TUGAS KULIAH PANGAN FUNGSIONAL

ANALYSIS VITAMIN

Disusun oleh:

Nama : Siti Maesaroh

NIM : B.1510192
Dosen : Siti Irma Rahmawati, S.P., M.Agr, Ph.D

JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN DAN GIZI

FAKULTAS ILMU PANGAN HALAL
UNIVERSITAS DJUANDA
BOGOR
2017
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Vitamin adalah komponen tambahan makanan yang berperan sangat penting dalam
gizi manusia. Banyak vitamin tidak stabil pada kondisi pemrosesan tertentu dan
penyimpanan, dan karena itu kandungan vitamin dalam makanan yang diproses dapat sangat
menurun. Vitamin sintetik dipakai secara luas untuk menggantikan vitamin yang hilang dan
untuk mengembalikan kandungan vitamin dalam makanan. Beberapa vitamin berfungsi
sebagai koenzim yang tanpa vitamin itu enzim tersebut tidak efektif sebagai biokatalis
(deMan, 1997).
Secara umum pengertian vitamin adalah suatu zat senyawa kompleks yang sangat
dibutuhkan oleh tubuh kita yang berfungsi untuk membantu pengaturan atau proses kegiatan
tubuh. Tanpa vitamin manusia, hewan dan makhluk hidup lainnya tidak akan dapat
melakukan aktifitas hidup . Walaupun vitamin memiliki banyak jenis akan tetapi secara
umum vitamin bekerja dengan cara menggalakkan reaksi kimia tertentu dalam suatu proses
metabolisme. Jika kekurangan vitamin dapat memperbesar peluang terkena penyakit pada
tubuh kita. Ada dua golongan vitamin, yaitu vitamin yang larut dalam lemak dan vitamin
yang larut dalam air. Vitamin yang larut dalam lemak adalah vitamin A, D, E, dan K.
sedangkan vitamin yang larut dalam air adalah B (thiamin, riboflavin, niacin, piridoksin,
asam pantothenat, biotin, sianokobalamin, choline, inositol) dan vitamin C. Kedua golongan
vitamin ini mempunyai sifat umum yang berbeda-beda. Ada beberapa senyawa yang
berhubungan dengan vitamin, yaitu antivitamin, yang kerjanya dapat merusak struktur
vitamin, dan antagonis vitamin, yang kerjanya dapat dapat berkompetisi dengan vitamin
(Proverawati, 2011).

1.2 Tujuan
1. Mahasiswa dapat mengetahui pengertian vitamin.
2. Mahasiswa dapat mengetahui fungsi vitamin.
3. Mahasiswa dapat mengetahui cara analisis vitamin.
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Definisi Vitamin

Vitamin didefinisikan senyawa organik yang diperlukan tubuh dalam jumlah yang
sangat kecil dan harus disuplai dari makanan karena tubuh tidak dapat menyintesisnya. Suatu
vitamin minimal menunjukkan satu fungsi metabolik khusus. Istilah vitamin digunakan oleh
Casimir Funk pada tahun 1912 yang meneliti tentang penyakit beri-beri. Vita menunjukkan
senyawa yang diperlukan oleh tubuh, sedangkan amine berarti mengandung nitrogen, maka
kemudian istilah amine diganti dengan amin, sehingga lebih dikenal dengan vitamin
(Muchtadi, 2009).
Vitamin adalah senyawa organic yang tidak termasuk dalam protein, karbohidrat, lemak
yang terdapat dalam jumlah kecil dalam bahan makanan tapi sangat penting peranannya bagi
tubuh.
Ada dua golongan vitamin, yaitu vitamin yang larut dalam lemak dan vitamin yang
larut dalam air. Vitamin yang larut dalam lemak adalah vitamin A, D, E, dan K. sedangkan
vitamin yang larut dalam air adalah B (thiamin, riboflavin, niacin, piridoksin, asam
pantothenat, biotin, sianokobalamin, choline, inositol) dan vitamin C. Kedua golongan
vitamin ini mempunyai sifat umum yang berbeda-beda. Ada beberapa senyawa yang
berhubungan dengan vitamin, yaitu antivitamin, yang kerjanya dapat merusak struktur
vitamin, dan antagonis vitamin, yang kerjanya dapat dapat berkompetisi dengan vitamin
(Proverawati, 2011).

