang
kita pilih misal anti bakteri TBC, penurun gula darah, anti kanker,
anti plasmodium dll. Untuk itu harus dimengerti beberapa variable
atau unsur-unsur eksperimen.
Desain dasar eksperimen uji farmakologi meliputi:
Subjek/objek uji : Sekelompok populasi yang mendapatkan
perlakuan sampel ekstrak/fraksi/senyawa
isolat. Perlakuan sampel pada subjek/objek uji
ini harus merupakan dosis bertingkat (seri
dosis). Jika hanya satu dosis saja maka kita
tidak bisa menentukan dosis efektif. Demikian
pula jika hanya satu dosis maka kita tidak bisa
menentukan tipe aktifitas itu berupa aktifitas
yang bergantung pada dosis (dose-dependent
activity) atau aktifitas yang tidak tergantung
dosis (all or none activity) yang sering terjadi
pada senyawa saponin atau penghambat
enzim. Untuk menentukan seri dosis lihat topik
variable bebas di bawah.
Kontrol positif : Sekelompok populasi yang mendapatkan
perlakuan obat yang sudah dikenal memiliki
aktifitas farmakologi tertentu. Populasi harus
memiliki tanggapan (out come) positif yang
sangat tinggi.
Blangko : Sekelompok populasi uji yang mendapatkan
perlakuan penuh 100% aktifitas uji.
Kontrol negatif : Sekelompok populasi yang tidak mendapatkan
treatment sampel uji akan tetapi semua kondisi
sama. Kelompok ini setelah eksperimen harus
memberikan nilai netral.
Kelompok koreksi : Kadang diperlukan kelompok uji yang hanya
mendapatkan perlakuan cairan pembawa saja
(vehicle) misalnya air, buffer, atau pelarut saja
(mis DMSO) dikarenakan bahan-bahan ini
turut mempengaruhi level hasil. Nilai koreksi
ini dikurangi blangko untuk memberikan nilai
basis.
Uji farmakologi dipengaruhi oleh faktor-faktor langsung atau

tidak langsung terhadap subjek uji, untuk itu kita harus memahami
dan memperhatikan variable-variabel dalam eksperimen, yang
meliputi:
Variabel bebas: Yakni perlakuan yang kita pilih langsung terhadap
objek uji misalnya seri kadar/dosis sampel uji (ekstrak/fraksi/senyawa
isolat) yang kita pilih misalnya 1, 2, 4, dan 8 g/ml (in vitro), 20, 50,
100, 250 mg/BB (per berat badan) (uji in vivo dan uji klinik). Untuk
menentukan range variable bebas itu, kita sendiri harus melakukan
uji pendahuluan dosis yang bisa memberikan aktifitas positif atau
dosis acuan. Untuk membuat acuan dosis yang efektif harus mengacu
hasil pada kontrol posisif.
Variabel terkontrol: yakni kondisi-kondisi eksternal dan
mempengaruhi kondisi internal uji. Variable terkontrol yang kita
pilih akan menentukan nilai uji. Untuk itu harus ditentukan
temperatur ruangan, lama inkubasi, kelembaban, keberadaan
cahaya. Variabel terkontrol cukup mengacu ke pada protocol atau
penelitian-penelian yang sama yang sudah terpublikasi.
Variabel tergantung: Ringkasnya adalah hasil yang konsisten dengan
variable bebas yang dipilih. Yakni kondisi yang terjadi akibat
perlakuan (treatment) yang dilakukan terhadap subjek uji misalnya
warna larutan uji yang berubah kepekatan karena terhambatnya
enzim atau matinya sel target (uji in vitro). Variabel tergantung ini
harus fit in order artinya cocok dengan desain penelitian awal
misalnya tingkat tanggapan biologis seiring dengan level dosis yang
dipilih.
Di dalam melakukan uji farmakologi seringkali terjadi suatu
penyimpangan atau kesalahan, yakni:
Kesalahan sistematis (systematic error): Kesalahan sistematik bisa
dipengaruhi oleh variable terkontrol atau tindakan si peneliti
misalnya karena pipet sudah tidak standard, tidak terkalibrasi,
masuknya suatu cemaran, rusaknya enzim uji. Kesalahan sistematis
sangat mudah diidentifikasi karena hasil yang sangat drastis, misalnya
nilai antara hasil kelompok perlakuan, blangko, control negative dan
control positif sama.
Kesalahan acak (random error): Terjadi karena tindakan atau kondisi
yang tidak bisa dihindarkan misalnya variabilitas tindakan karena
pemipetan, pengenceran dan bisa jadi penimbangan. Kesalahan acak
bisa terdeteksi dengan statistik sederhana misalnya antar replikasi
nilai standar deviasi yang sangat besar.
Untuk menjustifikasi suatu sampel poten atau tidak prospektif
maka mengacu pada hasil berikut:
ekstrak: nilai dosis acuan sebaiknya < 10x kontrol positif.
Artinya aktifitas farmakologi yang ditimbulkan ekstrak 10 x
dari aktifitas kontrol positif.
fraksi/sub fraksi: nilai dosis acuan sebaiknya < 5 X nilai kontrol
positif
senyawa murni (isolat): nilai dosis acuan 1 X nilai kontrol
positif
Beberapa sampel ekstrak menunjukkan efek yang sama dengan
kontrol posisif. Di sisi lain fraksi atau senyawa murni memperlihatkan
efek yang lebih rendah dari ekstrak utuhnya.
100
75
% Efek
50
25
0
0,00 1,00 2,00
Dosis
Gambar 5.1 Grafik uji farmakologis harus menunjukkan efek yang

depend (tergantung) dosis. Meski demikian efek tidak akan
pernah 0 atau 100 %. Pada dasarnya bentuk grafik selalu
sigmoid. Software paling simple untuk oleh data adalah
program Excel dan acceptable karena data factual. Akurasi
bisa didapatkan dari angka probit namun tidak harus asal
trend grafik logis. Grafik ideal akan diperoleh dengan
software uji farmakologi komersial.
BAB VI
SKALING UP DAN DEREPLIKASI
Dereplikasi
Tatkala peneliti telah mengetahui material target atau senyawa
target atau ketika membutuhkan jumlah yang lebih banyak untuk uji
farmakologi misalnya maka ia harus memperbanyak senyawa target
dalam tempo cepat. Jika kita memahami sifat fisiko kimia (misalnya
Rt) dan berbagai metode pemurnian maka metode yang baru
ditempuh tidak perlu dilakukan lagi jika terlalu panjang. Untuk
permulaan, penggunaan metode partisi sangatlah menguntungkan.
Metode memperbanyak senyawa target dalam tempo cepat disebut
dereplikasi.
Skaling up
Untuk menemukan senyawa yang poten tidaklah mudah.
Pencarian senyawa aktif bukanlah proses yang murah dan ekonomis.
Setelah ribuan senyawa ditemukan, tidak semua akan menjadi obat.
Seringkali senyawa yang bersifat poten ditemukan dalam konsentrasi
rendah atau sangat rendah misalnya taxol dan vinkristin. Seringkali
pula senyawa poten tersebut ditemukan sebagai struktur baru. Jika
senyawa juga ditemukan pada spesies lain dalam konsentrasi tinggi
tentu tidaklah masalah. Untuk itu harus dipikirkan proses dan
metode yang mampu memperbanyak senyawa target secara
maksimal dan efisien. Skaling up adalah proses perbanyakan senyawa
target terutama untuk tujuan ekonomi. Proses skaling up bisa
dilakukan dengan cara:
- Perbaikan ekstraksi
- Sintetis total atau semi sintesis
Perbaikan ekstraksi dilakukan agar lebih efisiensi dan efektif
yakni diperoleh senyawa target dalam jumlah banyak dengan waktu
yang lebih singkat. Sebagaimana diketahui banyak senyawa alami
memiliki struktur yang rumit dan memiliki atom karbon kiral yang
banyak. Sintesis juga memerlukan beberapa step yang tidak mudah
serta by product atau ruwahan yang tidak diharapkan atau tidak
poten. Proses ekstraksi dilakukan bila sintesis total sulit dilakukan.
Untuk produksi metabolit sekunder dalam jumlah yang banyak
lewat ekstraksi kecermatan menggunakan partisi cair-cair sangat
menentukan. Perbaikan proses ekstraksi bisa ditempuh dengan jalan:
1. Perbaikan cara pengeringan. Beberapa sampel yang
dikeringkan dengan mesin justeru memberikan kadar
kandungan senyawa yang rendah dibandingkan dengan
pengeringan di bawah sinar matahari. Contohnya turunan
kumarin pada sampel herbal Angelica dahurica (Jurnal CIna)
2. Pemilihan pelarut organik yang lebih tinggi daya ekstraksinya.
Jika metanol atau etanol memiliki keterbatasan bisa langsung
mencoba pelarut lain pada waktu ekstraksi sehingga
yield/rendemennnya lebih tinggi.
3. Pemilihan metode ekstraksi yang lebih tepat. Maserasi memang
merupakan metode utama pada tahap ekstraksi kasar karena
simpel dan jumlah bahan sangat fleksibel.
4. Pelibatan aspek fisis: digesti, panas, gelombang microwave.
Faktor-faktor fisis tersebut membantu disolusi dan difusi
senyawa target dari bahan ke larutan.
5. Melibatkan penggunaan arus listrik lemah pada counter current
kromatografi.
6. Pemilihan pelarut untuk partisi yang lebih selektif.
7. Manipulasi pH untuk mendapatkan selektifitas tinggi.
8. Penggunaan adsorben non konvensional: turunan
karbohindrat: siklodekstrin, berbagai sephadex, amilum dst.
Gambar 6.1 Struktur siklodekstrin
BAB VII
EFEK SINERGISME, KOMPLEMENTER, DAN EFEK PLAUSIBLE
Apapun yang dilakukan manusia pasti ada kelemahan dan nilai

