Hemoglobin Mutant PDF
Hemoglobin Mutant PDF
HEMOGLOBIN MUTANT
TIRTA SETIAWAN
G851130101
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PENDAHULUAN
1. Hemoglobin (Hb)
Hemoglobin adalah suatu kompleks protein yang ditemukan pada
sel darah merah, terdiri dari Fe (besi/Irron) dan bertindak sebagai agen
yang membawa molekul O2 dalam darah pada manusia maupun hewan.
Hemoglobin menjemput O2 di paru-paru dan menyalurkannya ke jaringan,
dimana tiap sel pada jaringan membutuhkan suplai oksigen untuk
aktifitasnya. Terdapat dua bagian yang paling penting dari hemoglobin:
1) Heme: sebuah porphyrin dengan satu ligan Fe pada bagian pusatnya.
Cincin porphyrin ditemukan pada seluruh sistem biologi dan
penyebab banyak peran yang berbeda meliputi photosintesis pada
tanaman hijau, penerimaan O2 pada otot (myoglobin) dan pembawa O2
pada darah (hemoglobin). Porphirin di bangun dari empat cincin pirol
yang melingkar kemudian membuat atom N berkumpul pada pusat
cincin.
A. B.
C. Fe2+
D.
2
penyusun pada tiap sisi-sisinya (metil, vinil dan asam propanoat). Tipe
cincin porpirin seperti ini dikenal dengan nama prorophorpirin IX.
Ketika berikatan dengan Fe, kesatuan kompleks tersebut dinamakan
heme. Fe pada hemoglobin bisa dalam keadaan mengikat ferro (Fe2+)
atau Ferri (Fe3+). Heme dengan mengikat ferro (Fe2+) disebut
ferroheme, feroheme merupakan bagian aktif yang mengikat O2.
Heme inilah yang memberikan warna tampak merah pada hemoglobin,
dengan merubah satu struktur heme berarti dapat merubah warnanya.
2) Globin: globin merupakan gugus protein yang melingkupi heme.
2. Struktur
Secara umum struktur dari hemoglobin terdiri dari empat rantai
polipeptida (globin) yang berkumpul antara satu rantai dengan rantai
lainnya. Disini terdapat beberapa perbedaan struktur molekul rantai
polipeptida (globin), perbedaan tersebut terletak pada beberapa urutan
asam aminonya. Sebuah desain greek memberikan identitas yaitu , , , ,
dan seterusnya.
Tiap molekul globin menyatu dengan satu kelompok gugus heme.
Tiap gabungan satu unit heme dan globin disebut dengan subunit. Tiap
molekul hemoglobin terdiri dari 4 unit globin dan 4 unit heme.
3
Hemoglobin normal yang sering dijumpai adalah Hemoglobin pada
manusia dewasa yaitu Hemoglobin A (HbA). Pada manusia dewasa
(HbA), terdapat 2 bagian molekul subunit kembar/ sama, tiap bagianny
terdiri dari satu subunit dan subunit. Secara keseluruhan strukutr HbA
adalah 22, yang berarti terdiri dari 2 molekul subunit dan (2 , 2).
3. Fungsi dari Hemoglobin
Hemoglobin (Hb) mengangkut O2 dari paru-paru munuju jaringan
dan melepaskan O2 lalu kembali ke paru-paru dan menangkap O2 lagi.
Ketika hemoglobin mengangkut O2 disebut oksihemoglobin dan ketika
melepaskan O2 (keadaan tanpa O2), disebut deoksihemoglobin. Deoksi dan
oksi memiliki perbedaan warna. Oksigen mengikat langsung pada pusat Fe
pada heme.
4
A. T R B.
Gambar 4. A. ikatan Fe dengan oksigen merubah konformasi Cincin porfirin
sebelum/T (tidak simetris) dan sesudah/ R (simetris), B. efek
keseluruhan merubah bentuk hemoglobin sebelum (renggang),
sesudah (rapat).
Adanya senyawa 2,3 bifosfogliserat (BPG) yang mengikat
Hemoglobin membuat hemoglobin tidak mampu mencapai keadaan R,
karena keadaan R merupakan keadaan dimana afinitas Fe terhadap
Oksigen lain semakin besar, Karena BPG mengikat tepat pada posor pusat
(gambar 5) dimana 4 dari tiap2 subunit berinteraksi, sehingga O2 tidak
mampu berikatan dengan Fe pada hemoglobin.