2.2 Fungsi Vitamin

Vitamin memiliki peranan spesifik di dalam tubuh dan dapat pula memberikan
manfaat kesehatan. Bila kadar senyawa ini tidak mencukupi, tubuh dapat mengalami suatu
penyakit. Tubuh hanya memerlukan vitamin dalam jumlah sedikit, tetapi jika kebutuhan ini
diabaikan maka metabolisme di dalam tubuh kita akan terganggu karena fungsinya tidak
dapat digantikan oleh senyawa lain.
Fungsi vitamin secara umum antara lain sebagai berikut:
Mengatur zat dalam tubuh
Berfungsi menguatkan gigi dan tulang
Mempercepat Pertumbuhan
Memperkuat daya tahan tubuh terhadap penyakit
Mempercepat proses dalam penyembuhan penyakit
Menjaga dan meningkatkan kebugaran tubuh
Memperlambat dalam proses penuaan
Membangun sistem kekebalan tubuh atau sistem imun
Menjaga tubuh tetap segar dan menghilangkan rasa capek
Vitamin juga diperkirakan berfungsi sebagai katalisator dalam reaksi biokimia tubuh
 2.3 Pentingnya Analisis Vitamin
Informasi komposisi vitamin makanan diperlukan untuk menentukan intake guna
mengetahui kecukupan dan perbaikan gizi manusian, serta metode pengujian yang reliable
(dapat dipercaya) sangat diperlukan untuk menjamin akurasi food labeling.
Faktor faktor yang perlu diperhatikan dalam analisis vitamin adalah:

1. Akurasi dan Presisi

2. Faktor Ekonomis
3. Jumlah sampel atau ketersediaannya sampel
4. Metode yang dapat diaplikasikan
5. Kondisi seperti cahaya, oksigen, pH dn panas supaya tidak merusak
6. Homogenisasi sampel

2.4 Kestabilan Vitamin

Vitamin pH7 pH<7 pH>7 O2 Sinar Panas %SM

Vit A Stabil Tidak Stabil Tidak Tidak stabil Tidak 40
stabil stabil stabil
Vit C Tidak Stabil Tidak Tidak Tidak stabil Tidak 100
stabil stabil stabil stabil
Biotin Stabil Stabil Stabil Stabil Tidak stabil Tidak 60
stabil
Karoten Stabil Stabil Stabil Tidak Tidak stabil Tidak 30
stabil stabil
Kolin Stabil Tidak Stabil Stabil Stabil Stabil 5
stabil
B-12 Stabil Stabil Stabil Tidak Stabil Stabil 10
stabil
Vit D Stabil Stabil Tidak Tidak Tidak stabil Tidak 40
stabil stabil stabil
As. Folat Tidak - Stabil Tidak Tidak stabil Tidak 100
stabil stabil stabil
Vit K Stabil Tidak Tidak Stabil Tidak stabil Stabil 5
stabil stabil
Niasin Stabil Tidak Stabil Stabil Stabil Stabil 75
stabil
As. Stabil Stabil Tidak Stabil Stabil Tidak 50
Pantotenat stabil stabil
A A Benzoat Stabil Tidak Stabil Tidak Stabil Stabil 5
stabil stabil
B-6 Stabil Stabil Stabil Stabil Tidak stabil Tidak 40
stabil
B-2 Stabil Stabil Tidak Tidak Tidak stabil Tidak 75
stabil stabil stabil
B-1 Tidak Stabil Tidak Tidak Stabil Tidak 80
stabil stabil stabil stabil
Vit E Stabil Stabil Stabil Stabil Tidak stabil Tidak 55
stabil
2.5 Metode Ekstraksi
Dalam uji vitamin atau analisis vitamin melibatkan ekstraksi vitamin dari matriks
biologisnya sebelum dianalisis. Ini memcangkup beberapa hal yaitu: panas, asam, alkali,
pelarut, dan enzim. Secara umum pada metode ekstraksi vitamin ini sebagian melibatkan
ekstraksi untuk memisahkan vitamin dari matriks biologisnya, prosedur ekstraksi spesifik
untuk setiap vitamin dan di rancang untuk menstabilkan vitamin, sertra prosedur ekstraksi
dapt diaplikasikan untuk beberapa vitamin misalnya untuk tiamin dan riboflavin serta
beberapa vitamin larut lemak.
Adapun contoh dari Ekstraksi Vitamin sebagai berikut:

a. Asam Askorbat yaitu ekstraksi dingin dengan asam metafosforat atau asam asetat
b. Vitamin B1 dan B2 yaitu pemanasan dalam asam yang ditambahkan perlakuan enzim
c. Niasin yaitu asam autoclaving dalam asam (Non Sereal) atau dalam alkali (sereal)
d. Vitaminn A, E dan D yaitu pelarut organic, saponofikasi, dan reekstraksi dengan
pelarut organik
e. Untuk vitamin vitamin yang tidak stabil (A,E,D) perlu ditambahkan antioksidan untuk
menghambat oksidasi.

2.6 Klasifikasi Uji Vitamin

2.6.1 Bioassay
Uji bioassay yang melibatkan manusia dan hewan. Bioassay digunakan untuk
menganalisis vitamin D dan dan B12, dalam menganalisis vitamin D menggunakan Metode
Standard dari AOAC yang dikenal dengan Metode Line Test yang didasarkan pada
pengapuran tulang, namun pada pada uji bioassay ini terbatas penggunaannya yaitu hanya
pada uji coba hewan saja tidak pada manusia.

Prosedur Bioassay Vitamin D

Preparasi AOAC
Periode deplesi (penghabisan) pemberian diet Rachitogenic selama 18-25 hari. Tikus
yang digunakan berumur kurang dari 30 hari dengan berat badan lebih dari 44 gram.
Pengujian mulai hari terakhir deplesi sampai atau 11 hari setelah deplesi. Selama
pengujian, tikus diberi vitamin D dengan jumlah diketahui (standar) dan tidak
diketahui (sampel).
Jumlah vitamin dalam sampel ditentukan oleh Line Test dari warna tulang tibia
(tulang kering) proximal paling akhir atau tulang radius atau ulana distal paling akhir.
2.6.2 Uji Fisikokimia
Pada uji fisikokimia ini yang meliputi adalah spektofotometrik, fluorometrik,
kromatografi, enzimatik, imunologis, dan metode radiometrik.
2.6.3 Uji Mikrobiologi
Pada uji mikrobiologi ini dengan memanfaatkan organisme protozoa, bakteri,
jamur, dan ragi. Uji mikrobiologi memiliki yaitu :
Terbatas pada vitamin yang larut air
Sangat sensitive dan spesifik untuk tiap vitamin
 Memakan waktu dan harus patuh pada prosedur analisa untuk hasil yang
akurat

Prinsip dari uji mikrobiologi ini adalah:

Pertumbuhan mikroba sebanding dengan kebutuhan akan vitamin
Microbiologi assay menguji pertumbuhan mikroba dengan ekstraksi sampel
yang mengandung vitamin dibandingkan dengan pertumbuhan mikroba dalam
vitamin dengan jumlah yang diketahui
Bakteri, ragi, protozoa, dan jamur digunakan sebagai organisme uji
Pertumbuhan diukur dengan turbiditas (kekeruhan), produksi asam, gravitasi
dan respirasi.