negatif. Istilah isolasi mengacu pada sistem reduksionisme dan
simplifikasi sistem biologi. Pemurnian bertujuan untuk simplifikasi
dari berbagai matriks nabati yang dianggap menggangu. Seringkali
tahap ekstrak kasar menunjukkan efek yang sangat poten hampir
sama atau lebih poten dengan kontrol positif. Kini para ilmuwan
farmakognosi menyadari bahwa seringkali fraksinasi, pemurnian dan
hasil senyawa murni justeru memiliki efek yang lebih lemah
dibandingkan dengan efek ekstrak utuh, crude drug, rebusan dan
fraksi sejenisnya. Bahkan seringkali pula bahan semi murni memiliki
hilang efeknya. Namun pada tahap fraksinasi lanjut efeknya turun
atau sama dengan fase ekstrak tentu ini agak mengecewakan.
Material yang lebih murni namun memiliki berefek turun
mengindikasikan keberadaan salah satu peristiwa:
Sinergisme: keradaan salah satu atau beberapa senyawa
menyebabkan penguatan efek kuat dan dramatis, yang jika
beraksi tunggal tidak berefek atau sangat lemah. Pemisahan
menyebabkan efek kecil atau tidak berefek. Senyawa-senyawa
bisa bersifat ajuvan menaikkan absorbsi, menaikkan transport
ke dalam sel terhadap molekul prinsip, atau mencegah efluks
pengeluaran dari sel.
Plausible effect: efek aditif beberapa senyawa pada target
molekuler tunggal. Efek yang diberikan adalah hasil
sumasi/penjumlahan total efek semua komponene. Dan
memiliki efek lebih poten dibandingkan efek sendiri-sendiri.
Komplementer: beberapa senyawa memiliki target molekuler
berbeda namun berazas patologis sama.
Jika salah satu peristiwa ini terjadi maka ekstrak kasar atau
fraksi kasar tetap bisa dikembangkan menjadi bahan obat dengan
menggunakan penanda satu atau beberapa molekul aktif tertentu
sebagai penanda aktif (active marker) atau kimiawi (analytical
marker). Standardisasi untuk menjamin keamanan dan mutu ekstrak
merupakan salah satu topik penting di dalam farmasi pada tingkat
produksi dan aplikasi kedokteran herbal.
Namun demikian molekul alami tetap menjadi salah satu
model untuk pengembangan dan penemuan obat. Dengan
ditemukannya senyawa murni yang kurang aktif maka perlu
modifikasi semi sintesis atau modifikasi farmasetik. Dengan demikian
senyawa murni hanyalah salah satu dari target dan dasar keilmuan
farmasi yang butuh pengembangan dan bantuan disiplin ilmu lain
misalnya kimia medisinal, kimia sintesis, docking komputer, termasuk
ilmu klasik yakni analisis kuantitatif dan standardisasi kimiawi.
BAB VIII
SENYAWA TARGET BERSIFAT POLAR
(SANGAT LARUT DALAM AIR ATAU METANOL)
Target belajar:
Pembaca mampu memahami bahwa metabolit sekunder bukanlah
bahan yang selalu aktif. Seringkali ampas (metabolit primer)
terutama karbohidrat adalah bahan yang lebih poten farmakologis.
Pembaca mampu memahami kelemahan proses ekstraksi dan
kromatografi main stream.
Pada tahap proses fraksinasi terakhir, fraksi yang sangat polar

kebanyakan disebut ampas. Fraksi polar tersebut selalu ditinggal dari
proses isolasi karena keterbatasan metode. Jadi pada kenyatannya
selalu fraksi semi polarlah (etil asetat, butanol, kloroform) yang
menjadi obyek pemurnian untuk mendapatkan metabolit sekunder.
Di sisi lain senyawa yang sangat polar (misal polisakarida) atau non
polar (asam lemak dan derivatnya) cenderung di tinggalkan,
Fenomena di atas linear apa yang terjadi pada mayoritas
masyarakat ilmiah dan kelompok akademik serta masyarakat industri
farmasi herbal mempercayai bahwa untuk meningkatkan jaminan
mutu obat herbal harus diproduksi dalam bentuk ekstrak.
Kebanyakan ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol
kadar tinggi. Pelarut etanol digunakan atas pertimbangan
kemampuannya yang excellent melarutkan mayoritas molekul aktif.
Walau konsorsium obat herbal di dunia juga memperkenankan
beberapa pelarut organik lain seperti metanol, aseton atau etil asetat.
Namun etanol merupakan pelarut organik yang direkomendasikan
untuk mengekstraksi obat herbal sebelum diproduksi dalam bentuk
farmasetis modern.
Trend di atas tentu sangat paradoks dengan apa yang terjadi
pada obat herbal. Obat herbal secara faktual dan historis, beratus
tahun dan turun temurun digunakan dengan cara direbus dengan air.
Masyarakat primitif dan tradisional tidak mengenal pelarut organik
untuk mempersiapkan bahan obat untuk pengobatan tradisional.
Mungkin Kontroversial Mewujudkan Jamu Selain Ekstrak Air?
Masyarakat Industri dan peneliti di kebanyakan universitas
menggunakan pelarut organik karena pertimbangan pragmatis yakni
kemudahan penguapan dan penghilangan dari ekstrak dari pada
menggunakan pelarut air. Di laboratorium penguapan air dari
ekstrak membutuhkan waktu yang cukup lama serta peralatan
mahal. Penguapan bahan berair membutuhkan freeze dryer yang
berharga mahal dengan kapasitas terbatas.
Demikian pula untuk kondisi saat ini persyaratan CPOTB (cara
pembuatan obat tradisional yang baik) lebih mengakomodasi bahan
baku yang diekstraksi dan dipersiapkan dengan pelarut organik. Di
sisi lain sertifikat CPTOB merupakan persyaratan suatu produk layak
registrasi di Badan POM dan edar di masyarakat Indonesia.
Kontroversi Penelitian Obat Herbal

Kebanyakan penelitian obat herbal di perguruan tinggi dan
laboratorium menjadikan bahan-bahan yang diekstrak dengan
pelarut-pelarut organik sebagai obyek kajian utama. Tren dan tradisi
tersebut tidak hanya terjadi di Indonesia namun di dunia. Ada
beberapa alasan yang menjadikan kecenderungan tersebut terjadi:
Pertama, molekul dan senyawa alami yang menjadi target adalah
mikro molekul yang bersifat semi polar. Senyawa semi
polar mudah terekstraksi dengan pelarut-pelarut organic,
etanol, metanol, aseton, etil asetat dll.
Kedua, kebanyakan peneliti masih bersikap menghindari
kesulitan. Hal ini terjadi karena metode kromatografi
mainstream saat ini dan utama yang digunakan dan
menjadi metode rujukan adalah metode yang
kompatibel dengan senyawa semi polar. Fenomena
ini klop dengan poin pertama. Metode kromatografi fase
diam fase normal dan terbalik utama yang
berkembang saat ini mengakomodasi dan difokuskan
untuk senyawa metabolit sekunder. Pada kenyataannya
jamu rebusan kebanyakan dipersiapkan dengan merebus
dengan air.
Ketiga, kebanyakan ilmuwan memiliki interes yang tinggi pada
mikromolekul (metabolit sekunder) karena relatif mudah
dimurnikan dan ditentukan strukturnya.
Dengan demikian tentu cukup kontroversial jika ingin
merepresentasikan obat tradisional dengan cara mengekstraksi
tanaman obat dengan menggunakan pelarut organik dan tidak
representatif menggambarkan obat tradisional yang notabene
digodog.
Rebusan Secara Ilmiah Ternyata Aktif

Secara tidak sadar, periode tahun 2002-2012 ilmuwan di
Institute of Natural Medicine Universitas Toyama Jepang, di
dalamnya beberapa ilmuwan Indonesia termasuk Dr. Tepy Usia
(BPOM) dan Dr. Subehan (Unhas), membuktikan bahwa beberapa
bahan jamu yang disiapkan dengan rebusan air memiliki efek bioaktif
lebih tinggi dari bahan yang disiapkan dengan ekstraksi pelarut
organik (Saifudin dkk, 2012). Analisis yang lebih jauh menggunakan
spektroskopi NMR (Nuclear Magnetic Resonance) menunjukkan
bahwa material jamu yang direbus dengan air tersebut mengandung
polisakarida dalam kadar tinggi dan dominan. Menariknya bukan
terpenoid, fenil propanoid, flavonoid, polifenol atau metabolit
sekunder terlarut dalam air yang lazimnya menjadi interes penelitian
dan riset. Walaupun perebusan dengan air panas masih
memungkinkan mengambil metabolit sekunder terekstraksi namun
tentu dalam kadar sangat minor.
Kandungan Utama Material Polar