5
munculnya alel baru dan menjadi dasar munculnya variasi-variasi baru
pada spesies.Mutasi di alam dapat terjadi akibat zat pembangkit mutasi
(mutagen, termasuk karsinogen), radiasi surya, radioaktif, sinar
ultraviolet, sinar X, serta loncatan energi listrik seperti petir. Individu yang
memperlihatkan perubahan sifat (fenotipe) akibat mutasi disebut mutan.
6
PEMBAHASAN
7
Mutasi gen pada globin alfa akan menyebabkan penyakit alfa-
thalassemia dan jika itu terjadi pada globin beta maka akan menyebabkan
penyakit beta-thalassemia.Berdasarkan rantai yang terganggu, dikenal
beberapa jenis thalessemia, yaitu thalessemia dan . Thalassemia terjadi
bila mengalami penurunan atau tidak memiliki sintesis globulin . Sedangkan
thalassemia bila terjadi penurunan atau tidak ada globulin . Gen globulin
terletak pada kromoson 16 sedangkan globulin pada kromoson 11.
Secara klinis, thalassemia dibedakan atas thalessmia minor (heterizgot)dan
mayor (homozigot). Individu heterozigot dan karier tidak menunjukan gejala
(asimtomatik) , umumnya mengalami kelainan haematologi minor. Individu
homozigat biasanya bermanifestasi sebagai thalessemia mayor yang
membutuhkan transfusi darah secara rutin dan terapi kelebihan besi untuk
mempertahankan kualitas hidupnya.
Thalessemia pada neonatus adalah spesifik karena eritrosit pada masa fetal
dan neontal berbeda secara bermakna dibanding bayi yang lebih tua, anak-
anak, dan dewasa. Eritrosit pada masa fetal dan neonatal mempunyai umur
hidup yang lebih pendek, bentuk yang berubah dan deformabilitas, serta
konsentrasi Hb fetal yang lebih tinggi. Hal ini akan mempengaruhi
kemampuan untuk membawa oksigen ke jaringan dalam memenuhi kebutuhan
metabolik.
Thalesemia pada neonatus yang terutama adalah thalassemia dengan
gangguan pada 3 gen (penyakit hemoglobin H) dan 4 gen (Hb-Bart's hydrops
fetalis). Hb-Bart's hyfrops fetalis merupakan merupakan manifestasi terburuk
dari gen thalassemia dan biasannya bayi yang menderita penyakit ini lahir
meninggal atau meninggal dalam beberapa jam sesudah lahir.
Thalassemia merupakan kelainan dimana terjadi defek sintesis rantai
dengan akibat depresi produksi Hb yang rantai , misalnya HbA, HbA2, dan
HbF. Defisiensi rantai menyebabkan timbunan rantai pada fetus dan rantai
pada orang dewasa. Bila melihat jumlah gen yang mengalami kelainan,
thalassemia dikelompokan sebagai silent carrier (1 gen), trait thalassemia
(2 gen), penyakit HbH (3 gen), dan Hb-Barts hydrops fetalis (4 gen). Rantai
membentuk tetramer Hb-Barts dan presipitat rantai yang tidak stabil
8
membentuk HbH. Adanya Hb-Barts dan HbH dalam eritrosit membawa akibat
yang serius karena Hb tersebut mempunyai afinitas oksigen yang tinggi dan
tidak dapat membawa oksigen secara adekuat ke jaringan.
Sedangkan pada thalassemia meliputi empat sindrom klinis. Yaitu
silent carrier, trait thalassemia, thalassemia intermedia, dan thalassemia
mayor. Heterogenitas klinis menunjukan perbedaan mutasi. Banyak mutasi
yang mengeliminasi ekspresi gen globin , sedangkan yang lain secara
bervariasi menurunkan derajat ekspresi gen globin . Makin ringan penurunan
ekspresi gen globin , makin baik manifestasi klinisnya, karena derajat
ketidakseimbangan antara rantai dan menunjukan derajat beratnya
penyakit.