2.6.3.1 Niasin (B3)

Mempunyai fungsi sebagai membantu makanan menjadi energy, mencegah penyakit
pellagra, membantu system saraf,serta dapat membantu dalam mencegah berkurangnya nafsu
makan. Adapun penyakit yang akan timbul ketika kekurangan vitamin ini seperti Penyakit
Pellagra, dan akan merasakan badan lemas, otot mudah keram dan kejang serta insomnia.
Makanan yang mengadung vitamin B3 seperti Roti, daging sapi, ikan (salmon dan tuna),
telur, Brokoli, susu, hati, ragi, asparagus.
Analisa uji mikrobiologi untuk iokulasi bakteri L.plantarum yan ada pada niasin (
vitamin B3) yaitu dengan cara spreparasi stok kultur degan inokulasi freeze dried kultur pada
agar bakto-laktobacil dan diinkubasi pada suhu 37 selama 24 jam.
Secara umum pertumbuhan diukur dengan turbiditas, namun jika menngunakan laktobacilus
maka dapat diukur dengan asidimeter

Tahap Analisa B2
Preparasi Sampel
Timbang sampel (kira kira megandung 0,1 mg niasin) dan tambahkan NH2SO4,
autoklaf selama 1 jam dan dingnkan. Atur pH sampai 6,8 dan encerkan sampai
volume (konsentrasi 0,1 g niasin/ml), campur dan sering
Preparasi tabung pengujian
Pengulangan sedikitnya menggunakan 0.0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 dan 5.0 ml.
tambahkan 5 ml Difco Basal Medium untuk niasin ke dalam masing masing tabung,
autoklaf selama 10 menit pada suhu 121 dan dinginkan.
Preprasi standar
Sama dengan cara preparasi tabung pengujian
Standar larutan yang mengandung 0,1 /ml niasin
Inokuasi dan inkubasi (37, 16-18 jam)
Tambahkan 1 tetes inokulasi ke masing masing tabung, tutup tabung dan inkubasi
pada suhu 37 selama 16-18 jam sampai kekeruhan maksimum pada dengan
konsentrasi niasin paling tinggi.
Pengukuran
Absorbansi diukur pada panjang gelombang 540-660 nm
2.6.3.2 Folat
Folat terdiri dari tiga komponen yang terikat gugusan pteridina, asam para amino
benzoate, dan asam glutamat. Folat dapat sedikit larut dalam air, mudah teroksidasi dalam
asam dan cahaya dan hilang ketika pemasakan karena folat memiliki bentuk yang
beragamdan tidak stabil sehingga menyulitkan dalam analisa. Untuk menghitung
bioavailabilitas folat dalam fortifikasi dan dalam makanan telah dibuat DFE ( Dietary Folate
Equivalent).
Berdasarkan hasil penelitian dilaporkan bahwa :
Asam Folat 85% bioavailable
Folat dalam makanan 50% bioavailable
Asam folat dalam produk fortifikasi 1,7 kali lebih bioavailable dibandingkan dengan
folat dalam makanan
Perhitungan g DFE untuk beberapa makanan memerlukan jumlah sampai asam folat sebagai
bagai yang terpisah dari folat makanan. Saat ini, metode kromatografi cair sangat penting
untuk memastikan jumlah asam folat dan bentuk ragam folat dalam makanan, dan akhir ini
kolaborasi prosedur mikrobiologi yang berdasarkan ekstraksi trienzim dapat menghitung
hanya total folat dan tidak dapat membedakan antara folat fortifikasi dan folat makanan.

Prinsip Folat
Folat dalam sampel diekstraksi dalam buffer pada suhu 100C (air mendidih)
Hasil ekstraksi didigesti dengan -amilase dan protease (untuk membebaskan ikatan
folat dengan makromelokul) dan konjugase (untuk memecahkan poly-glutamyl folat
menjadi PteGln3 atau yang lebih kecil)
Pertumbuhan mikroba uji diukur dengan % transmitan. Transmitan berpengaruh pada
konsentrasi folat.

