LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM ANALISIS FARMASI II

PENETAPAN KADAR PARASETAMOL DAN NATRIUM DIKLOFENAK

DALAM SEDIAAN JAMU DENGAN METODE KLT-
SPEKTROFOTODENSITOMETRI

OLEH:
KELOMPOK 4
GOLONGAN II

NI WAYAN YENI ANTARI (1508505045)

I MADE SUARDHIKA (1508505046)
DEWA GEDE PURNAMA PUTRA (1508505047)
DEWA AYU SRI KUSUMA DEWI (1508505048)
R.BAGUS RAKA PRATAMA (1508505050)

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2017
PENETAPAN KADAR PARASETAMOL DAN NATRIUM DIKLOFENAK
DALAM SEDIAAN JAMU DENGAN METODE KLT-
SPEKTROFOTODENSITOMETRI
I. Tujuan Praktikum
1.1 Memahami prinsip metode penetapan kadar parasetamol dan natrium
diklofenak dalam sediaan jamu dengan metode KLT-
Spektrofotodensitometri.
1.2 Menetapkan kadar parasetamol dan natrium diklofenak dalam sediaan jamu
dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT).
1.3 Mengetahui tingkat validitas dari metode penetapan kadar parasetamol dan
natrium diklofenak yang dilakukan.
II. Dasar Teori
2.1 Natrium Diklofenak
Natrium diklofenak(C14H10CL2NNaO2)adalah berupa serbuk hablur,
berwarna putih, dan tidak berasa, memiliki BM318,13 gram/mol (Nayak, 2010).
Natrium diklofenak sedikit larut dalam air, larut dalam alkohol; praktis tidak larut
dalam kloroform dan eter; bebas larut dalam alkohol metil. pH larutan 1 % b/v
dalam air adalah antara 7.0 dan 8 (Sweetman, 2009). Natrium diklofenak
merupakan suatu anti radang non steroid (Non steroid anti- inflamatory drugs,
NSAIDs) dan turunan asam fenil asetat (Sukmawati dan Suprapto, 2010).

(a) (b)
Gambar 2.1.(a) Struktur Kimia Natrium Diklofenak (Kulkarni et al., 2012),
(b) Spektrum UV Natrium Diklofenak(Moffat et al., 2005).
Natrium diklofenak menyerap panjang gelombang maksimum 273 nm
dengan absorptivitas molar 309a pada larutan asam dan 275 nm dengan
absorptivitas molar 351a pada larutan basa. Nilai Rf dengan fase gerak toluena-
etil asetat-asam asetat glasial (6,5:3,5:0,02) v/v/v dan fase diam silika gel 60 F-

1
254 adalah 0,51 (Kulkarni et al., 2012). Natrium diklofenak memiliki sistem
pelarut untuk KLT yaitu sistem TA-Rf 90; sistem TD-Rf 25; sistem TE-Rf 12;
sistem TF-Rf 27; sistem TG-Rf 29; sistem TAD-Rf 47; sistem TAE-Rf 90; sistem
TAJ-Rf 40; sistem TAK-Rf 64; sistem TAL-Rf 84 (Moffat et al, 2005).
2.2 Parasetamol
Parasetamol (Acetaminophen atau N-asetil-4-aminofenol) memiliki rumus
molekul C8H9NO2 dengan BM sebesar 151,16 gram/mol. Parasetamol
mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari 101,0% C8H9NO2,
dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan. Parasetamol berupa hablur atau
serbuk putih, tidak berbau, dan memiliki rasa pahit, larut dalam 70 bagian air,
dalam 7 bagian etanol 95% P, dalam 13 bagian aseton P, dalam 40 bagian gliserol
P dan dalam 9 bagian propilenglikol P, larut dalam larutan alkali hidroksida.
Parasetamol memiliki suhu lebur 169º sampai 172º.Khasiat dan penggunaan
parasetamol adalah analgetikum dan antipiretikum (Depkes RI, 1979).

