Uji aktivitas antibakteri dengan metode mikrodilusi.

Sterilisasi dilakukan untuk

memperoleh sterilitas alat dan bahan yang digunakan untuk uji antibakteri. Sterilisasi basah
dilakukan dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit, 121ºC, 1,5 atm.
Mikroba uji pada penelitian ini adalah bakteri Escherichia coli dan Salmonella thypimurium.
Sebanyak satu ose isolat E. coli dan S. thypimurium diinokulasikan pada media Mueller-Hinton
Broth (MHB) dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 18-24 jam (Mohammed dan Habil, 2015).
Transmitan suspensi E. coli dan S. thypimurium diukur menggunakan spektrofotometer UV
pada panjang gelombang 530 nm. Suspensi bakteri diencerkan hingga diperoleh nilai
transmitan sebesar 25%.
Pengujian daya hambat minyak serai/kapulaga dilakukan dengan metode mikrodilusi
menggunakan 96-well microplate. Sampel yang diuji terdiri dari tetracycline sebagai kontrol
positif, minyak serai, minyak kapulaga, SNEDDS blank, dan SNEDDS minyak serai dan
kapulaga. Sebelum diuji, dibuat larutan stok minyak serai dan kapulaga 50% (v/v) dalam etanol
absolut. Sampel uji minyak serai dan kapulaga diencerkan dengan media MHB hingga
diperoleh konsentrasi sebesar 0,75% (v/v). Dibuat juga etanol 0,72% (v/v) sebagai kontrol
pelarut. SNEDDS blank merupakan formula optimum SNEDDS yang terdiri dari VCO, Tween
80, dan PEG 400, tanpa kandungan minyak serai dan kapulaga. Semua sampel direplikasi
sebanyak enam kali.
Pada setiap sumuran microplate, dimasukkan campuran sampel uji, media dan mikroba uji
sampai diperoleh volume total sebanyak 200 µl seperti pada tabel 8.
 Tabel 8. Tabel microplate 96 well polystyrene untuk uji mikrodilusi
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A SS SS SS SS SS SS SK SK SK SK SK SK
B SB SB SB SB SB SB MS MS MS MS MS MS
C MK MK MK MK MK MK ET ET ET ET ET ET
D K+ K+ K+ K+ K+ K+ KM KM KM KM KM KM
E K- K- K- K- K- K-
F
G
H
I
J
Keterangan: SS= SNEDDS minyak serai, SK= SNEDDS minyak kapulaga, SB= SNEDDS blank, MS=
minyak serai 0,75% (v/v), MK= minyak kapulaga 0,75% (v/vz), ET= etanol 0,72% (v/v), K+= tetracycline
3% (b/v), KM= kontrol media, dan K-= kontrol negatif

Kelompok-kelompok uji yang akan dimasukkan ke microplate 96-well terdiri dari:

1. Kelompok pertama berisi 15 µl formula SNEDDS minyak serai 0,75% 180 µl media MHB
dan 5 µl mikroba uji berikut replikasinya.
2. Kelompok kedua berisi 15 µl formula SNEDDS minyak kapulaga 0,75% 180 µl media MHB
dan 5 µl mikroba uji berikut replikasinya.
3. Kelompok ketiga berisi SNEDDS blank 180 µl media MHB dan 5 µl mikroba uji berikut
replikasinya.
4. Kelompok keempat berisi 195 µl sampel minyak serai 0,75% (v/v) dalam media MHB dan 5
µl mikroba uji berikut replikasinya.
5. Kelompok kelima berisi 195 µl sampel minyak kapulaga 0,75% (v/v) dalam media MHB dan
5 µl mikroba uji berikut replikasinya.
6. Kelompok keenam berisi 195 µl sampel etanol 0,72% dalam media MHB dan 5 µl mikroba
uji berikut replikasinya sebagai kontrol pelarut. Kontrol pelarut dapat mununjukkan apakah
aktivitas daya hambat yang dimiliki sampel minyak serai saja atau minyak kapulaga saja
juga berasal dari pengaruh etanol yang ditambahkan untuk mengencerkan sampel minyak
serai dan kapulaga hingga kadar 0,75%.
7. Kelompok ketujuh berisi 15 µl tetracycline 5 mg/ml, 180 µL media MHB dan 5 µl kultur E.
coli dan S. thypimurium. Berikut sebagai kontrol positif. Kontrol positif adalah kelompok
perlakuan yang menggunakan senyawa yang terbukti dapat menghambat pertumbuhan E.
coli dan S. thypimurium. Beberapa penelitian uji aktivitas minyak atsiri terhadap E. coli dan
S. thypimurium. Menggunakan tetracycline sebagai kontrol positif (Miladinovic et al., 2014).
Hal tersebut karena tetracycline merupakan pilihan utama terapi antibakteri dan mekanisme
yang diduga sama dengan mekanisme daya hambat minyak atsiri tersebut. Penggunaan
 tetracycline sebagai kontrol positif dapat membandingkan efektivitas sampel dan
tetracycline yang memiliki mekanisme daya hambat yang sama.
8. Kelompok kedelapan berisi 200 µl media MHB sebagai kontrol media.
9. Kelompok kesembilan 195 µl media MHB dan 5 µl mikroba uji berikut replikasinya sebagai
kontrol negatif. Kontrol negatif adalah kelompok tanpa perlakuan yang digunakan untuk
menghasilkan suatu baseline sehingga perubahan pada variabel tergantung dapat dilihat.

Microplate selanjutnya diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37ºC (Dalleau et al., 2008).
Selanjutnya dilakukan pengukuran Optical Density (OD) menggunakan microplate reader pada
panjang gelombang 595 nm (Skogman, 2012). Pengukuran OD bertujuan untuk menentukan
Konsentrasi Hambat Minimum (KHM).
Uji Aktivitas Antibakteri. Data OD dari masing-masing sampel dikonversikan menjadi
persentase daya hambat dengan persamaan Quave et al. (2008) pada persamaan (1).
OD sampel 48 − OD sampel 0
% Penghambatan = 1 − × 100%
OD kontrol (−) 48 − 𝑂𝐷 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 (−)0

Dalleau, S., E. Cateu, T. Berges, J. Berjeaud and C. Imbert. 2008. In vitro activity of terpenes
against Candida biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 31: 572-576.

Skogman, M.E. 2012. A platform for anti-biofilm assays. Pharmaceutical Sciences. Departement
of Biosciences. Abo Akademi University. Abo, Finland.