Yang harus diperlukan :

Harus dilakukan upaya untuk melindungi folat yang labil dari oksidasi dan degradasi
fotokimia
Pengurangan senyawa-senyawa termasuk asam askorbat, -mercaptoetanol dan
ditiotreitol adalah cara efektif dalam mencegah oksidasi
Patuh pada prosedur analisa adalah penting untuk menguji folat dengan tepat

Tahap Analisa Folat

Preparasi Sampel
1, 2-2g sampel ditambahkan 50ml buffer, dihomogenkan, dan didigesti (sampel tinggi
lemak harus diekstrak dengan heksan dan semua sampel harus dihindarkan dari
cahaya dan udara)
Pemecahan trienzim
Panaskan sampel selama 5 menit, dinginkan pada suhu ruang, digesti sampel dengan -
amilase, protease dan cojugasi. Inaktifasi enzim dengan pemanasan selama 5 menit,
dinginkan, filter dan encerkan dengan aquades sampai konsentrasi 0,15 ng/ml.
Preparasi kurva standard dan tabung blanko
 Buat 8 tititk kurva standar dengan menggunakan larutan folat. Tambahkan 5ml
L.casei ke dalam masing masing tabung. Siapkan blanko tanpa inokulasi dan blanko
(spektrofotometer) dan enzim blanko untuk mengetahui konstribusi enzim dalam
pertumbuhan mikro.
Pengujian
Asam folat diuji berdasarkan pertumbuhan L.rhamnosus (AOAC). Tabung sampel,
kurva standar, blanko inokulasi, dan blanko enzim diautoklaf pada suhu 121C selama
5 menit, kemudian diinokulasidengn 1 tetes inoculum L.rhamnosus per tabung.
Setelah itu diinkubasi pada suhu 37 C selama 20-24 jam, pertumbuhan mikroba
dinyatakan dalam % transmitan pada 550 nm

2.7 Metode Kimiawi

2.7.1 Vitamin A
Vitamin A sensitif terhadap cahaya (UV), udara (beberapa prooksidan), suhu tinggi
dan kelembaban, untuk menghindari perubahan yang terjadi pada vitamain B yaitu dengan
menghindari penggunaan barang pecah belah, nitrogen, dan vakum, di sarankan untuk
menambahkan antioksidan diawal prosedur. Metode yang digunakan adalah HPLC.

Prinsip Vitamin A
Sampel disaponofikasi, vitamin A akan terekstraksi kedalam larutan organic dan
terkonsentrasi. Semua trans-retinol dan 13-cis-retinol ditentukan dengan HPLC dengan
kolom silica.

Yang harus diperlukan :

Semua pekerjaan harus dilakukan dalam cahaya dengan intesitas rendah
Harus menjaga terjadinya oksidasi retinol selama analisa
Evaporasi larutan harus menyeluruh di bawah aliran nitrogen dan heksadekan
ditambahkan untuk mencegah destruksi selama evaporasi

Tahap Analisa Vitamin A

Preparasi Sampel
Transfer sampel (makanan formula atau susu cair) ke dalam tabung digesti 100ml,
tambahkan 10 ml etanolik pirogallol (2% pirogallol dalam 95% etanol) dan sabunkan
dengan etanolik KOH (10% KOH dalam 90% etanol) pada suhu ruang selama 18 jam
atau pada suhu 70C dengan menggunakan reflux vessel.
Ekstraksi
Pipet 3ml sampel yang telah terdigesti ke dalam tabung sentrifus 15 ml dan
tambahkan 2ml air. Ekstrak dengan 7 ml heksan-dietileter (85:15).
Ulangi ekstraksi sebanyak 2 kal. Masukkan sampel terekstrak kedalam tabung
volumetric 25 ml. tambahkan 1ml heksadekan (heksadekan (1)+ hexan (100)) dan
encerkan sampai 25ml dengan heksan. Pipit 15ml ekstrak yang sudah diencerkan ke
dalam tabung sentrifus dan uapkan dengan nitrogen. Larutkan residu dalam 0,5ml
heptan.
Parameter kromatografi
Kolom 15 cm x 4.5 mm dipadati dengan 3 mm silika (Apex m silika)
Fase mobil Isokratik, heptane dan isopropanol (1-5%)
Deteksi UV , 340 nm
Flow rate 1-2 ml/menit
Perhitungan
Semua trans retinol (mg/ml) = (At/Ast x Wt x DF)/V
Keterangan : At = area puncak sampel
Ast= area puncak standar
Wt = berat sampel
V = volume sampel
DF = faktor pengenceran