(a) (b)
Gambar 2.2.(a) Struktur Kimia Parasetamol (Kulkarni et al., 2012),
(b) Spektrum UV Paracetamol(Moffat et al., 2005)
Pada larutan asam parasetamol menyerap panjang gelombang maksimum
245 nm dengan absorptivitas molar 668a dan pada larutan basa panjang
gelombang maksimumnya 257 nm dengan absorptivitas molar 715a. Nilai Rf
dengan fase gerak toluena-etil asetat-asam asetat glasial (6,5:3,5:0,02) v/v/v dan
fase diam silica gel 60 F-254 adalah 0,64(Kulkarni et al., 2012). Parasetamol
memiliki sistem pelarut untuk KLT yaitu sistem TA-Rf 95; sistem TB-Rf 00;
sistem TD-Rf 15; sistem TE-Rf 45; sistem TF-Rf 32; sistem TAD-Rf 26; sistem
TAE-Rf 77; sistem TAJ-Rf 30; sistem TAK-Rf 05; sistem TAL—Rf 73 (Moffat et
al, 2005).

2
2.3 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi lapis tipis merupakan metode pemisahan campuran analit
dengan mengelusi analit melalui suatu lempeng kromatografi lalu melihat
komponen/analit yang terpisah dengan penyemprotan atau pengecatan. Dalam
KLT digunakan dua yaitu fase diam dan fase gerak, dimana fase diamnya
merupakan lapisan yang seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang
didukung oleh lempeng kaca, plat aluminium, atau plat plastik sedangkan, fase
gerak dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak sepanjang fase diam
karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau
karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending)
(Gandjar dan Rohman, 2012).
Fase diam yang paling sering digunakan dalam KLT adalah silika gel. Silika
gel disiapkan dengan hidrolisis natrium silikat menjadi asam polisilikat yang
mengalami kondensasi dan polimerisasi lebih lanjut menghasilkan bahan silika
gel. Lempeng-lempeng KLT tersedia dengan indikator fluoresen (bahan yang
berfluoresensi atau berpendar), yang biasanya berupa seng silikat atau fosfor yang
diaktivasi oleh mangan (Mn), yang akan mengemisikan suatu fluoresensi hijau
ketika diradiasi/disinari dengan lampu UV (Gandjar dan Rohman, 2012).
Pemilihan fase gerak dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan
mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem pelarut yang
paling sederhana ialah campuran dua pelarut organik karena daya elusi campuran
kedua pelarut ini dapat diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi
secara optimal atau sempurna (Gandjar dan Rohman, 2007).
Prinsip dari pemisahan komponen senyawa kimia dengan KLT didasarkan
pada perbedaan laju migrasi masing-masing molekul senyawa diantara fase diam
dan fase gerak yang dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor seperti adsorpsi atau
partisi pada fase diam, kelarutan, serta polaritas.Data yang diperoleh dari analisis
dengan metode KLT adalah nilai Rf. Nilai Rf didefinisikan sebagi perbandingan
jarak yang ditempuh oleh senyawa pada permukaan fase diam dibagi dengan jarak
yang ditempuh oleh pelarut sebagai fase gerak (Stahl, 1985).