Karbohidrat dan polisakarida adalah kandungan utama dari
ekstrak air atau ekstrak polar lain termasuk ekstrak metanol.
Hal itu tercermin pada salah satu contoh yang penulis sajikan
sampel kayu manis (Cinnamomum burmanii), meskipun dikenal
sebagai bumbu dapur namun memiliki efek anti diabetes tipe II yang
poten. Ekstrak air komponen jamu ini mengandung polisakarida
(Gambar) sebagai komponen utama. Sedangkan menurut studi
fitokimia lebih lanjut pada ekstrak pelarut organik (metanol) kaya
akan fenil propanoid dan polifenol terutama sinamal dehida
(Subehan dkk, 2002). Walaupun kedua ekstrak berefek terkait anti
diabetes (Saifudin dkk, 2012). Dengan demikian metabolit primer
(polisakarida dan karbohidrat) juga penting untuk memberikan efek
farmakologis.
Gambar 8.1 Spektra 1H NMR ekstrak air

kayu manis (Cinnamomum burmanii)
yang menunjukkan keberadaan
polisakarida (geseran kimia 3 4,5
ppm) yang bertanggung jawab
memberikan efek farmakologis.
Pemisahan Senyawa Polar

Polisakarida dalam topik pengobatan modern memiliki peran
penting. Beberapa vaksin merupakan turunan polisakarida.
Sebagaimana diungkapkan di depan bahwa sistem pemisahan
mainstream utama saat ini hanya bisa memisahkan senyawa yang
bersifat semi polar. Sistem pemisahan mainstream yang dimaksud
adalah fase diam silika dan ODS. Di sisi lain secara realitas pada
praktek bioassay-guided fractionation sering kali dijumpai fraksi yang
bersifat polar (MeOH atau air) lebih poten dari pada fraksi semi
polar. Tentu material dan senyawa yang larut dalam air sangat sulit
(hampir tidak bisa) dipisahkan dengan adsorben di atas. Untuk
diketahui bahwa senyawa yang bersifat sangat polar akan berada
dasar tempat penotolan KLT setelah dielusi pada fase normal dan
terbawa fase gerak pada fase terbalik. Kebalikannya adalah lemak.
Walaupun solven diganti tetap saja terjadi demikian.
Untuk memisahkan ekstrak air (diperoleh dengan cara maserasi
digesti dengan air panas 1-2 jam) dilakukan prosedur:
- Filtrasi dengan kapas untuk menghilangkan material tak larut
air.
- Dialisis
- Kromatografi resin: ion exchange
- Filtrasi Gel Sepharose
- Sephadex LH-20
- Elektroforesis
Penentuan Struktur Polisakarida

Untuk polisakarida, bobot minimal yang diperlukan adalah 20
mg untuk NMR. Karena geseran kimia atom hidrogen akan
menumpuk pada area 3-4 ppm. Demikian pula geseran kimia karbon
akan berada pada daerah 70-90 ppm.Untuk menentukan struktur
golongan polisakarida NMR tidak bisa terlalu diandalkan.
Penentuan struktur polisakarida strukturnya lebih
mengutamakan dengan alat GC-MS dengan membandingkan
standard monosakarida-monosakarida.
Adapun penentuan penentuan kemurnian dan kadarnya
menggunakan HPLC dengan detektor RI (Refraktive Index).
Dengan demikian, secara umum pemurnian polisakarida
memerlukan treatmen khusus dan lebih rumit karena melibatkan
berbagai kromatografi eksklusi dengan berbagai fase diam
polisakarida.
Karena pemurnian terkendala dengan kompleksitas matriks
nabati, polisakarida saat ini cenderung dihasilkan dari ekstraksi hasil
fermentasi bakteri atau sintesis.
Fair dalam Fokus Penelitian Jamu

Walaupun mayoritas interes penelitian tanaman obat dan jamu
adalah melakukan ekstraksi, fraksinasi dan purifikasi senyawa
metabolit sekunder, akan lebih fair jika perguruan tinggi dan para
peneliti tidak menghindari ekstrak air. Secara real kendala peralatan
yang tidak kompatibel dengan material larut air memang tidak bisa
dihindari. Sambil menunggu terobosan sains dan teknologi metode
ekstraksi, saat ini ranah penelitian yang bisa dijangkau adalah aspek
khasiat dan toksisitas ekstrak air.
Jadi, encouragement dan kampanye meminum jamu rebusan
dan melestarikan jamu gendong, dorong, bonceng serta pembuat
jamu rebusan yang merupakan profesi yang mulai terpinggirkan dan
punah juga perlu dilakukan. Agar khazanah jamu rebusan tidak
hilang dari pustaka empiris pengobatan !
Lebih jauh lagi, jamu rebusan tetap memiliki masa depan dan
tetap memiliki khasiat baik ilmiah maupun empiris. Jamu tidak
representatif jika digambarkan dengan metabolit sekunder semata-
mata. Jamu tidak selalu harus diekstraksi. Obat tradisional tidak
selalu tepat jika harus diisolasi dan ingin diketahui zat yang
bertanggung jawab secara farmakologis. Mungkin biarlah
kebanyakan jamu ada dalam bentuk rebusan air karena:
Pertama, kenyataannya metode kromatografi dan metode
karakterisasi yang ada saat ini hanya kompatibel dengan
metabolit sekunder.
Kedua, karakterisasi dan metode elusidasi struktur termasuk NMR
dan kebanyakan spektroskopi yang ada saat ini hanya
mampu mengkarakterisasi mikromolekul.
Ketiga, sinergisme dan plausible effect seringkali teramati dan
terjadi pada obat tradisional untuk memberikan efek.
BAB IX
PENENTUAN STRUKTUR/ELUSIDASI STRUKTUR
Untuk menentukan struktur suatu molekul organik cara

standard dan yang merupakan golden method adalah menggunakan
spektroskopi NMR (nuclear magnetic resonance). Metode NMR
memberikan informasi jumlah proton dan karbon, lingkungan
kimiawi proton dan karbon. Dengan metode NMR ini akan
diperoleh data-data yang sangat informatif. Hampir dikatakan
bahwa NMR merupakan tulang punggung elusidasi struktur.
Pemahaman struktur senyawa kimia berbasiskan jalur biosintesis
(lihat Bab awal) sangat membantu menentukan struktur. Membaca
referensi tentang hubungan kekerabatan dan kandungan metabolit
sekunder material yang diteliti juga sangat membantu. Jika sudah
biasa, informasi dari 1H NMR dan 13C NMR sudah cukup untuk
menentukan apakah suatu senyawa merupakan senyawa baru (novel
compound) atau senyawa yang sudah diketahui (known compound).
Dengan melihat chemical shift ( ppm) dan pemecahan puncak
(splitting patterns) dari NMR proton dan karbon kemudian
membandingkan dengan spektra dari paper di suatu jurnal seringkali
sudah cukup untuk men-justifikasi novelty suatu senyawa. Kedua
jenis spektra NMR merupakan sidik jari suatu molekul yang sangat
otentik. Jadi tidak perlu buru-buru diambil 2D NMR jika suatu
senyawa memiliki spektra NMR proton dan karbon sama dengan
artikel terpublikasi di suatu referensi.
NMR juga tidak bersifat dekstruktif sehingga bahan uji bisa di-
recovery. Seringkali senyawa baru (new compound) atau rendemen
hasil sintesis memilki kadar yang kecil. Metode analisis yang bersifat
un desktruktif salah satunya NMR paling diandalkan. Adapun
spektrofotometri IR (infra merah), UV (ultraviolet), MS (mass
spektrometri), dan kristalografi dilakukan setelah dipastikan bahwa
senyawa yang ditemukan adalah senyawa baru atau suatu
permintaan khusus (supervisor, editor jurnal, dll) untuk menentukan.
Seringkali senyawa organik memiliki steriosenter atau karbon
asimetris, yakni karbon yang mengikat 4 macam substituent yang
berbeda tentu ke-4 subsituent akan memiliki letak dalam ruang atau
spasial sendiri-sendiri atau 3 dimensi. Dengan demikian dari NMR
akan diperoleh informasi, 1. struktur datar (planar structure), 2.
Struktur dalam ruang tiga dimensi. Metode NMR bisa digunakan
untuk menentukan kiralitas adalah NOE (Nuclear Overhausser Effec),
NOESY, dan ROESY.
Untuk memperoleh spektra 13C NMR diperlukan waktu yang
lebih lama karena di alam raya abundance 13C hanya 1 % dari 12C.
Adapun 1H memiliki kelimpahan mayoritas dibanding 2H atau 3H
yakni 99%. Bobot minimal agar diperoleh spektra 1H NMR yang
adalah 1 mg. Namun untuk efisiensi dan kecepatan memperoleh
data, maka bobot yang diperlukan setidaknya 5 mg. Untuk
memperoleh data proton 1H NMR biasanya cukup waktu kurang
dari 5 menit. Sedangkan untuk memperoleh data karbon 13C NMR
diperlukan waktu lebih panjang, biasanya untuk bobot 10 mg
memerlukan waktu 1-3 jam.
Bobot minimal yang diperlukan untuk elusidasi struktur dengan
NMR sebaiknya tidak kurang dari 3 mg agar efisien. Meskipun bobot
0.6-1 mg masih tetap bisa menghasilkan spektrak yang cukup jelas
pada mesin NMR 400 MHz. Elusidasi struktur bukanlah pekerjaan
yang sulit, hanya masalah kebiasaan dan ketekunan. Sering bekerja
dengan sampel selama 6 bulan akan diperoleh intuisi dan mindset
suatu spektra.
Berdasarkan urutan bekerja, metode NMR ada 2 macam yakni:
1. satu dimensi (1D)
2. dua dimensi (2D)
1D NMR terdiri dari 1H NMR dan 13C NMR masing-masing
untuk menentukan jumlah proton dan karbon serta basis lingkungan
kimiawinya.
2D NMR digunakan untuk menentukan secara detail
lingkungan antara proton dan karbon dan atom lain. Untuk
menentukan struktu kimia tidak harus semua metode itu ditempuh.
Untuk senyawa yang sudah diketahui (known compound) cukup
hanya 1D NMR dengan cara membandingkan data 1H dan 13C NMR
dengan senyawa yang sama dan telah terpublikasi di pustaka
(terutama berbagai jurnal di internet). Mesin NMR dengan produsen
berbeda seringkali memberikan hasil data yang sedikit berbeda angka
desimal atau bahkan 1-2 point namun hal ini masih merupakan data
yang sama. Hanya senyawa baru (novel compound) saja yang
membutuhkan semua data 2D secara detail. Biasanya di dalam
pekerjaan isolasi pada suatu spesies ditemukan 1-5 senyawa baru,
jadi tidak selalu harus mengambil data semua, terlebih lagi jika
memang tujuannya
Referensi Kemotaksonomi
Pemahaman dasar-dasar biosintesis metabolit sekunder secara
baik akan sangat membantu melakukan interpretasi data
spektroskopi NMR. Demikian pula untuk mempermudah dan
membantu menganalisis data NMR. Membaca publikasi ilmiah
(jurnal) yang membahas kandungan kimia suatu spesies, laporan
tentang konstituen kimiawi suatu genus seringkali ditempuh oleh
para peneliti bidang farmakognosi. Demikian juga melakukan cross
referensi tentang data-data NMR-nya.
Spektra 1H NMR memberikan data:

, chemical shift (geseran kimia) antara 015 dengan satuan
ppm dari standard internal. Geseran kimia antara
Jenis atom tetangga karbon pengikat H. Pada prinsipnya jika
karbon mengikat atom elektronegatif maka posisi geseran
kimia pada angka yang lebih besar:
CH3 (1,5-0.5 ppm), CH2 (1-2 ppm)
CH2= (4,5-5 ppm), CH3-C= (1,2-1,9 ppm)
-CH-O (3-4,5 ppm)
-CH benzil (7-8 ppm) dst
Rasio relatif jumlah atom H. Semakin tinggi puncak
menandakan jumlah hidrogen semakin banyak. Noise atau
puncak gangguan memiliki intensitas sangat pendek pada dasar
spektra. Adapun puncak standard diambil yang memiliki
intensitas terendah. Biasanya rasio merupakan kelipatan 1
(1:2:3, dalam suatu molekul tangan karbon hanya mengikat
maksimal 3 atom hidrogen).
Splitting pattern 1: bentuk pemecahan spektra,
menginformasikan berapa jumlah proton pada karbon
tetangga.
Splitting pattern 2: dua hidrogen yang terikat pada satu karbon
(disebut proton germinal) kadang memiliki sifat magnetik yang
sama
Spektra 13C NMR memberikan data:

Jumlah karbon dalam suatu senyawa.
Posisi atom karbon. Posisi dinyatakan sebagai geseran kimia c
(0-200 ppm)
Karbon SP3 terletak antara 1-20 ppm, karbon yang mengikat
atom O (68-90 ppm), karbon metilen -CH2- (30-45 ppm), -
CH-(45-52 ppm), C=O (170-180ppm), C=C (100-130 ppm),
C-benzil (140-160 ppm).
Spektra NOE (Nuclear overhauser effect):

Adalah spektra yang menunjukkan interaksi 2 atom hidrogen
dalam ruang (3 dimensi). NOE disebut juga dengan analisis
kedekatan hidrogen dalam ruang (bukan ikatan kimiawi seperti
COSY).
Peranan pelarut
Secara umum pelarut yang handal untuk pengukuran NMR ada
dua, yakni kloroform dan metanol terdeutronasi. Kloroform handal
digunakan untuk senyawa yang cenderung semi polar. Ia memiliki
spektra yang bersih. Metanol melarutkan sampel yang cenderung
polar (kaya gugus hidroksi). Namun metanol cenderung melarutkan
berbagai impuritis. Spektra cenderung kotor. Seringkali pula metanol
juga mampu melarutkan senyawa yang larut dalam kloroform. Air
terdeutronasi (D2O) digunakan untuk senyawa yang sangat polar
misalnya glikosida bergula banyak atau golongan karbohidrat.
Seringkali aseton, piridin, dan DMSO terdeutronasi digunakan
untuk melarutkan senyawa semi polar. Mengganti pelarut seringkali
dilakukan dan perlu dilakukan untuk memunculkan puncak hidrogen
yang tersembunyi. DMSO sebaiknya digunakan jika tidak ada pelarut
yang tidak bisa melarutkan. DMSO sulit diuapkan. Jika isolat
kadarnya kecil menyulitkan recovery. Pemunculan dan spektra yang
berbeda dari berbagai pelarut juga bermanfaat untuk
mengkarakterisasi berbagai isomer. Seringkali spektra proton saling
tersebunyi atau overlap. Bisa muncul dengan penggantian pelarut.
Spektra 2D NMR memberikan informasi:

HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence ):
Spektra ini adalah pengimpitan horizontal vs vertical antara
signal 1H NMR vs 13C NMR. HMQC memberikan informasi
jumlah hidrogen yang terikat oleh suatu karbon.
COSY (Correlated Spectroscopy): Spektra adalah pengimpitan
horizontal vs vertical spektra 1H NMR. COSY memberikan
informasi jumlah hidrogen berjarak 1 karbon atau pada proton
yang sama.
HMBC (Heteronuclear Magnetic Bond Correlation): Spektra ini
adalah pengimpitan horizontal vs vertical antara signal 1H
NMR vs 13C NMR. HMBC memberikan informasi posisi suatu
atom hidrogen terhadap 2-3 atom karbon.
Ketiga 2D NMR metode di atas adalah cara umum adapun
HSQC, TOCSY dll mudah dimengerti setelah memahami HMQC,
COSY, dan HMBC.
ROESY (rotating-frame nuclear Overhauser effect correlation
spectroscopy) dan NOESY (Nuclear Overhauser effect
spectroscopy) untuk mengetahui korelasi hidrogen dengan
hidrogen karena berdekatan di ruangan 3 dimensi. Dua
metode ini digunakan untuk menentukan kiralitas. Akan tetapi
NOE lebih akurat sebab di dalam ROESY dan NOESY signal
juga terkandung COSY signal.
Data NMR diambil pertama kali disamping sangat informatif,
pekerjaan NMR tidak bersifat dekstruktif sehingga tidak merusak
isolat sehingga bisa di-recovery lagi. Namun jika isolat diperoleh
dengan konsentrasi tinggi misalnya lebih dari 50 mg maka semua
pengambilan spektra bisa diambil secara simultan. Setelah diperoleh
spektra NMR pekerjaan selanjutnya mengukur berat molekul dengan
spektroskopi massa.
MS: Massa Spektroskopi
Prinsip dasar dari metode ini adalah membuat suatu molekul
netral menjadi bermuatan sehingga bisa dideteksi. Secara prinsip
dasar asam atau basa lemah dijadikan sebagai sumber ion bersama
pelarut. Informasi yang diperoleh adalah berat ion, yakni massa
molekul isolate ditambah atau dikurangi sumber ion. Biasanya
disajikan dalam [M+H]+ atau [M-OH]- atau dalam bentuk radikal
[M]+ , dst. Jadi berat molekul sesungguhnya diperkirakan berkurang
satu, bertambah satu, atau angka yang mendekati. Adakalanya
ionisasi melalui penambahan berat molekul air. Untuk itu
kecermatan dalam mengesitimasi dan pengalaman sangat diperlukan.
Adapun, bobot isolat yang dibutuhkan untuk spektroskopi massa ini
sangat kecil. Lebih disukai sekitar 0,5 mg/mL.
Tujuan utama metode ini adalah untuk mengetahui berat
molekul. Ada beberapa metode dasar cara ionisasi spektroskopi yang
yakni APCI (atmospheric pressure chemical ionization), ESI (electro
spray spectroscopy), atau FAB (Fast atomic bombardment). APCI
digunakan untuk senyawa yang cenderung polar, ESI digunakan
senyawa yang kurang polar atau non polar, FAB digunakan untuk
molekul kecil namun memberikan fragmentasi tidak terkendali
namun informatif terhadap elemen penyusun molekul (analisis
elemental). Lebih jauh spektroskopi akan memberikan informasi pola
fragmentasi. Pola fragmentasi sangat penting untuk melihat
perbedaan senyawa-senyawa yang memiliki berat molekul sama.
Dengan pola fragmentasilah meraka akan bisa dibedakan. Seringkali
beberapa senyawa memiliki spektra NMR yang sama namun pada
hakekatnya mereka adalah stereoisomer. Selain besar angka rotasi
aktif, pola fragmentasi juga memberikan informasi perbedaan antar
stereoisomer. Peralatan modern hyphenated instrument yakni
mengintegrasikan kromatografi cair dengan massa spektroskopi (LC-
MS) lebih memberikan informasi lebih baik. Jika metode LC-MS
digunakan biasanya senyawa dilarutkan di dalam metanol. Adapun
metode MS tunggal bisa menggunakan beberapa matriks seperti
gliserol sebagai media untuk isolat.
IR: Infra Red spektroscopy memberikan informasi gugus-gugus
fungsional yang dimiliki oleh suatu senyawa. Pada era sekarang
spektra IR bisa dianggap sebagai data sekunder dan bukan utama.
Metode ini dilakukan setelah diperoleh NMR dan MS. Spektra IR
akan memberikan informasi gugus fungsional. Maka media vehicle
untuk pengukuran metode ini adalah senyawa yang tidak memiliki
gugus fungsional. Kloroform atau diklorometana adalah pelarut
pilihan utama untuk pengukuran spektra IR. Jika tidak larut ke dalam
kedua jenis solven maka diserbukkan bersama KBr (kalium bromida).
Untuk menginterpretasikan kita cukup membandingkan dengan
berbagai tabel pada buku-buku standard misalnya yang ditulis
Silverstein (1998) atau Pavia dan Kriz (2004). Puncak-puncak yang
diberikan ibarat sidik jari dank has untuk gugus fungsional maka
cenderung mudah ditebak.
Pertanyaan:
Mengapa KBr digunakan sebagai matriks dalam pengukuran
IR?.
Mengapa metanol atau etanol yang merupakan pelarut
universal tidak direkomendasikan sebagai pelarut IR?.
UV-VIS: Ultra violet-Visible. Spektra ini digunakan untuk