2.7.2 Vitamin E
Vitamin E meniliki bentuk 8 komponen yang berbeda dalam makanan dan semuanya
adalah 6-hidroksikroman, Famili vitamin E terdiri dari -, -, - dan -tokoferol. Cirinya
sebuah rantai cabang jenuh dari 3 unit isopren dan berikatan dengan tokotrienol tidak jenuh.
Tahan panas dan asam, karena bersifat antioksidan maka Vitamin E akan mudah teroksidasi
terutama bila dalam minyak tengik, timah dan garam besi Mudah rusak oleh sinar UV

Prinsip Vitamin E
Untuk produk makanan umumnya sampel disabunkan dengan reflux, diekstrak
dengan heksan dan diinjeksi ke dalam fase normal kolom HPLC yang disambungkan pada
detektor fluoresensi. Untuk Margarin dan Minyak nabati sampel dilarutkan dalam heksan,
MgSO4 ditambahkan untuk mengganti air kemudian difilter dan diuji dengan HPLC, Untuk
minyak dilarutkan dalam heksan dan diinjeksi secara langsung ke dalam kolom HPLC
yang perlu diperhatikan Vitamin E adalah subyek oksidasi.Penyabunan dilakukan dengan
reflux yang sudah ditambah, antioksidan pirogallol dengan reaksi vessel yang terlindung dari
cahaya

Tahap Analisa Vitamin E

Produk makanan umum

Tambahkan 10 ml dari 6 % (w/v) pirogallol dalam etanol ke sampel , campur dan aliri
dengan N2. Panaskan pada suhu 70 C selama 10 menit dengan sonikasi. Tambahkan 2 ml 60
% KOH, campur dan aliri dengan N2. Hancurkan selama 30 menit pada suhu 70 C. Sonikasi
selama 5 menit, dinginkan pada suhu ruang dan tambahkan NaCl dan air. Ekstrak dengan
heksan (0,1% BHT) 3 kali. Tambahkan 0,5 g MgSO4 dan campur. Filter dan encerkan
sampai volume dengan heksan dan injeksi 20 l.
Margarin dan minyak nabati
Tambahkan 40 ml heksan (0,1% BHT) ke dalam 10 g sampel dan campur. Tambahkan 3 g
MgSO4 dan campur, biarkan 2 jam. Filter dan encerkan sampai volume dengan heksan.
Injeksi 20 l.
Parameter kromatografi
Kolom Hibar RT, Lichrosorb Si60 5 m, 25 cmx4.6 mm
Fase mobil 0,9% isopropanol dalam heksan
Flow 1 ml/menit
Detektor-fluoresensi, Ex = 290 nm, Em = 330 nm

2.7.3 Vitamin C
Berbentuk asam L-askorbat dan asam L-dehidroaskorbat. Mudah teroksidasi terutama
oleh tingginya pH dan adanya katalisator seperti Fe dan ion Cu. Sehingga perlu prosedur
yang didisain rendah pH dan adanya chelating agent.NOksidasi ringan asam askorbat
menghasilkan asam dehidroaskorbat dan bersifat reversibel dengan adanya perlakuan dengan
reducing agents ( -mercaptoetanol dan ditioreitol) Metode yang digunakan Metode Titrasi
2,6 dicloroindophenol.

Prinsip Vitamin C
L-asam askorbat dioksidasi menjadi L-asam dehidroaskorbat. Pada akhir titrasi akan
menunjukkan warna merah muda.
Perhitungan :
mg asam askorbat/ml sampel =
Standard (mg/ml) x volume titrasi sampel x (FP/berat sampel)

Tahap Analisa Vitamin C

Preparasi sampel
Timbang dan ekstrak sampel dalam asam metafosforat-asam asetat (15 g HPO4 dan 40 ml
HOAc dalam 500 ml air), filter dengan sentrifus dan encerkan sampai konsentrasi 10-100 mg
asam askorbat/100 ml.
Preparasi standard