3
 Perhitungan nilai Rf dirumuskan sebagai berikut
jarak yang ditempuh solut
Rf=
jarak yang ditempuh fase gerak
(Gandjar dan Rohman, 2012).
2.4 KLT-Spektrofotodensitometri
Kromatografi lapis tipis (KLT atau TLC) merupakan bentuk kromatografi
planar selain kromatografi kertas, yang mana fase diamnya berupa lapisan yang
seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng
kaca, plat aluminium, atau plat plastik. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut
pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada
pengembangan secara menaik (ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada
pengembangan secara menurun (descending) (Gandjar dan Rohman, 2007).
KLT-Densitometer (KLT Scanner) merupakan instrumen pengukur densitas
bercak hasil pemisahan kromatografi lapis tipis. Instrumen dilengkapi dengan
suatu perangkap optik, sumber cahaya dan detektor seperti halnya
spektrofotometer. Keuntungan utama analisis secara KLT-densitometer adalah
memerlukan waktu lebih singkat dan lebih murah biaya oprasionalnya
dibandingkan KCKT (Hayun dkk., 2007).
Prinsip kerja spektrofotodensitometri berdasarkan interaksi antara radiasi
elektromagnetik dari sinar UV-Vis dengan analit yang merupakan noda pada plat.
Radiasi elektromagnetik yang datang pada plat diabsorpsi oleh analit, ditransmisi
atau diteruskan jika plat yang digunakan transparan. Radiasi elektromagnetik yang
diabsorpsi oleh analit atau indikator plat dapat diemisikan berupa flouresensi dan
fosforesensi (Sherma dan Fried, 1996)
Peristiwa fluoresensi adalah pemancaran kembali sinar oleh molekul obat
yang telah menyerap energi sinar dan terjadi dalam waktu yang singkat setelah
penyerapan (10-8 detik). Pengukuran flouresensi merupakan metode pengukuran
langsung untuk senyawa yang peka dalam panjang gelombang ultraviolet dan
visibel. Intensitas fluoresensi (F) sebanding dengan banyaknya sinar yang diserap
oleh molekul analit sehingga absorptivitas suatu senyawa berkaitan dengan
intensitas fluoresensinya. Molekul-molekul seperti hidrokarbon jenuh yang tidak
menyerap sinar UV-Vis tidak akan berfluoresensi. Senyawa-senyawa yang
berfluoresensi pasti menyerap sinar UV karena peristiwa fluoresensi didahului

4
oleh penyerapan/absorpsi. Teknik analisis berdasarkan deteksi fluoresensi
memiliki keunggulan dibandingkan teknik lainnya yaitu sensitifitas dan
selektifitas yang tinggi (Gandjar dan Rohman, 2012).
Evaluasi bercak hasil KLT secara densitometri, bercak di- scanning dengan
sumber sinar dalam bentuk celah (slit) yang dapat dipilih baik panjangnya
maupun lebarnya. Sinar yang dipantulkan diukur dengan sensor cahaya
(fotosensor). Perbedaan antara sinyal optik daerah yang tidak mengandung bercak
dengan daerah yang mengandung bercak dihubungkan dengan banyaknya analit
yang ada melalui kurva kalibrasi yang telah disiapkan dalam lempeng yang sama.
Pengukuran densitometri dapat dibuat dengan absorbansi atau dengan fluoresensi
(Settel, 1997).

Gambar 5. Komponen Spektrofotodensitometri

Adanya penghamburan sinar oleh partikel-partikel yang ada di lempeng,
maka suatu persamaan matematis yang sederhana dan terdefinisi dengan baik
yang menyatakan hubungan antara sinyal sinar dan banyaknya (konsentrasi)
senyawa dalam lapisan lapis tipis tidak pernah dijumpai. Sebagai akibatnya
hubungan ini tidak bersifat linier. Meskipun demikian, karena saat ini tersedia
perangkat lunak (software) ataupun integrator yang dapat menangani hubungan
yang tidak linier, maka tidak diperlukan untuk melinierkan hubungan
antara konsentrasi dan respon optis (Settel, 1997). Untuk scanning dengan
fluororesensi, intensitas sinar yang diukur berbanding langsung dengan
banyaknya analit (senyawa) yang berfluororesensi lebih sensitif dibanding dengan
pengukuran absorbansi dan fungsi kalibrasi seringkali linier pada kisaran