Sindrom klinis thalassemia tidak muncul sampai usia 4-6 bulan,
dimana terjadi perubahan dari HbF ke HbA. Tetapi sindrom thalassemia
sebagai hydrops fetalis ( 4 gen) dan penyakit HbH (delesi 3 gen) muncul
dengan anemia dan hepatosplenomegali. Trait dan silent carrier tidak
menampakan gejala-gejalanya dan terdeteksi secara tak sengaja pada
kehidupan selanjutnya.
9
Tabel 1. Hb Variant (kelainan Hb)
10
11
(http://globin.bx.psu.edu; Hardison et al. 2002; Giardine et al. 2011).
Perbedaan titik (mutasi) yang menyebabkan Hb menjadi mutan dan merubah
fungsi pentingnya sebagai hemoglobin. Berikut beberapa jenis kelainan
hemoglobin karena mutasi berdasarakan fungsi yang berubah.
12
elektroforesis tidak menunjukkan pergeseran. Kelainan ini dapat di
identifikasi dengan HPLCanalis rantai globin pasien dan pada sinar-X
kristanografi menunjukkan perubahan ditempat heliks H (moo-Penn et al.
1988).
Mutasi pada penghubung antar subunit 11 bisa menyebabkan
hemolitik anemia (keadaan eritrosit tidak sehat) dengan pengahambatan
pembentukan komplek heterodimer (1,1, 2, 2), memberikan akumulasi
terhadap subunit globin bebas yang merupakan bentuk globin yang tidak
stabil, terutama pada rantai nya (gambar 6C, bola Biru).
Contohnya adalah Hb Philly (35[C1]Tyr > Phe)(rieder et al. 1969),
Hb Peterborought (111[G13]Val > Phe)(King et al.1977), Hb Stanmore (
111 [G13] Val > Ala) (Como et al.1991), and Hb J-Guantanamo ( 128 [H6]
Ala > Asp) (Martnez et al. 1977). Hb Khartoum ( 124 [H2] Pro > Arg)
berisi pergantian penghubung 11 yang dalam keadaan tidak stabil dalam
keadaan in vitro, tapi bukan dikarenakan geajala klinik (Clegg et al. 1969;
Argos et al. 1979).
Gambar 6. Hb varian dengan interaksi subunit yang telah dirubah.(A) konversi dari berafinitas
rendah (deoksi, T) ke afinitas tinggi (oksi, R) melibatkan kecenderungan rotasi dari
dimer 11 dan 22, dengan perubahan ada keseluruhan permukaan 12 dan
21(warna ungu). Pada gambar ini dimer 11 melakukan gerakan relative terhadap
dimer 22 menuju kekeadaan deoksi (orange) ke keadaan oksi (merah). (B). bentuk
13
sigmoid dari kurva Hb-O2 menunjukkan regulasi alosterik oleh perubahan PH, suhu
dan 2,3 DPG. Regulasi ini, mempengaruhi bentuk kurva, afinitas tinggi, pH tinggi, 2,3
DPG rendah dan suhu rendah menyebabkan pergeseran kekiri (garis merah)
sebaliknya, afinitas rendah, pH rendah, 2,3 DPG tinggi dan suhu tinggi menyebabkan
pergeseran ke kanan (garis biru). (C) sekuen Hb Varian pada alosterik 12 (bola
ungu) menunjukkan respon yang lemah untuk mengikat oksigen. Beberapa varian
sekuen pada regulator alosterik lainnya, contohnya subtitusi K82 (hijau0
mengganggu interaksi dengan 2,3 DPG yang normalnya menstabilkan kedaan T
berafinitas rendah. Mutasi yang mengganggu dimer 11 (dan 22)(bola biru)
meningkatkan konsentrasi monomer bebas yang tidak stabil. (D) beberapa mutasi
mengganggu ikatan dengan dan juga merusak ikatan dengan chaperon, AHSP.
Beberapa varian seperti Turriff dan Beziers (bola pink) hanya dapat menghambat
ikatan AHSP.