mengidentifikasi berapa panjang velombang maksimal ( max) suatu
isolat. Untuk era sekarang spektra ini juga merupakan data sekunder
dan tidak terlalu informatif. Secara kasar suatu senyawa tidak akant
terlihat pada cahaya tampak maka ia akan memiliki max > 400
nm. Senyawa yang tidak tampak pada cahaya visible maka akan
memiliki lambda maksimum antara 240-380 nm. Namun jika pada
area ultra violet atau visible suatu senyawa tidak tampak maka
kemungkinan tidak memiliki kromofor sebagaiman polisakarida.
Informasi tersebut sangat berguna di dalam menentukan
instrumentasi yang tepat untuk melakukan analisis kuantitaf.
Senyawa yang mampu mengabsorbsi panjang gelombang UV/VIS
maka detektor PAD bisa digunakan. Di sisi lain senyawa yang tidak
memiliki tanggapan sebagai mana turunan polisakarida maka
detekor RI (refractive index) bisa digunakan.
BAB X
ELUSIDASI STRUKTUR BEBERAPA SPEKTRA METABOLIT
SEKUNDER
Target Belajar: Pada tahap permulaan mahasiswa memerlukan

spektra 1 dan 2 dimensi yang lengkap (1H NMR, 13C NMR, COSY,
HMQC, HMBC) untuk menentukan struktur planar atau struktur 2
dimensi suatu senyawa. Jika sudah terbiasa dan telah memahami
kerangka jalur biosintesis secara baik maka seringkali cukup 1H dan
13C NMR dengan HMBC sudah bahkan cukup data 1 dimensi saja
bisa digunakan untuk membantu menentukan struktur. Karena

kebanyakan metabolit sekunder sudah diketahui sehingga cukup
membandingkan dengan data terpublikasi. Jika data sama maka
merupakan senyawa yang sama. Untuk membuat laporan seorang
peneliti harus memberikan data lengkap baik 1 dan 2 dimensi NMR.
Sedangkan data untuk dipublikasi di jurnal internasional bereputasi
baik, jika memfokuskan aspek kimia, biasanya data 1H dan 13C NMR
saja yang disajikan. Hanya senyawa baru saja yang perlu lengkap
diskripsinya termasuk 2 dimensi NMR.
Di dalam mata kuliah spektroskopi atau elusidasi struktur

seringkali memberikan urutan spektrak MS, UV-VIS, IR, rotasi optis,
baru data NMR. Di dalam praktek data NMR lah yang pertama
diambil dan difokuskan baru kemudian data MS pada tahap terakhir.
Sedangkan data-data lainnya hanya sekedar data konfirmasi
tambahan. Dengan demikian data NMR merupkan data primer dan
golden standard.
Senyawa tidak melulu memiliki struktur planar (2 dimensi).
Cukup banyak senyawa yang memiliki karbon kiral. Konsekuensinya
senyawa jenis ini memiliki struktur dalam ruang atau memiliki
struktur 3 dimensi (3D). Setelah memahami cara menentukan
struktur planar kemampuan mahasiswa harus meningkat yakni
mampu menentukan struktur 3 dimensi dengan bantuan model
struktur kimia dan spetra NOE, NOESY, atau ROESY. Proses itu
disebut dengan penentuan stereokimia relatif. Untuk menentukan
struktur mutlak digunakan CD cotton (tidak dibicarakan di sini).
Senyawa 1
1
H NMR C NMR
13
TM
TM
1H NMR menunjukkan cukup banyak proton yang terletak

pada posisi kurang dari 2 ppm. Hanya terdapat proton singlet pada
posisi 6 ppm yang terisolir. Harap mengabaikan puncak tinggi
namun lebar pada 4,8 ppm (atau pada suatu spektra lain) karena ia
adalah solven atau impuritis (tidak selalu pendek). Abaikan juga
spektra pada 0 ppm karena ia adalah standard TMS (Tetra Metil
Silan). Pada 13C NMR menunjukkan 11 buah sinyal karbon. Harap
mengabaikan puncak tebal dan tinggi pada 50 ppm karena ia adalah
puncak solven CD3OD. Pada spektra tersebut terlihat 6 buah sinyal
karbon pada posisi lebih dari 100-205 ppm. Mereka adalah karbon
aromatis. Terdapat 4 karbon alifatik 15-40 ppm dan 80 karbon metil
olefin.
Pada HMQC mengkonfirmasi semua posisi hidrogen tersebut
terutama metil 1,8 ppm yang berkorespondensi pada 80 ppm. Pada
DEPT mengkonfirmasi bahwa mayoritas proton/hidrogen terikat
oleh karbon alifatik yang merupakan CH 2. Sedangkan karbon
terendah mengikat 3 buah hidrogen. Sekaligus membuktikan bahwa
karbon yang sangat pendek jumlah protonnya bisa banyak.
Sedangkan pada karbon 6 ppm terkonfirmasi ia terikat pada satu
karbon aromatis.
Untuk mengkonfirmasi di mana rantai alifatik mengikat cincin
benzen bisa dilihat dari HMBC. Pada spektra tersebut proton
terisolasi 6 ppm tersebut berkorelasi dengan karbon karbonil dan
proton terhidroksilasi. Posisi diperjelas dengan korelasi antara
proton triplet dengan karbon karbonil tersebut. Selain itu korelasi
tersebut juga mengkonfirmasi bahwa ujung CH2-CH2 merupakan
karboksilat. Terlihat dari korelasi proton metilen dengan karbon 208
ppm. Gugus metil berposisi meta terhadap proton terisolasi
dikonfirmasi dengan korelasi dengan dua sinyal karbon aromatis.
Spektra MS mengkonfirmasi berat molekul senyawa tersebut tepat
sesuai dengan simulasi struktur NMR. Sehingga struktur senyawa
tersebut seperti pada gambar.
HMQC DEPT
HMBC
Gambar struktur senyawa

berdasarkan data NMR 1 dan 2
dimensi. Garis tebal menunjukkan
COSY. Anak panah menunjukkan
HMBC.
Konfirmasi Spektra MS [HR-ESI-MS: 253,0718]

Inten.(x1,000,000)
3.0 253.0718
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 m/z
Senyawa 2
1
H NMR
13
C NMR
1 1 7
Spektra 1H NMR menunjukkan keberadaan 4 buah metil (-

