BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
Organ ayam yang digunakan untuk mengidentifikasi virus yaitu otak, limpa
dan pulmo yang telah disediakan oleh Laboratorium Virologi FKH Unair. Organ-
organ tersebut diambil dari ayam yang diduga terinfeksi ND. Penegakan
diagnosa dilakukan dengan menginokulasikan suspensi virus dari sampel organ
yang didapatkan kedalam telur ayam berembrio sebagai media perbenihan virus,
kemudian dilanjutkan dengan pengujian HA dan HI.
4.1.1 Hasil Pemeriksaan Patologi Anatomi Organ Ayam
Sampel organ yang diamati diantaranya yaitu otak, limpa dan pulmo
dengan gambaran patologi anatomi sebagai berikut :
Tabel 4.1. Perubahan Patologi Organ

Organ Perubahan Patologi

Otak Tidak ada perubahan
Limpa Membesar
Paru Hemoragi

Kemudian, organ-organ tersebut dipotong untuk dilakukan identifikasi agar

mengetahui penyebab dari penyakit. Lalu dibuat suspensi 10% dari potongan
organ tersebut yang kemudian diinokulasikan pada TAB. Suspensi sampel
ditambahkan antibiotik penisilin-streptomisin agar bakteri tidak tumbuh pada
media TAB dan hanya virus yang akan diisolasi yang dapat tumbuh pada media
TAB.

62
4.2 Hasil Inokulasi dan Identifikasi Virus
4.2.1. Inokulasi Virus pada TAB

Gambar 4.1. Gambar sampel Telur Ayam Berembrio, proses inokulasi cairan
gerusan organ dengan cara memasukkan spuit dengan posisi tegak lurus
dengan telur (dokumentasi pribadi)

Tabel 4.2. Waktu Kematian Embrio pada TAB Hasil Inokulasi.

Waktu Kematian TAB (jam)
Sampel
(24 jam) (48 Jam) (72 Jam)
Otak Hidup Hidup Hidup
Hidup Hidup Hidup
Hidup Hidup Hidup
Limpa Hidup Hidup Mati
Hidup Hidup Mati
Hidup Hidup Hidup
Paru Hidup Hidup Mati
Hidup Hidup Hidup
Hidup Hidup Mati

63
4.2.2. Hasil Uji Hemaglutinasi (HA)
Telur ayam berembrio dipanen setelah 5 hari pasca inokulasi. TAB
dikeluarkan dari refrigator dan segera dilakukan identifikasi virus dengan uji
HA dan uji HI. Sebelumnya dibuka terlebih dahulu bagian rongga udara pada
TAB dengan cara digunting. Selanjutnya diambil cairan alantois dengan
menggunakan mikropipet sebanyak 0,025ml pada masing-masing TAB dan
dimasukan kedalam mikropipet sesuai dengan label.

Gambar 4.2. TAB yang sudah dibuka cangkangnya (kiri), Pengambilan

cairan alantois pada TAB (kanan) (sumber: dokumentasi pribadi)
Perhitungan HA Unit dilakukan dengan cara menghitung lubang
yang positif dimulai dari pengenceran yang paling pekat (lubang
pertama). Hasil uji HA (Gambar 4.), terlihat adanya aglutinasi eritrosit
ayam pada sampel organ :

64
 K Limfa Paru Otak

Gambar 4.3. Hasil pengujian HA (Hemaglutinin Aglutinasi) (Dokumentasi

Pribadi).