Timbang 50 mg asam askorbat dan encerkan sampai 100 ml dengan asam metafosforat-asam
asetat
Titrasi

Titrasi sampel dan standard (3 ulangan) dengan dikloroindophenol sampai berwarna merah
muda sedikitnya 10 detik

2.8 Metode Mikroflourometrik

Prinsip Metode Mikroflourometrik
Metode ini mengukur asam askorbat dan asam dehidroaskorbat. Asam askorbat
dioksidasi membentuk asam dehiroaskorbat dan direaksikan dengan o-phenilenediamin
membentuk komponen fluoresen quinoxalin

Tahap Analisa Metode Mikroflourometrik

Preparasi Sampel

Sama dengan metode titrasi, jumlahnya 100 ml untuk standard dan sampel, tambahkan 2
asam Norit, gojog dan saring
Preparasi blanko

Transfer 5 ml filtrate ke dalam tabung volumetrik 100 ml yang mengandung 5 ml H3BO3-

NaOAc, biarkan selama 15 menit, kocok. Transfer 2 ml larutan ke dalam 3 tabung
Penentuan Sampel
Transfer 5 ml standard dan sampel ke dalam tabung volumetrik yang mengandung 5ml dari
50% NaOAc trihidrid dan 27 ml air. Encerkan sampai volume dengan air kemudian transfer 2
ml standard dan sampel ke dalam tabung fluoresen
Pembentukan Quinoxalin
Tambahkan 2 ml dari 20 % larutan o-fenilenediamin-aquades ke tiap tabung. Kocok dengan
vortex dan biarkan selama 35 menit pada suhu ruang
Pengukuran
Ukur fluoresen pada Ex = 356 nm dan Em= 440 nm

2.9 Tiamin (B1)

Prinsip Tiamin (B1)
Ekstraksi dan hidrolisis enzimatis dari ester-ester tiamin fosfat dan pembersihan.
Metode ini didasarkan pada pengukuran fluoresensi dari bentuk oksidasi tiamin (tiokrom)
Yang perlu diperhatikan adalah:

Tiokrom sensitif pada cahaya harus mengurangi cahaya pada semua prosedur
Tiamin sensitif panas terutama pada suasana basa tahap analisa dengan cara
oksidasi tiamin harus dilakukan dengan cepat dan teliti berdasarkan prosedur yang
ada

Tahap Analisa Tiamin (B1)

Preparasi Sampel
Timbang sampel yang mengandung 10-20 g tiamin, tambahkan HCl, campur, autoklaf
selama 15 menit pada 121 C, atur pH sampai 4,5-5,0 dengan HCl,
 Hidrolisis Enzim

Tambahkan larutan enzim dan inkubasi selama 3 hari pada suhu 45-50 C, dinginkan
sampel atur pH sampai 3,5, encerkan sampai volume dengan air, campur dan saring. Larutan
standard diperlakukan dengan enzim yang sama.
Pembersihan Ekstrak sampel

Masukkan ekstrak sampel ke dalam kolom ion-exchange, cuci kolom dengan air panas
kemudian larutkan tiamin dengan larutan asam KCl panas, diinginkan. Encerkan sampai
volume dengan larutan asam-KCl, lakukan juga pada standard .
Pembentukan Tiokrom
Konversi tiamin ke tiokrom menggunakan K2Fe(CN)6, tambahkan isobutil alkohol,
kocok, dan sentrifus.Tuangkan fraksi isobutil alkohol ke dalam tabung baca fluoresen dan
baca pada 365 nm/435nm. Begitu juga standard dan buat kurva standard untuk menghitung
tiamin sampel

2.10 Ribovlafin (B2)

Struktur mirip gula ribose, Larut air dan memberi warna fluoresens kuning kehijauan,
Mudah rusak oleh cahaya dan sinar UV. Tahan panas, oksidator, asam namun sensitif pada
suasana basa

Prinsip Ribovlafin (B2)

Ektraksi, pembersihan dan kompensasi adanya substansi pengganggu, Ditentukan
dengan fluorometer.