CH3). Dua diantaranya pada 1,6 ppm overlap dengan puncak tinggi.
Puncak pada 2,4 dan 2,8 ppm adalah metil olefinik. Yakni metil
yang terikat pada karbon ikatan ganda (C=C). Sedangkan 1,6 ppm
(tinggi) pada 75 ppm. Anda tahu bahwa senyawa yang kaya dengan
gugus metil adalah golongan terpenoid. Harap mengabaikan puncak-
puncak yang pendek karena ia adalah impurities atau kontaminan.
Pada spektra 13C NMR menunjukkan keberadaan 15 jumlah
karbon yang mayoritas terletak di daerah kurang dari 70 ppm.
Harap mengabaikan puncak karbon yang sangat tinggi pada C NMR
karena ia adalah solven CDCl3. Anda tahu pula bahwa 15 adalah
kelipatan dari 5 (isopren). Hanya terdapat 9 karbon pada daerah
ikatan ganda. 4 diantaranya overlap terlihat 2 puncak tinggi (bernilai
masing-masing 2 karbon). Pada spektra COSY menunjukkan bahwa
dua puncak triplet proton pada geseran kimia 2,6-2,8 ppm masing-
masing bernilai 3 proton saling berdekatan. Dua buah puncak
doublet pada 6,8 dan 7,2 ppm saling berdekatan. Dengan demikian
senyawa tersebut adalah seskuiterpen yang kaya dengan ikatan
ganda. Selain itu tidak ada metilen, yakni karbon tersier terlihat tidak
adanya signal karbon antara 44-60 ppm. Jadi bisa disimpulkan
bahwa senyawa tersebut adalah sekuiterpen tipe guaian. Yakni
seskuiterpen yang bercincin tunggal yang tersusun 10 karbon.
Untuk menentukan kedudukan keempat metil tersebut harus
dilakukan HMBC. Terlihat cross peak metil 1,6 ppm sangat jelas
terlihat pada dua signal karbon pendek 70 ppm dan 156 ppm.
Sedangkan metil pada 2,4 ppm terletak berdekatan posisi karbon
olefin dan karbon karbonil 180 ppm. Sedangkan metil pada 2,2
terletak berdekatan dengan dua buah karbon vinilik. Sehingga
disimpulkan struktur sebagaimana pada gambar, yakni suatu
seskuiterpen guaian.
COSY HMQC
HMBC
Gambar struktur senyawa

berdasarkan data NMR 1 dan 2
dimensi. Garis tebal menunjukkan
COSY. Anak panah menunjukkan
HMBC.
Konfirmasi Spektra MS [HR-ESI-MS: 249.1481]
Inten.(x100,000)
249.1481
5.0
4.0
231.1310
3.0
2.0
1.0
0.0
50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 m/z
Senyawa 3
Penentuan Stereokimia Relatif
Untuk menentukan struktur 2D (dua dimensi) atau disebut
dengan struktur planar tidaklah terlalu sulit. Seringkali Anda akan
menjumpai struktur yang memiliki 3D di dalam ruangan. Mengapa ?.
Anda telah mengenal istilah karbon kiral. Yakni karbon yang
mengikat empat gugus fungsional yang berbeda. Maka ia akan
memiliki struktur 3 dimensi. Ada dua cara penentuan struktur yakni
secara relatif atau secara mutlak. Secara relatif seringkali cukup
menggunakan model struktur kimia dibantu dengan data NOE
spektra, NOESY, dan ROESY. Data dari NOE lebih disukai karena
tidak ada unsur COSY. Jadi jika memiliki data NOESY atau ROESY
perlu diklarifikasi dengan data COSY.
Untuk menentukan stereokimia, struktur dua dimensi harus
final dan selesai terlebih dahulu. Contohnya di bawah ini.
Termasuk senyawa golongan apakah ini?

Dari kedua spektra 1H yang kaya dengan metil kemudian
berdasar 13C NMR tampak senyawa memiliki 15 buah karbon yang
berlokasi <60 ppm. Berdasarkan fakta itu Anda tidak kesulitan
menyimpulkan bahwa senyawa tersebut adalah suatu seskuiterpen.
Berdasarkan analisa COSY,
HMQC, dan HMBC maka struktur senyawa tersebut adalah
seperti pada gambar X. Namun struktur 2 dimensi tersebut tidaklah
cukup. Ada 3 karbon kiral.
1
H NMR
13
C NMR
COSY HMQC
HMBC
Gambar struktur senyawa ber-

dasarkan data 1 dan 2
D NMR
Anda harus menentukan orientasi atau arah gugus-gugus

fungsional yang terikat. Untuk menentukan orientasi hidrogen maka
dilakukan pengukuran NOE. Salah satu hidrogen pada karbon 1,2,
dan 3 di radiasi. Jika terdapat proton yang signalnya naik maka
menunjukkan kedekatan. Sebaliknya, jika justeru sinyal lemah
menunjukkan arah yang berlawanan.
Gambar struktur senyawa berdasarkan data
NOE proton1 menunjukkan respon setelah
proton 2 diiradiasi namun tidak untuk
proton 3 (metil). Konfirmasi dengan iradiasi
proton 3 menunjukkan tiadanya respon
kenaikan sinyal pada proton 2. Data
tersebut menginformasikan bahwa 1 dan 2
memiliki orientasi yang sama. Namun 3
berlawanan.
Senyawa 4
1H NMR spektra di atas menunjukkan keberadaan 6 hidrogen

pada geseran lebih dari 6 ppm. Daerah tersebut adalah daerah
proton aromatis. Geseran kimia memperlihatkan sistem ABX. Yakni
terjadinya kopling konstan pada posisi meta dan para. Pada daerah
4-5 ppm adalah area proton yang terikat pada karbinil (karbon yang
teroksigenasi). Sedangkan dua puncak tinggi pada 3,8 dan 3,9 ppm
adalah gugus metil metoksi (-OCH3). COSY spektra mengkonfirmasi
kedekatan proton pada 3,8 dan 3,9 ppm (doublet). COSY juga
mengkonfirmasi sistem ABX tersebut bahwa dua proton 6,2 dan 6,4
ppm berdekatan karena berposisi meta dan saling mengkopling
lemah 4 Hz. Tiga proton pada 6,9; 7,2; dan 7,4 ppm berdekatan
dengan posisi orto, meta, dan para.
Pada spektra 13C NMR spektra menunjukkan keberadaan 17
buah puncak sinyal karbon. Puncak tebal dan tinggi pada 75 ppm
harap diabaikan ia adalah solven CDCl3. Kebanyakan puncak berada
> 100 ppm sebanyak 15 buah. Jadi ada dua kemungkinan yakni
terpenoid atau flavonoid. Kedua kelompok senyawa tersebut
memiliki jumlah karbon yang sama. Secara mudahnya senyawa
tersebut adalah flavonoid. Flavonoid memiliki 12 buah karbon
aromatis dan 3 jembatan propanoid.
HMBC mengkonfirmasi posisi metoksi 3,7 ppm berada pada
cincin A, berposisi meta terhadap hidroksi. Sedangkan metoksi 3,9
berposisi orto terhadap rantai propanoid pada cincin B. Struktur
senyawa tsb disimpulkan seperti pada gambar.
(mirisitrin)
Spektra H NMR memiliki 5 proton di daerah 5,3-7 ppm.

Puncak tinggi pada 7 ppm menunjukkan dua buah proton overlap. 3
proton lain menunjukkan splitting sistem ABX. Daerah tersebut
adalah daerah aromatis /benzen. Adapun puncak broaden dan tinggi
pada 4,9 ppm adalah kontaminan solven. Puncak sinyal hidrogen
antara 3,2-4,2 ppm menununjukkan puncak karbinil (karbon yang
teroksigenasi). Secara ringkas daerah tersebut adalah daerah gula.
Keberadaan puncak metil 1 ppm mengkonfirmasi metil gula. Adapun
dua puncak tinggi masing-masing pada daerah 2 dan 3 ppm
merupakan kontaminan solven metanol dan aseton.
Spektra C NMR menunjukkan keberadaan 20 karbon. 15
karbon berada di daerah vinilik dan 5 karbon berada di daerah
karbon teroksigenasi. Dari spektra tersebut karbon tersebut
menunjukkan gula tipe glukosa. Sedangkan 15 karbon sangat jelas
merupakan kerangka flavonoid. Tanpa menggunakan spektra 2D
(COSY, HMQC, HMBC) senyawa tersebut bisa disimulasi
strukturnya. Ia merupakan glikosida. Anda jangan terlalu
menggantungkan spektra lengkap. Para peneliti biasanya dengan
data H dan C NMR sudah bisa menentukan strukturnya kemudian
mengkonfirmasi dengan data 1D NMR senyawa terpublikasi. Khusus
untuk flavonoid, kerangkanya tidak terlalu rumit sehingga mudah
ditebak. Kemudian jika betul-betul senyawa baru saja dan tidak
sesuai dengan satu pun publikasi data 2 D diperlukan untuk diukur.
Senyawa 5
Cocokkanlah data 1 dan 2 D NMR berikut ini terhadap struktur yang
diberikan.
Senyawa 6
Cocokkanlah data-data 1 dan 2 D NMR berikut ini terhadap struktur
yang diberikan !
REFERENSI
Dewick, M, Natural Products Biosynthetic, Humana Press, London.