15
beberapa rangkaian tes gagal untuk mengidentifikasi kelainan Hb terlarut
dalam eritrosit, urutas basa pada DNA digunakan untuk mengkarakterisasi
mutasi. Hb Terr Haute (106 [G8] Leu > Arg) adalah kelainan Hb lain terkait
dengan hemolitik Heinz body anemia berat dan ketidak seimbangan rantai
globin (Coleman et al. 1991). Dalam penelitian awal yang dilakukan tahun
1979, pada penderita erithroid cells (rangkaian sel darah merah merah yang
mewarisi kelainan dan perbedaan), kelainan Hb tetramer tidak dapat di deteksi
dan pemetaan protein globin baru dapat dilakukan setelah di label dengan
radiologi dan diidentifikasi 112[G14) Cys > Arg yang awalny dinamai
dengan Hb Indianapolis.(adams et al. 1991). Kemungkinan terbesar, tidak
sempurnanya pemotongan secara triptic (enzimatis) dari protein -globin yang
tidak normal pada studi sebelumnya menyebabkan kesalahan identifikasi dari
penyebab mutasi. Serangkaian penelitian ini mencerminkan titik sejarah yang
sangat menarik ketika banyak kelainan Hb telah di identifikasi secara
laboratorium dan studi mengenai tknik protein yang menantang beberapa
tahun yangg lalu, sebelum analisis urutan DNA pada penderita kelainan globin
menjadi mudah. Reevaluasi dari mutasi ini melalui pengujian genetic telah
menghasilkan beberapa kejutaan seperti Hb Bristol-alesha ( 67[E11] Val >
Met atau Asp) kodon GTG > ATG, menyebabkan globin tidak normal dan
mengakibatkan fungsi ganda dari hemoglobin itu sendiri.
16
merubah interface 11 ini (gambar 6C, Bola warna Cyan). Sebagai contoh,
asam amino yang berganti pada Hb Kempsey (99[G1]Asp > Asn). Gangguan
pada interaksi 11 dengan mencegah pembentukan ikatan hidrogen antara
99 Asp dan 42 Tyr, yang biasanya menstabilkan deoksigenasi oksigen
dalam keadaan T (afinitas rendah terhadap oksigen) (gambar 9). Perubahan ini
berubah pergeser kea rah quartenary equilibrium, bentuk R beroksigenasi yang
mengganggu pelepasan oksigen (merusak) ke jaringan perifer dan merangsang
meningkatkan erythropoiteic. Terminal karboksil rantai globin juga terlibat
dalam interaksi 11 yang menstabilkan afinitas oksigen yang rendah keadaan
T dan banyaknnya subtitusi pada wilayah ini menyebabkan Hb varian dengan
afinitas yang tinggi terhadap oksigen. Selain itu, 146 His pada ujung
karboksil memberikan berkontribusi terhadap efek bohr dengan membentuk
jembatan garam dengan 94 Asp (Perutz et al. 1984).
17
gugus alosterik dapat dilihat didalam kotak. (B) penampakan secara rinci dari
12 pada keadaan T deoksi (rantai 2 berwarna orange, PDB 2DN2) dan oksi
keadaan R (rantai 2 berwarna merah, PDB 2DN1) menunjukkan interaksi ikatan
hidrogen.
18
penyerapan Hb-O2 jika P50 telah meningkat menjadi >50 mmHg. Rendahnya
afinitas Oksigen Hb Varian bisa dikaitkan dengan anemia ringan yang
disebabkan dengan meningkatnya pengiriman oksigen di jaringan dengan
penurunan dorongan erithopoietic (keadaan Hb stabil R) (Stamatoyannopoulos
et al. 1969). Selain itu banyak mutan dengan afinitas rendah terhadap oksigen
adalah tidak stabil dan karena itu tidak hanya dikaitkan dengan sianosis tapi
juga dengan Heinz Body hemolitik anemia.
Varian dengan keadaan rendahnya afinitas terhadap oksigen
melibatkan pergantian pada permukaan (interface) 11, yang memainkan
peran penting dalam Hb cooperativity.Hb Kansas (102[G4] Asn > Thr)
adalah jenis varian yang berafinitas rendah terhadap oksigen yang tepat untuk
dipelajari. (gambar 9B). individu yang jelas terkena cyanosis namun secara
clinis dalam keadaan baik. Pergantian Asn102 pada permukaan 11
menghambat pembentukan ikatan hidrogen dengan Asp94 yang secara normal
menstabilkan keadaan oksigenasi R. Sebuah mekanisme yang sama
menyebabkan rendahnya afinitas terhadap oksigen dalam 2 Hb varian lainnya
melalui subtitusi yang berbeda oleh asam amino yang sama (102[G4]Asn
pada Hb Beth Israel (102[G4] Asn > Ser) dan Hb St.Mande (102[G4] Asn >
Tyr (Arous et al. 1981; Poyart et al. 1990).