Titik Kritis
Karena sensitif pada UV maka semua prosedur dilakukan pada ruang minim cahaya.
Adanya proses oksidasi permanganat perlu diperhatikan untuk hasil yang reliable

Tahap Analisa Vitamin B2

Preparasi Sampel

Timbang sampel homogen, tambahkan 0,1N HCl campur kemudian autoklaf selama 30
menit pada suhu 121 C dan dinginkan. Endapkan substansi pengganggu dengan mengatur pH
6 dan segera diikuti pengaturan pH 4,5, encerkan sampai volume dengan air dan saring
Oksidasi Materi pengganggu

Tempatkan filtrat ke dalam 4 tabung, 2 tabung tambahkan 1 ml air dan tambahkan 1 ml

larutan standard (0,5 g/ml riboflavin) ke dalam 2 tabung lainnya. Untuk tiap tabung (satu
persatu) Tambahkan 1 ml asam asetat glasial, diikuti 0,5 ml KMnO4 3 % biarkan selama 2
menit kemudian tambahkan 0,5 ml H2O2 3%, kocok.
Pengukuran Fluoresen
 Panjang gelombang 440 nm/565 nm. Pertama baca ekstrak sampel yang mengandung air
kemudian tambahkan 20 mg Na2S2O4 campur dan baca ulang, setelah itu baca standard.

2.11 Kelebihan Dan Kekurangan Setiap Uji

Setiap metode mempunyai kelebihan dan kelemahan. Perlu memperhatikan faktor-
faktor berikut dalam memilih metode

Akurasi dan presisi metode

Untuk keperluan apa? informasi bioavailabilitas atau kandungan
waktu dan alat
Personel
Jenis bahan yang akan dianalisa
Jumlah sampel
Aturan/prosedur yang diguanakan

2.11.1 Kelebihan dan Kelemahan Bioassay

Kelebihan Tidak butuh preparasi sampel, Mengurangi potensi perubahan senyawa yang
tidak diinginkan selama preparasi.

Kelemahan Memakan waktu, dan Terbatas pada hewan.

2.11.2 Kelebihan dan Kelemahan Mikrobiologis

Kelebihan memerlukan sedikit sampel

Kelemahan memerlukan ekstraksi, terbatas pada vitamin yang larut air, memakan waktu
lama

2.11.3 Kelebihan dan Kelemahan Cara Kimiawi

Kelebihan Cara kimia dengan HPLC lebih disukai karena sederhana, akurat dan teliti.

Kelemahan Informasi yang diperoleh hanya total vitamin dalam makanan tidak sampai
biovailabilitas vitamin.
 BAB III
PENUTUP

3.1 Kesimpulan
Vitamin adalah senyawa organic yang tidak termasuk dalam protein, karbohidrat,
lemak yang terdapat dalam jumlah kecil dalam bahan makanan tapi sangat penting
peranannya bagi tubuh.
Faktor-faktor yang harus diperhatikan dalam setiap metode pengujian adalah Akurasi
dan Presisi, Faktor Ekonomis, Jumlah sampel atau ketersediaannya sampel, Metode yang
dapat diaplikasikan, Kondisi seperti cahaya, oksigen, pH dn panas supaya tidak merusak, dan
Homogenisasi sampel. Namun hal yang terpenting ketika memilih metode analisa, setidaknya
metode tersebut telah diujikan di laboratorium dan telah dipublikasikan oleh organisasi
seperti AOAC (American of Official Analytical Chemist).

DAFTAR PUSTAKA

DeMan, John M. 1997. Kimia Makanan. Bandung: Institut Teknologi Bandung

Proverawati, Atikah dan Erna Kusmawati. 2011. Ilmu Gizi dan Keperawatan dan Gizi
Kesehatan. Yogyakarta:Nuha Medika

Naga, 2014. Analisa Vitamin. [online]. https://www.scribd.com/doc248899851/MAKALAH-

ANALISIS-VITAMIN-docx#download [diakses 25 Oktober 2017]