Newman, D. J., & Cragg, G. M. (2007). Natural Products as Sources
of New Drugs over the Last 25 Years. Journal of natural
products, 70(3), 461-477.
Newman, D. J., Cragg, G. M., & Snader, K. M. (2000). The influence
of natural products upon drug discovery. Natural product
reports, 17(3), 215-234.
Newman, D. J., Cragg, G. M., & Snader, K. M. (2003). Natural
products as sources of new drugs over the period 1981-2002.
Journal of natural products,66(7), 1022-1037.
Pavia, D., Lampman, G., Kriz, G., & Vyvyan, J. (2008). Introduction
to spectroscopy. Cengage Learning.
Saifudin A, Kadota S, Tezuka Y. Protein tyrosine phosphatase 1B
inhibitory activity of Indonesian herbal medicines and
constituents of Cinnamomum burmannii and Zingiber
aromaticum. J Nat Med. 2013 Apr;67(2):264-70
Saifudin A, Tanaka K, Kadota S, Tezuka Y Protein tyrosine
phosphatase 1B (PTP1B)-inhibiting constituents from the
leaves of Syzygium polyanthum. Planta Med. 2012
Aug;78(12):1378-81.
Saifudin A, Tanaka K, Kadota S, Tezuka Y. Sesquiterpenes from the
rhizomes of Curcuma heyneana. J Nat Prod. 2013 Feb
22;76(2):2
Silverstein, R., & Webster, F. (2006). Spectrometric identification of
organic compounds. John Wiley & Sons.
Subehan S, Kadota S, Tezuka Y. In vitro mechanism-based
inactivation of cytochrome P450 3A4 by a new constituent
of Cinnamomum burmani. Planta Medica. 2008
Oct;74(12):1474-80.
Usia T, Iwata H, Hiratsuka A, Watabe T, Kadota S, Tezuka Y.
CYP3A4 and CYP2D6 inhibitory activities of Indonesian medi
cinal plants. Phytomedicine. 2006 Jan;13(1-2):67-73.
GLOSARIUM
Adsorben : Sinonim penjerab atau fase diam. Bersifat polar

atau non polar tergantung jenis bahan.
Alkaloid : Metabolit sekunder yang merupakan turunan asam
amino. Di dalam kerangkanya memiliki atom N.
Asam sikimat : starting material golongan fenil propanoid (C9)
Asam : starting material golongan terpenoid (C5)
mevalonat khususnya non tumbuhan.
Asetil-Coa : Starting material golongan (C2) baik poliketida
atau asam asam lemak.
Bioassay : Proses pemurnian senyawa dari bahan dengan
guided pantauan atau panduan aktifitas biologis. Untuk
fractionation bidang penemuan obat berdasar kuatnya efek
farmakologis.
Branching : Suatu percabangan metil. Suatu ciri khas dari
methyl golongan terpenoid.
Building block : skeleton, kerangka utama suatu molekul yang
didasarkan oleh rantai karbon yang tidak terputus
oleh atom lain. Jadi atom karbon (C) adalah
kerangka utama.
DMAP : dimethyl alil pyrophosphate. Starting material
kedua golongan terpenoid..
Deoksisilulosa : Starting material dan jalur biosintesis dari golongan
Dioksisilulosa terpenoid khusunya dari tumbuhan.
ED50 : effective dose 50. Adalah dosis yang memberikan
respon pada 50 populasi subyek uji.
Ekstraksi : Proses pengambilan senyawa dengan pelarut
terpilih. Untuk metabolit sekunder dengan pelarut
organik. Direkomendasikan jumlah bahan mentah
tidak kurang dari 1 kg.
Fenil : Adalah senyawa berkerangka cincin benzil (C6)dan
propanoid rantai samping propanoid (3).
Fraksinasi : pemecahan ekstrak menjadi sub ekstrak
berdasarkan derajat polaritas
Hit : Senyawa yang diuji pada tahap in vitro.
Hit expansion : pembuatan analog senyawa hit melewati sintesis.
HPLC : HPLC yang bertujuan untuk pemurnian. Dilakukan
preparatif setelah fraksinasi halus. Lebih ramah terhadap
kesehatan. Bentuk kolom lebih besar (cm) dari
HPLC konvensional dan kekuatan pompa lebih
besar.
Hyphenated : Sistem analisis yang secara bertahap dilakukan. Dua
Method atau tiga alat disambung menjadi satu. Biasanya
(instrument) sistem kromatografi terlebih dahulu yang pertama
setelah itu spektroskopi massa atau NMR.
IC50 : Inhibitory concentration 50. Adalah konsentrasi
sampel uji yang memberikan hambatan pada 50
subyek uji.
IPP : iso pentenyl pyrophosphate. Starting material
golongan terpenoid.
Kontrol positif : material yang digunakan sebagai referensi
pembanding. Senyawa yang sudah mafhum dan
diketahui memiliki efek tinggi. Bisa senyawa yang
digunakan di klinik atau senyawa penuntun.
Kromatografi : Adsorben atau fase diamnya bersifat inert.
eksklusi Selektifitas bahan yang dianalisis berdasarkan
ukuran partikel.
KLT preparatif : Kromatografi lapis tipis yang bertujuan untuk
pemurnian. Dilakukan setelah fraksinasi halus.
Kapasitas maksimal tiap plate adalah 50 mg untuk
fase normal, 25 mg untuk fase terbalik.
Lead : Senyawa yang menunjukkan efek dan paling
optimum dari beberapa senyawa hasil skrining.
Lead : Senyawa yang menunjukkan paling poten
optimization dioptimasi dengan metode semi sintesis dan
sejenisnya. Agar efeknya maksimal dan efek
samping minimal.
Maserasi : proses ekstraksi dengan cara perendaman. Metode
pilihan untuk metabolit sekunder.
Metabolit : protein, karbohidrat, lemak
primer
Metabolit : Mikromolekul yang digunakan untuk mendukung
sekunder kehidupan.
NMR : Nuclear Magnetic Resonance
1D NMR : Nuclear Magnetic Resonance yang diukur secara
satu dimensi. 1H NMR, 13C NMR, dan NOE adalah
1 D NMR
1 H NMR : Hidrogen Nuclear Magnetic Resonance. Metode
pengukuran resonansi inti hidrogen 1. Memberikan
informasi hidrogen-hidrogen di dalam molekul.
13 C NMR : Carbon Nuclear Magnetic Resonance. Metode
pengukuran resonansi inti karbon 13. Memberikan
posisi karbon-karbon di dalam molekul.
Splitting : Bentuk pecahan puncak pada spektra H NMR. Bisa
disebabkan hidrogen germinal (dalam karbon yang
sama) atau visinal (bertetangga).
2D NMR : adalah NMR yang diukur secara dua dimensi.
Diukur berdasarkan data H dan C NMR. COSY,
HMQC, dan HMBC adalah 2D NMR
COSY : Correlated spectroscopy. Pengukuran untuk
memberikan data interaksi splitting antara dua
hidrogen yang berjarak 2 karbon (bertetangga).
HMQC : Heteronuclear Multiple Quantum Coherence:
Memberikan data ikatan antara hidrogen dengan
karbon.
HMBC : Heteronuclear Magnetic Bond Correlation. Untuk
menentukan korelasi suatu atom hidrogen
terhadap atom karbon yang berjarak 2 dan 3 dari
karbon pengikatnya.
ABX system : Sistem interaksi antar hidrogen melewati ikatan
aromatis atau karbon ikatan ganda. Splitting
puncak memberikan angka coupling constant (J)
yang besarnya berbanding lurus dengan dekatnya
jarak. Orto kopling memberikan angka 8-10 Hz,
meta kopling memberikan angka 3-4 Hz, dan para
kopling memberikan nilai 1-1,8 Hz.
AMX system : interaksi antar hidrogen di dalam NMR melewati
ikatan. Terjadi interaksi antara proton germinal
karena nilai magnetis yang berbeda. Akibatnya
proton di dalam satu ikatan saling berinteraksi.
NOE : Nuclear Overhausser Effect. Interaksi antara
hidrogen di dalam ruangan (space). Jika salah satu
diiradiasi gugus hidrogen yang berdekatan akan
memberikan respon kenaikan intensitas puncak.
Normal : Sistem kromatografi yang bersistem fase diam polar
(normal phase) namun fase non polar hingga semi polar.
ODS : octa desil silika. Adsorben non polar. Fase terbalik.
Partisi : Pemisahan bahan berdasarkan polaritas yang
berbeda menggunakan media carian yang tidak
bercampur. Ekstrak dilarutkan ke pelarut polar
terlebih dulu terutama air. Butanol, etil asetat,
kloroform, dan heksana.
Poliketida : Adalah golongan senyawa yang berkerangka
turunan asam asetat (C2).
Poten : Pernyataan bahwa suatu sampel memiliki aktifitas
yang tinggi. Sebanding atau lebih tinggi dari
kontrol positif
QSAR : Qualitative Structure-Activity Relationship. Efek
yang diprediksi berdasarkan struktur kimiawi/gugus
fungsional. HKSA: Hubungan Kuantitatif antara
Struktur dan Aktifitas.
Sephadex : Fase diam terbuat dari polisakarida dengan prinsip
pemisahan ekslusi. Sephadex LH-20 adalah pilihan
utama.
Spektroskopi : Spektroskopi yang digunakan untuk menentukan
Mass berat molekul dan elemen-elemen penyusun suatu
senyawa.
Terbalik : Sistem kromatografi yang berfase diam non polar
(reversed phase) namun fase gerak polar.
Terpenoid : Senyawa yang memiliki kerangkan karbon C5
dengan gugus samping metil (CH 3).
TMS : Tetra metil silan. Standard pengukuran spektra
NMR. Bernilai 0 ppm.
INDEKS
A E
Adrenalin, 28 Ekstraksi, vii, 37, 39, 43, 46, 105
Alkaloid, 29, 30, 33, 105 Elusidasi, vii, 67, 85
Artemisinin, 19 Esensial, 3
Aseton, 37 Etanol, 37
Asetonitril, 38 Etil asetat, 37
Atropin, 6
F
B
Farmakognosi, 5
Bioassay, vii, 39, 105 Farmakologi, vii, 43
Biokatalis, 13 Fase terbalik, 108
Biosintesis, vii, 11, 12, 17, 19 Fenil propanoid, 26
Branching, 105 Fenolik, 33
Building block, 105 Flavonoid, 33, 99
Butanol, 48, 108 Fraksinasi, vii, 48, 49, 54, 55,
106
C Friedrich Sertuner, 6
Chemical shift, 23, 84, 86
G
Cinnamomum burmanii, 80
COSY, 87, 88, 91, 94, 96, 98, Geseran kimia, 86, 98
100, 107 Glukosa, 11
Crude drug, 6, 9, 42, 72 Glukosinolat, 10
Gnetum gnemon, 42
D
H
Dalton, 2, 3, 4, 10, 11
Daun, 44 Heksan, 48
Dereplikasi, vii, 74 Hit, 106
Digoksin, 32 HKSA, 12, 109
Diklorometana, 37 HMBC, 88, 91, 92, 93, 94, 96,
DMAPP, 19, 20 99, 100, 107, 108
DMSO, 38, 71, 87 HMQC, 88, 91, 92, 93, 96, 100,
107, 108
HTS, 40 NOESY, 85, 88, 91, 96
Hyphenated, 106
O
I
ODS (Okta Desil Silika), 54
Infra merah, 84 Ornitin, 29
IPP, 19, 20, 106 Orto, 108
Isopren, 19, 20, 21, 94
P
K
Para, 52, 53, 100
Kapsisin, 33 Partisi, 48, 49, 50, 108
Kloroform, 37, 48, 87, 90 Pengentalan, 50
Kokain, 6 Pengeringan, 50, 51
Kromatografi, 36, 44, 48, 52, Polar, vii, 80, 81
54, 55, 56, 60, 63, 81, 106 Poliketida, 108
Kurkumin, 32 Prekursor, 13
Produk, 2, 13, 63
L Propolis, 46
Lead, 107
Q
Liofilisasi, 46, 50, 51, 52
Lovastatin, 1 QSAR, 12, 109
M R
Makromolekul, 2, 7 Rasemis, 8
Metabolit primer, 3, 11 Refraktive index, 82
Metabolit sekunder, 3, 13, 105 Replikasi, 42, 72
Mikromolekul, 2, 107
Resveratrol, 26
Minyak atsiri, 20, 33
Morfin, 6
S
MPLC, 58, 60, 63
Saponin, 32, 33
N Sephadex, 53, 55, 64, 65, 82,
Neurotransmitter, 30 109
Nikotin, 6 Silan, 92
NOE, 85, 87, 88, 91, 96, 97, Skualen, 19
107, 108 Starting material, 13, 105, 106
Statin, 1
Steroid, 33
Struktur, vii, 12, 55, 75, 82, 85,
99, 109
Syzygium, 26, 103
T
Taksol, 4, 13
Tanin, 66
Terpenoid, 19, 20, 22, 109
Tetra metil silan, 109
Tetrahidrokanabinoid, 31
U
Ursolat, 19, 23
V
Vanilin, 23
Vinblastin, 1
X
Xantor, 40, 45
BIODATA PENULIS
Azis Saifudin, PhD, Apt. Lahir pada 12 Januari 1978 di Karanganyar