19
membedakan tipe MetHb liar akibat racun atau sistem reduktase yang rusak
dan metHb variant yang cenderung teroksidasi secara spontan (Bunn and
Forget 1986; Steinberg et al. 2001; Nathan et al. 2009).
Hb varian terkait dengan pembentukan MetHb biasanya disebabkan
oleh subtitusi asam amino dalam heme pocket. Contohnya empat perbedaan
M-Hbs terjadi ketika Tyrosin menggantikan atau residu histidin proksimal
atau distal yang berinteraksi dengan heme (reviewed in Adachi et al. 2011).
Pada Hb M-Iwate (1 atau 2 87[F8] his > Tyr), proksimal histidin digantikan
dengan tirosin (gambar 10A) yang terprotonasi dan tekoordinasi ke besi (Fe)
heme (gambar 10B) (Konigsberg and Lehmann 1965; Shimizu et al. 1965).
Heme ferric yang berikatan melalui His[F8] asli siap direduksi dengan metHb
reduktase (gambar 10C). koordinasi tirosin (F8) menstabilkan keadaan
oksidasi ferric dan menurunkan kereaktivannya dengan metHb Reduktase.
Interaksi ini juga mendistorsi posisi heme dan heliks F dalam pengubahan
subunit . Pada Hb normal, pergerakan proksimal His F8 dan F helik jauh dari
kelompok heme menstabilkan keadaan T deoksigenasi dan mengurangi
afinitas oksigen subunit pasangan aslinya. Oleh karena itu selama pergantian
rantai samping His F8 normal yang terlalu lama (Gambar 10A) juga
menstabilkan keadaan T deoksigenasi dan mengurangi afinitas terhadsap
oksigen pada subunit dalam Hb M-Iwate (Nagai et al. 2000; Jin et al. 2004).
20
Gambar 10. Contoh dari tipe Hb M. (A) gugus heme tipe wild dari HbM (hijau) dan mutasi F8
His > Tyr (orange, PDB 1HRM) (B) Hb M-Iwate, 87 Tyr F8 terprotonisasi dan Fe
3+
merupakan besi teroksidasi (ferrit), ferrit tidak direduksi oleh metHb reduktase.
(C) Heme normal dengan heme yang telah teroksidasi direduksi dengan metHb
reduktase. (D) subtitusi distal His E7 pada Hb M Tyr E7 (orange, PDB 1MGN). (E)
pada Hb saskatoon, ferrit dalam keadaan heksakorrdinasi yang mempengaruhi
rantai dapat direduksi oleh mrtHb reduktase.
22
Hb Varian yang mempengaruhi beberapa fungsi Hemoglobin
Tidak begitu mengherankan jika subtitusi asam amino pada wilayah
yang sangat penting pada protein globin dapat menghasilkan beberapa
pengaruh. Contohnya HbE (26[B8] Glu > Lys), varian yang biasa terjadi di
asia tenggara, teridiri dari asam amino yang membuat rantai agak tidak
stabil (Frischer and Bowman 1975; Huisman 1997; Rees et al.1998; see also
Musallam et al. 2012). Namun, mutasi ini juga menciptakan alternative splice
site pada mRNA globin, yang mengarah ke penurunan sintesis transkripsi
produktif dengan mengahasilkan talasemia (orkin et al. 1982). HbE sangat
merugikan ketika banyak cacat alel talasemia di wariskan, yang biasanya
terjadi pada asia tenggara.
Mutasi yang mengubah gugus heme biasanya menghasilkan beberapa
pengaruh secara biokimia. Contohnya penghilangan atau subtitusi residu Phe
pada daerah heliks CD1 pada gugus heme nyatanya mendestabilkan globin
dan juga mengubah afinitas terhadap oksigen (O2). Dengan demikian, Hb
Bruxelles (42[CD1] Phe > 0) (Blouquit et al. 1989; Griffon et al. 1996), Hb
warsaw (42[CD1] Phe > Val) (Honing et al. 1990), Hb hammersmith
(42[CD1]Phe > ser), Hb Buccuresti-louisville (42[CD1]Phe > Leu)(bratu et
al.1997; Keeling et al. 1971) menyebabkan dua sifat bawaan yaitu Heinz body
anemia hemolitik dan cyanosis. Efek gabungan ini timbul dari berkurangnya
kekooperatifan, dengan cepat terautooksidasi dan kehilangan hemin dan
kesalahan folding menyebabkan globin varian.