Otak Limpa Pulmo

1 2 3 1 2 3 1 2 3

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

Gambar 4.4 Hasil Skematis Identifikasi Virus Dengan Menggunakan Uji HA

(Sumber : Dokumentasi Pribadi). Ket: : tidak aglutinasi (negatif),
: Aglutinasi (positif)

65
 Pada gambaran hasil uji HA, aglutinasi terjadi pada sampel limpa 2 di
sumuran 1-5 dan sampel paru 3 di sumuran 1-4 sedangkan sampel lainnya
tidak terjadi aglutinasi (gambar 4.3). Dari hasil tersebut didapati bahwa titer
antigen pada organ limpa 2 dimiliki sebesar 25 = 32 dan pada sampel paru 3
sebesar 24 = 16.
Tabel 4.3. Hasil Uji HA dari cairan Alantois TAB
Titer Hasil HA
Sampel 1 2 3
HA HA HA
Otak 20 20 20
Limpa 20 25 20
Paru 20 20 24
Selanjutnya dilakukan uji Hemaglutinasi Inhibition (HI) dari sampel
limpa 5 dan paru 4, namun karena titer yang diperoleh dari antigen pada cairan
alantois yaitu 25 dan 24, maka dilakukan pengenceran pada cairan alantois
hingga didapatkan 4HA Unit. Pengenceran dapat dilakukan dengan
perhitungan sebagai berikut:
1. Paru 2 = 25 HA dijadikan 4HA Unit
32
25 = = 8 Maka dilakukan pengenceran 1:7 (100µl Ag : 700 µl PZ)
4

2. Limpa 2 = 24 HA dijadikan 4HA Unit

16
24 = = 4 Maka dilakukan pengeneran 1:3 (100 µl Ag : 300 µl PZ)
4

66
4.2.3. Hasil Uji Hemaglutinasi Inhibition (HI)

K
Paru

limpa

Gambar 4.4 Hasil uji HI pada Ag ND 4HU. Terjadi

hambatan >8 HI log 2 pada kedua sampel.

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11

Gambar 4.5 Skema Hasil Identifikasi Virus dengan Uji HI

Hasil uji HI pada Gambar 4.4 dapat disimpulkan bahwa hasil uji positif
yang ditandai adanya hambatan pada eritrosit pada sampel yang diuji ND,
dengan hasil yang menunjukkan angka 27 untuk organ paru paru dan 26 untuk
Limpa.

4.3 Pembahasan
4.3.1 Isolasi dan Identifikasi Virus
Mortalitas kasus pada ayam muda (64,29%) lebih tinggi dari pada ayam
dewasa (47,17%). Ayam muda memiliki sistem pertahanan tubuh yang masih
berkembang sehingga rentan terhadap infeksi virus. Ayam yang sakit selama 8
hari berarti penyakit telah berlangsung cukup lama dan bersifat kronis. Secara
umum masa inkubasi ND berkisar antara 2 – 15 hari dengan rata – rata 5 -6
hari (OIE, 2012).

67
 Penyebaran virus ND dapat melalui kontak langsung, aerosol, feses,
leleran yang mengandung virus, serta pakan, air dan peralatan kandang yang
tercemar feses (Alexander dan Senne, 2008). Virus yang tercampur dalam
lendir atau feses dan urine mampu bertahan dua bulan, bahkan dalam keadaan
kering tahan labih lama lagi sampai beberapa bulan (Muharam dan Darmianto,
2005).
Isolasi dan Identifikasi virus menggunakan spesimen paru – paru, limpa,
dan otak. Organ digerus dalam PBS hingga konsentrasi 10 – 20% untuk
mengeluarkan virus dari sel inang. Penggerusan harus dilakukan hingga
jaringan benar – benar hancur. Kemudian dilanjutkan dengan sentrifugasi yang
bertujuan untuk mengendapkan sisa organ gerusan. Supernatan dari gerusan
diambil karena virus berada pada supernatan yang disebabkan oleh berat jenis
virus lebih kecil daripada air. Supernatan ditambahkan antibiotika penisilin-
streptomisin untuk membunuh bakteri yang mengkontaminasi, yang
sebelumnya telah diinkubasikan pada 37oC untuk mengaktifkan kerja
antibiotika (Mahardika et al., 2015).
Inokulum diinokulasikan pada TAB umur 9 hari melalui ruang alantois.
Inokulasi bertujuan untuk mengisolasi dan memperbanyak virus. Mengisolasi
dimaksudkan untuk memisahkan virus dari agen lainnya melalui cara inokulasi
(Misalnya : virus ND dapat diinokulasi melalui ruang alantois sehingga tidak
memungkinkan untuk virus Pox tumbuh pada daerah tersebut karena sifat virus
Pox adalah epiteliotrofik). Virus ND memiliki sifat pantrofik sehingga
dilakukan inokulasi pada ruang alantois. Virus lain yang mungkin tumbuh pada
ruang alantois adalah virus IB, AI dan Parvovirus. Memperbanyak virus
dimaksudkan untuk meningkatkan titer virus dengan cara menumbuhkan virus
pada sel hidup. Virus bersifat obligat intraseluler sehingga mutlak
membutuhkan sel hidup untuk proses replikasinya. Selain TAB perbanyakan
virus dapat dilakukan pada hewan percobaan (dalam hal ini unggas) dan biakan
sel. TAB yang telah diinokulasi diamati tiap hari dengan candling untuk