5
konsentrasi yang agak luas. Karena alasan-alasan ini, senyawa-senyawa
yang bersifat fluororesensi secara inhiren selalu di –scan dengan fluororesensi.
Untuk senyawa-senyawa yang tidak berfluororesensi, maka senyawa tersebut
dapat diperlakukan dengan cara mereaksikannya dengan reagen tertentu hingga
dihasilkan senyawa yang berfluororesensi (Settel, 1997).
2.5 Validasi Metode
Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) digunakan
untuk menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan
pada kisaran analit yang akan dianalisis (Gandjar dan Rohman, 2007).
Ada 8 tahap dalam validasi metode analisis, antara lain: akurasi, presisi,
batas deteksi (LOD), batas kuantifikasi (LOQ), spesifisitas, linieritas dan rentang,
kekasaran (ruggedness), dan ketahanan (robutness). Akurasi atau ketepatan
merupakan ketelitian metode analisis atau kedekaran antara nilai terukur dengan
nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya, atau nilai rujukan.
Akurasi diukur sebagai banyaknya analit yang diperoleh kembali pada suatu
pengukuran dengan melakukan spiking pada suatu sampel. Untuk pengujian
senyawa obat, akurasi diperoleh dengan membandingkan hasil pengukuran
dengan bahan rujukan standar (standard reference material, SRM). Data akurasi
harus dilaporkan sebagai presentase perolehan kembali (Gandjar dan Rohman,
2007).
Linieritas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil-
hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit pada kisaran
yang diberikan. Linieritas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva
kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi (x). linieritas
dapat diukur dengan melakukan pengukuran tunggal pada konsentrasi yang
berbeda-beda. Data yang diperoleh selanjutnya diproses dengan metode kuadrat
terkecil, untuk selanjutnya dapat ditentukan nilai kemiringan (slope), intersep, dan
koefisien korelasinya (Gandjar dan Rohman, 2007).
Batas deteksi didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah dalam
sampel yang masih dapat dideteksi, meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi.
LOD merupakan batas uji secara spesifik menyatakan apakah analit di atas atau di
bawah nilai tertentu. Definisi batas deteksi yang paling umum digunakan dalam

6
kimia analisis adalah bahwa batas deteksi merupakan kadar analit yang
memberikan respon sebesar respon blanko (Yb) ditambah dengan 3 simpangan
baku blanko (3Sb) (Gandjar dan Rohman, 2007).
Batas kuantifikasi didefinisikan sebgai konsentrasi analit terendah dalam
sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima
pada kondisi operasional metode yang digunakan (Gandjar dan Rohman, 2007).
III. ALAT DAN BAHAN
3.1 Alat
a. Plat KLT silika 60 F254
b. Pipet kapiler 2 μL
c. Spektrofotodensitometer (CAMAG TLC Scanner)
d. Neraca analitik
e. Corong kaca
f. Pipet ukur 1 mL, 5 mL, dan 10 mL
g. Bulbfiller
h. Labu ukur 5 mL dan 10 mL
i. Botol vial 10 mL
j. Beaker glass 50 mL
k. Kertas saring
l. Mortir dan stamper
m. Tabung sentrifugasi
n. Alat sentrifugasi
o. Alat sonikasi
p. Chamber
q. Oven
r. Batang pengaduk
s. Sendok tanduk
3.2 Bahan
a. Jamu
b. Tablet parasetamol
c. Tablet natrium diklofenak
d. Metanol

7
 e. Asam asetat glasial
f. Etil asetat
g. Toluena
h. Serbuk baku parasetamol
i. Serbuk baku natrium diklofenak
VI. PROSEDUR KERJA
4.1 Pembuatan Larutan Stok Parasetamol 1 mg/µL
a. Perhitungan
Diketahui : Konsentrasi larutan stok parasetamol = 1 mg/mL
= 1000 ng/ µL
Volume yang dibuat = 25 mL
Ditanya : Massa parasetamol = .........?
1mg x mg
Jawab : =
1 mL 25 mL
x = 25 mg
b. Cara kerja :
Ditimbang sebanyak 25 mg serbuk parasetamol baku, dimasukkan ke
dalam beaker glass dan ditambahkan metanol secukupnya hingga larut.
Larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, kemudian ditambahkan
metanol sampai tanda batas lanu ukur dan digojog hingga homogen. Larutan
stok parasetamol ditempatkan pada botol vial dan diberikan label “Stok
Parasetamol 1 mg/mL”.
4.2 Pembuatan Larutan Stok Natrium Diklofenak 1 mg/µL
a. Perhitungan
Diketahui : Konsentrasi larutan stok natrium diklofenak = 1 mg/mL
= 1000 ng/ µL
Volume yang dibuat = 25 mL
Ditanya : Massa parasetamol = .........?
1mg x mg
Jawab : =
1 mL 25 mL
x = 25 mg