wilayah karesidenan Surakarta Jawa Tengah. Ia memperoleh sarjana
farmasi dan apoteker dari UGM tahun 2001 dan 2002. Tahun 2006
ia mampir Universitas Leiden Belanda belajar program master
dengan beasiswa pemerintah Belanda (Stuned). Pada tahun 2013 ia
mendapatkan gelar PhD dari Institute of Natural Medicine
Universitas Toyama, Jepang dengan predikat wisuda honorable
mention. Ia menempuh S3 melalui beasiswa pemerintah RI pada era
presiden SBY. Sejak mahasiswa S1 ia telah terinspirasi untuk
mempelajari senyawa alam yang merupakan induk dari obat
modern. Sehingga sejak S1 hingga S3 ia membuat tesis dan desertasi
terkait dengan metabolit sekunder (farmakognosi). Dari bahan-
bahan jamu, ia sudah memurnikan lebih dari 70 senyawa dan
termasuk 16 senyawa baru. Karya monumentalnya adalah ia
menemukan senyawa marker penghambat protein tirosine 1B
fosfatase (PTP1B) dari tanaman asli Indonesia daun salam
(Szyzygium polyanthum) yang telah dipublikasikan di jurnal
internasional Planta Medica. Selain itu ia telah menerbitkan beberapa
karyanya di jurnal internasional Jurnal of Natural Products, Natural
Products Communication, dan Journal of Natural Medicines. Ia
memiliki interes pada farmakognosi pengembangan metode analisis
untuk kontrol kualitas bahan baku jamu, ekstraksi, fraksinasi, dan
purifikasi dengan sistem kromatografi fase terbalik-normal,
kromatografi eksklusi, operasi NMR (nuclear magnetic resonance),
serta pengembangan bioassay in vitro terutama berbasis kultur sel
dan enzim. Buku ini adalah buku kedua yang ia tulis. Buku
sebelumnya berjudul,Standardisasi Bahan Obat Alam.

Senyawa Alam Metabolit Sekunder Azis PDF

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Senyawa Alam Metabolit Sekunder Azis PDF

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

SENYAWA ALAM

Fungsi dan Sifat hak Cipta Pasal 2

Hak Terkait Pasal 49

Sanksi Pelanggaran Pasal 72

Katalog Dalam Terbitan (KDT)

Desain cover : Unggul Pebri Hastanto

Isi diluar tanggungjawab percetakan

Pembelajaran ilmu bahan obat alam atau farmakognosi di

KATA PENGANTAR ................................................................... vi

Target belajar: Pembaca memahami secara fundamental peran bahan

Obat berdasarkan besar molekulnya dibagi menjadi dua yakni

Daunorubisin Artemisinin Lovastatin /statin

Vinblastin (anti leukemia) Taxol (anti berbagai kanker)

Gambar 1.1. Contoh kisah sukses molekul alam. Senyawa-senyawa

Metabolit Sekunder/Azis Saifudin|1

2 |Metaboli t Sekunder/ Azis Sa ifud in

Metabolit Sekunder/Azis Saifudin|3

4 |Metaboli t Sekunder/ Azis Sa ifud in

Pada rentang tahun 1981-2010, 4.4% dari 1355 buah obat-

Metabolit Sekunder/Azis Saifudin|5

Gambar 1.2 Morfin senyawa organik pertama dimurnikan oleh Fredrick

Kelahiran farmakognosi modern (farmakognosi kimiawi)

6 |Metaboli t Sekunder/ Azis Sa ifud in

Metabolit Sekunder/Azis Saifudin|7

8 |Metaboli t Sekunder/ Azis Sa ifud in

Ekstrak aktif, gubal, Kimia Organik (termasuk

Molekul Kimia medisinal

Tablet, serbuk, kaplet, sirup dll

Gambar 1.4 diagram Kedudukan farmakognosi di dalam eksplorasi

Metabolit Sekunder/Azis Saifudin|9

Target Pembelajaran: Pembaca ditargetkan mampu membedakan

Jika manusia dibekali akal budi dan gerak pindah koordinasi

Gambar 2.1 Glukosinolat salah satu senyawa untuk senjata pertahanan

Gambar 2.2 Glukosa, adalah metabolit primer untuk bahan energi

Berbagai asam amino

Dengan demikian berdasarkan jalur biosintesis, metabolit

Golongan senyawa poliketida dan asam lemak (C2)

Gambar 2.4 Tetrasiklin adalah antibiotik dihasilkan oleh biosintesis

Senyawa C2 digolongkan menjadi 2 yakni golongan poliketida

Ciri-ciri senyawa poliketida adalah:

- Jika membentuk rantai panjang dan berakhiran dengan gugus

Gambar 2.7 Mekanisme biosintesis golongan poliketida (diadaptasi dari

Terpenoid adalah senyawa yang tersusun dari kerangka

Gambar 2.9 Dimetilalil piropospat (DMAPP) dan Isopentenil piropospat

Terdapat dua jalur biosintesis pembentuk terpenoid makhluk

Gambar 2.10 Diagram skematik terbentuknya golongan terpenoid

Ciri-ciri senyawa terpenoid adalah:

103 0C, 3 menit

Senyawa vanilin terpenoidal

Secara spektroskopi proton NMR: karena terpenoid memiliki gugus

1. Citral 2. p-Cimen 3. Iridoid

b. Sebutkanlah mengapa Mengapa senyawa artemisinin obat

Arteminisin obat malaria dari Artemisin:

Catatan: jumlah karbon di dalam struktur bisa kurang

Golongan fenil propanoid (C9) dan fenil metanoid (C7)

Gambar 2.12 Podofilotoksin adalah senyawa anti kanker kulit diisolasi

Senyawa fenilpropanoid adalah senyawa memiliki kerangka

Gambar 2.13 Flowchart pembentukan senyawa dengan kerangka C9 dan

Identifikasi senyawa fenil propanoid:

Tugas: Identifikasilah termasuk golongan senyawa apa golongan

Gambar 2.14 Piculah Adrenalin mu! Adrenalin adalah salah satu

Keberadaan dan fungsi alkaloid:

Kodein (obat batuk kering) Nikotin (stimulant)