Hal lain yang menarik dari varian gugus heme adalah Hb Zurrich
(63[E7] His > Arg) yaitu digantinya His dengan Arg (Huisman et al.1961).
Tingginya polarisasi dari His varian pada sisi samping rantai memutar dital
gugus heme, dan kelompok guanido membentuk jembatan garam dengan
heme yang terprotonasi (gambar 11 A), menghasilkan pelebaran gugus heme
dan mendestabilkan ikatan oksigen dan menyebabkan autooksidasi ketika
terpolarisasi dalam air. Individu yang terjangkit menunjukkan snsitivitas
terhadap agen oksidan, termasuk obat-obatan sulfur yang lebih mudah masuk
melebarkan gugus heme. Hilangnya histidin distal menandakan penuruann
afinitas terhadap oksigen tetapi hanya sedikit pengaruhnya terhadap ikatan
23
dengan karbon monoksida (CO). Akibatnya, individu dengan Hb zurrich
cenderung memiliki tingkat diatas normal terhadap CO-Hb yang ironisnya
melindungi besi heme dari oksidasi dan globin dari denaturasi.
Gambar 11. Hb varian dengan perubahan asam amino pada gugus heme. (A) diagram stereo
dari model deoksi gugus heme Hb Zurrich (biru) dilapisi dengan gugus heme
wild tipe (hitam, PDB 2DN2). (B) diagram stereo yang menunjukkan
perubahan bentuk terkait dengan subtitusi pada globin Val E11. Struktur Tipe
wild membawa cabang sisi hidropobik rantai Valin (ikatan warna hitam, PDB
2DN2) dilapisi dengan struktur yang membawa rantai cabang cincin aromatic
Trp E11 (orange, PDB 101K) atau rantai samping polar Thr (hijau PDB
1HDB).
25
pada E11, subtitusi struktur polar (Thr) atau atruktur aromatic besar (Trp)
sudah tersedia. Ini mengindikasikan bahwa perubahan pada sam amino ini
dapat diterima tanpa ada perubahan yang berarti pada struktur heme (gambar
11B). Sebaliknya perubahan sterik dan alosterik interaksi dengan His distal
dan ligan diatomic yang masuk pada gugus heme diubah menjadi fungsi yang
signifikan. Penelitian secara biokimia mengindikasikan bahwa substitusi Met
pada Hb Toms River membuat Hb stabil, rendahnya afinitas terhadap oksigen
pada varian globin menyebabkan cyanosis. Ini merupakan bentuk bertahap
posttanslasi untuk mengkonversi Asp mendestabilisasi molekul, menyebabkan
anemia hemolitik. Hal ini membrikan contoh bahwa modifikasi seltelah
translasi pada globin varian dapat memodifikasi fenotif. Alasan bahwa Hb
Bristol-Alesha penyebab anemia dominan sedangkan Hb Toms river penyebab
utama sianosis mungkin mencermikan tingkat yang berbeda dari konversi Met
ke Asp dalam varaian rantai globin.
26
KESIMPULAN
27
DAFTAR PUSTAKA
28
Perutz M. 1960. Structure of hemoglobin.Brookhaven Symp Biol13:165 183.
Rees DC, Clegg JB, Weatherall DJ. 1998. Is hemoglobin instability important in
the interaction between hemoglobin E andbthalassemia?Blood92:2141
2146.
Rieder RF, Oski FA, Clegg JB. 1969. Hemoglobin Philly (b35 tyrosine
phenylalanine): Studies in the molecular pathology of hemoglobin.J.
Clin Invest48:16271642.
Serjeant G, Rodgers G. 2012. Natural history of sickle cell disease.Cold Spring
Harb Perspect Meddoi: 10.1101/ cshperspect.a011783
Thom s.,Dickson F.,Gell david, Weiss J. 2013. Hemoglobin Variants:
Biochemical Properties and Clinical Correlates. Cold Spring Harb
Perspect Med 2013; doi: 10.1101/cshperspect.a011858.
29