8
 b. Cara kerja :
Ditimbang 25 mg serbuk natrium diklofenak baku, dimasukkan ke dalam
beaker glass dan ditambahkan metanol secukupnya hingga larut. Larutan
dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL, kemudian ditambahkan metanol
sampai tanda batas labu ukur dan digojog hingga homogen. Larutan stok
natrium diklofenak ditempatkan pada botol vial dan diberikan label “Stok
Natrium Diklofenak 1 mg/mL”.
4.3 Pembuatan Larutan Seri Parasetamol dan Natrium Diklofenak
4.3.1 Pembuatan Larutan Seri 100 ng/μL
a. Perhitungan
Diketahui : Kosentrasi larutan stok = 1 mg/mL
= 1000 ng/μL
Konsentrasi larutan seri = 100 ng/μL
Volume larutan seri =5 mL
= 5000 μL
Ditanya : Volume larutan stok yang dipipet = …?
Jawab : M1.V1 = M2.V2
1000 ng/μL . V1 = 100 ng/μL . 5000 μL
100 ng/μL . 5000 μL
V1 =
1000 ng/μL
V1 = 500 μL = 0,5 mL
b. Cara Kerja
Dipipet masing-masing 0,5 mL larutan stok parasetamol 1 mg/mL dan 0,5
mL larutan stok natrium diklofenak 1 mg/mL. Kedua larutan dimasukkan ke
dalam labu ukur 5 mL, ditambahkan metanol hingga tanda batas labu ukur
kemudian digojog hingga homogen, ditempatkan pada botol vial dan diberi
label “Seri I”.
4.3.2 Pembuatan Larutan Seri 200 ng/μL
a. Perhitungan
Diketahui : Kosentrasi larutan stok = 1 mg/mL
= 1000 ng/μL
Konsentrasi larutan seri = 200 ng/μL

9
 Volume larutan seri = 5 mL
= 5000 μL
Ditanya : Volume larutan stok yang dipipet = …?
Jawab : M1.V1 = M2.V2
1000 ng/μL . V1 = 200 ng/μL . 5000 μL
200 ng/μL . 5000 μL
V1 =
1000 ng/μL
V1 = 1000 μL = 1 mL
b. Cara Kerja
Dipipet masing-masing 1 mL larutan stok parasetamol 1 mg/mL dan 1
mL larutan stok natrium diklofenak 1 mg/mL. Kedua larutan dimasukkan ke
dalam labu ukur 5 mL, ditambahkan metanol hingga tanda batas labu ukur
kemudian digojog hingga homogen, ditempatkan pada botol vial dan diberi
label “Seri II”.
4.3.3 Pembuatan Larutan Seri 300 ng/μL
a. Perhitungan
Diketahui : Kosentrasi larutan stok = 1 mg/mL
= 1000 ng/μL
Konsentrasi larutan seri = 300 ng/μL
Volume larutan seri = 5 mL
= 5000 μL
Ditanya : Volume larutan stok yang dipipet = …?
Jawab : M1.V1 = M2.V2
1000 ng/μL . V1 = 300 ng/μL . 5000 μL
300 ng/μL . 5000 μL
V1 =
1000 ng/μL
V1 = 1500 μL = 1,5 mL
b. Cara Kerja
Dipipet masing-masing 1,5 mL larutan stok parasetamol 1 mg/mL dan 1,5
mL larutan stok natrium diklofenak 1 mg/mL. Kedua larutan dimasukkan ke
dalam labu ukur 5 mL, ditambahkan metanol hingga tanda batas labu ukur