68
 menentukan apakah TAB hidup ataukah telah mati. Embrio dipanen pada hari
ke-5 pascainokulasi dan dipanen cairan alantoisnya.

4.3.2 Uji HA-HI

Uji HA/HI merupakan uji baku dari OIE untuk meneguhkan diagnosa
sementara dari kasus ND. Uji HA digunakan untuk mendeteksi protein
hemaglutinin pada virus. Hemaglutinin (HA) merupakan protein perlekatan
virus ND yang berperan dalam mengaglutinasi eritrosit. Virus yang memiliki
protein hemaglutinin adalah AI dan ND. Kegunaan lainnya dari uji HA adalah
sebagai dasar untuk menentukan titer virus Titer HA adalah pengenceran
tertinggi yang masih dapat mengaglutinasi eritrosit. HA sempurna ditandai
dengan tidak terjadinya pengendapan sel darah merah di dasar mikroplate, hal
ini disebabkan karena aktivitas protein virus yang mengikat sel darah merah
(Mahardika et al., 2015).
Cairan alantois dari TAB positif rapid HA diuji dengan uji mikrotiter
HA. Tujuan dari pegujian itu adalah untuk mengetahui titer dari virus yang
diuji. Dari hasil uji mikrotiter HA yang didapat ialah 25 dan 24 HAU
(Haemaglutination Unit) yang berarti pada pengenceran seri kelipatan dua
virus masih dapat menghemaglutinasi sel darah merah pada sumuran ke 5 dan
4. Hal tersebut mengindikasikan dengan sedikit virus saja telah dapat
menghemaglutinasi sel darah merah unggas yang berarti virus memiliki tingkat
keganasan yang tinggi. Kemudian akan diencerkan menjadi untuk uji HI.
Prinsip uji HI adalah reaksi ikatan antara antibodi pada serum dengan
antigen virus sehingga menghambat perlekatan Hemaglutinin virus dengan
asam sialat pada sel darah unggas sehingga pada dasar sumuran mikroplate
tidak terbentuk endapan (OIE, 2012). Uji HI menggunakan serum ayam yang
telah divaksinsi oleh vaksin ND sehingga ayam tersebut memproduksi serum
homolog ND yang digunakan untuk uji HI. Dari hasil uji HI didapat hasil
positif ND. Uji HA/HI memiliki kelebihan dan kekurangan. Kelebihan dari uji

69
ini adalah relatif mudah, murah serta reagen dan RBC yang diperlukan untuk
pengujian dapat dipersiapkan dengan mudah oleh masing masing laboratorium,
sedangkan kekurangannya titrasi antigen harus dilakukan setiap pengujian,
interpretasi hasil uji memerlukan keahlian khusus serta adanya prosedur yang
berbeda dari masingmasing laboratorium dapat memberikan hasil yang berbeda
(Selleck, 2007).

70