10
 kemudian digojog hingga homogen, ditempatkan pada botol vial dan diberi
label “Seri III”.
4.3.4 Pembuatan Larutan Seri 400 ng/μL
a. Perhitungan
Diketahui : Kosentrasi larutan stok = 1 mg/mL
= 1000 ng/μL
Konsentrasi larutan seri = 400 ng/μL
Volume larutan seri = 5 mL
= 5000 μL
Ditanya : Volume larutan stok yang dipipet = …?
Jawab : M1.V1 = M2.V2
1000 ng/μL . V1 = 400 ng/μL . 5000 μL
400 ng/μL . 5000 μL
V1 =
1000 ng/μL
V1 = 2000 μL = 2 mL
b. Cara Kerja
Dipipet masing-masing 2 mL larutan stok parasetamol 1 mg/mL dan 2
mL larutan standar natrium diklofenak 1 mg/mL. Kedua larutan dimasukkan
ke dalam labu ukur 5 mL, digojog hingga homogen, ditempatkan pada botol
vial dan diberi label “Seri IV”.
4.3.5 Pembuatan Larutan Seri 500 ng/μL
a. Perhitungan
Diketahui : Kosentrasi larutan stok = 1 mg/mL
= 1000 ng/μL
Konsentrasi larutan seri = 500 ng/μL
Volume larutan seri = 5 mL
= 5000 μL
Ditanya : Volume larutan stok yang dipipet = …?
Jawab : M1.V1 = M2.V2
1000 ng/μL . V1 = 500 ng/μL . 5000 μL
500 ng/μL . 5000 μL
V1 =
1000 ng/μL

11
 V1 = 2500 μL = 2,5 mL
b. Cara Kerja
Dipipet masing-masing 2,5 mL larutan stok parasetamol 1 mg/mL dan 2,5
mL larutan standar natrium diklofenak 1 mg/mL. Kedua larutan dimasukkan
ke dalam labu ukur 5 mL, digojog hingga homogen, ditempatkan pada botol
vial dan diberi label “Seri V”.
4.3.6 Jumlah Penotolan Larutan Seri
Kadar larutan standar yang diinginkan pada plat KLT dibuat berseri
dengan kadar 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng dan 500 ng sehingga jumlah
penotolannya adalah sebagai berikut.
Kandungan Parasetamol
Totolan Larutan Penotolan dan Natrium Diklofenak
(ng)
1 Seri 1 100 ng/µL sebanyak 2 µL 200
2 Seri 2 200 ng/µL sebanyak 2µL 400
3 Seri 3 300 ng/µL sebanyak 2 µL 600
4 Seri 4 400 ng/µL sebanyak 2 µL 800
5 Seri 5 500 ng/µL sebanyak 2µL 1000

4.4 Ekstraksi dan Pembuatan Larutan Sampel Parasetamol dan Natrium

Diklofenak dari Sediaan Jamu
a. Perhitungan
Diketahui : Bobot parasetamol dalam tablet = 500 mg
Bobot parasetamol yang digunakan = 250 mg
Bobot natrium diklofenak = 200 mg
Bobot jamu yang digunakan = 7000 mg
Volume parasetamol = 10 mL
Volume natrium diklofenak = 10 mL
Bobot pengambilan campuran = 500 mg
Ditanya : Berapa konsentrasi parasetamol dalam sampel =…..?
Berapa konsentrasi natrium diklofenak dalam sampel =…..?

12
Jawab :
Bobot serbuk parasetamol yang ditimbang
kadar parasetamol dalam tablet kadar parasetamol yang diinginkan
=
bobot rata-rata serbuk tablet x
500 mg 250 mg
=
y x
1
x = 2.y mg

Bobot Seluruh Campuran = 7000 mg + 250 mg + 200 mg

= 7450 mg
250 mg
Parasetamol = x 500 mg
7450 mg
= 16,7785 mg
Konsentrasi Parasetamol Awal = 16,7785 mg/10 mL
= 1,67785 mg/mL
= 1677,85 ng/μL
Konsentrasi Parasetamol Akhir :
C1 x V1 = C2 x V2
1677,85 ng/μL x 1000 μL = C2 x 5000 μL
1677,85 ng/μLx1000µL
C2 =
5000 µL
= 335,57 ng/μL
Konsentrasi Parasetamol dalam 2 μL pipet kapiler :
335,57 ng/μL x 2 μL= 671,14 ng/2μL
200 mg
Natrium Diklofenak = x 500 mg
7450 mg
= 13,4228 mg
Konsentrasi Natrium Diklofenak Awal = 13,4228 mg/10 mL
= 1,34228 mg/mL
= 1342,28 ng/μL
Konsentrasi Natrium Diklofenak Akhir :
C1 x V1 = C2 x V2
1342,28 ng/μL x 1000 μL = C2 x 5000 μL

13
 1342,28 ngx1000μL
C2 =
5000 µL
= 268,456 ng/μL
Konsentrasi Natrium Diklofenak dalam 2 μL pipet kapiler :
268,456 ng/μL x 2 μL= 536,912 ng/2μL
b. Cara Kerja
Digerus 1 tablet parasetamol 500 mg dan 4 tablet natrium
diklofenak 50 mg. Sampel jamu ditimbang sebanyak 7000 mg, ditambahkan
serbuk parasetamol setara 250 mg dan serbuk natrium diklofenak setara 200
mg. Serbuk jamu, parasetamol, dan natrium diklofenak dicampur hingga
homogen. Campuran serbuk yang telah homogen kemudian ditimbang untuk
mengetahui bobot campuran. Ditimbang 500 mg campuran sebanyak tiga
kali dan dilarutkan masing-masing 500 mg campuran dengan 10 mL
metanol dalam erlenmeyer, kemudian disonikasi selama 5 menit. Setelah
disonikasi, dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi. Larutan kemudian
disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 2000 rpm. Selanjutnya
campuran serbuk dengan metanol yang telah disentrifugasi, disaring
menggunakan kertas saring. Diambil 1 mL filtrat kemudian dimasukkan ke
dalam gelas ukur 5 ml dan ditambahkan methanol hingga tanda batas 5 mL.
Filtrat yang telah diencerkan tersebut merupakan larutan sampel 1, 2, dan 3
yang siap ditotolkan pada plat KLT. Sampel ditotolkan masing-masing 2 μL
untuk setiap sampel.
4.6 Pembuatan Larutan Uji
a. Pembuatan Larutan Uji Parasetamol 400 ng/ µL
Diketahui :
C uji parasetamol = 400 ng/µL
V uji yang dibuat = 5 mL
C stok = 1000 ng/µL
Ditanya :
V Stok parasetamol yang dipipet= ….?
Jawab :
Cstok x Vstok = Cuji x Vuji

14
 1000 ng/µL x Vstok = 400 ng/µL x 5000 µL
V stok parasetamol yang dipipet = 2 mL
b. Pembuatan larutan uji natrium diklofenak 300 ng/µL
Diketahui :
C uji natrium diklofenak = 400 ng/µL
V uji yang dibuat = 5 mL
C stok natrium diklofenak = 1000 ng/µL
Ditanya :
V Stok natrium diklofenak yang dipipet= ….?
Jawab :
Cstok x Vstok = Cuji x Vuji
1000 ng/µL x Vstok = 300 ng/µL x 5000 µL
V stok parasetamol yang dipipet = 1,5 mL
c. Cara Kerja
Ditimbang 500 mg serbuk jamu, dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer.
Ditambahkan 2 ml larutan standar parasetamol dan 1,5 ml larutan standar natrium
diklofenak. Ditambahkan 10 ml methanol. Campuran tersebut disonikasi selama 5
menit, kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2000 rpm.
Selanjutnya campuran serbuk dengan metanol yang telah disentrifugasi, disaring
menggunakan kertas saring. Diambil 1 mL filtrat kemudian dimasukkan ke dalam
gelas ukur 5 ml dan ditambahkan methanol hingga tanda batas 5 mL. Dilakukan
pengulangan sebanyak 2 kali untuk mendapatkan larutan uji 1, 2, dan 3.
4.7 Pembuatan Fase Gerak
Fase gerak yang digunakan adalah toluena: etil asetat: asam asetat dengan
perbandingan 6,5 : 3,5 : 0,02 v/v/v (Kulkarni et al., 2012).
a. Perhitungan
Diketahui : Volume fase gerak = 25 mL
Ditanya : Volume toluena, etil asetat, asam asetat = ...?
6,5
Jawab : Toluena = x 25 mL
6,5+3,5+0,02
= 10, 22 mL

15
 3,5
Etil asetat = x 25 mL
6,5+3,5+0,02
= 8,73 mL
0,02
Asam asetat = x 25 mL
6,5+3,5+0,02
= 0,05 mL
b. Prosedur kerja :
Dipipet toluena sebanyak 10,22 mL, etil asetat sebanyak 8,73 mL, dan
asam asetat sebanyak 0,05 mL. Ketiga larutan tersebut dimasukkan ke
dalam labu ukur 25 mL dan digojog hingga homogen.
4.8 Pemisahan dan Penetapan Kadar Parasetamol dan Natrium Diklofenak
dengan Metode KLT-Spektrofotodensitometri
Disiapkan fase diam yaitu plat KLT silika 60 F254 dengan ukuran 18 cm x 10
cm. Dilakukan pencucian plat dengan metanol sebanyak 10 mL. Selanjutnya plat
diaktivasi menggunakan oven pada suhu 1100C selama 10 menit. Kemudian
dilakukan penjenuhan chamber dengan menggunakan fase gerak toluena : etil
asetat : asam asetat glasial (6,5 : 3,5 : 0,02 v/v/v) sebanyak 25 mL.Larutan seri
konsentrasi parasetamol dan natrium diklofenak, larutan uji, serta larutan sampel
ditotolkan ke plat dengan pipet kapiler 2 µL berdasarkan dengan konsentrasi yang
ditentukan.Setelah ditotolkan dengan larutan seri konsentrasi parasetamol dan
natrium diklofenak, larutan uji, dan larutan sampel, plat tersebut dielusi dalam
chamber yang telah dijenuhkan. Plat tersebut dikeringkan dan diangin-anginkan
selama 10 menit.Plat yang telah kering dianalisis menggunakan
spektrofotodensitometer. Dilakukan scanning serapan senyawa pada panjang
gelombang optimum dari parasetamol dan natrium diklofenak. Dilakukan
identifikasi terhadap puncak senyawa parasetamol dan natrium diklofenak untuk
mengetahui Rf parasetamol dan natrium diklofenak. Dengan menggunakan AUC
yang diperoleh, dibuat kurva kalibrasi untuk masing-masing senyawa
(parasetamol dan natrium diklofenak) dan dihitung kadar parasetamol dan natrium
diklofenak menggunakan persamaan regresi linier dari kurva kalibrasi. Selain itu,
dilakukan pula penghitungan beberapa parameter validasi metode seperti

16
linearitas (persamaan regresi), akurasi (% recovery), presisi (standar deviasi dan
standar deviasi relatif), LOD, dan LOQ.
V. SKEMA KERJA
5.1 Pembuatan Larutan StokParasetamol 1000 ng/Ul
5.2
Ditimbang 25 mg serbuk parasetamol baku lalu dimasukkan ke dalam
beaker glass dan ditambahkan metanol secukupnya hingga larut.

Larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL lalu ditambahkan metanol

hingga tanda batas dan digojog hingga homogen. Larutan kemudian
ditempatkan pada botol vial dan diberi label “Stok Parasetamol 1 mg/mL”.

5.2 Pembuatan Larutan Stok Natrium Diklofenak 1000 ng/uL

Ditimbang 25 mg serbuk natrium diklofenak baku lalu dimasukkan ke

dalam beaker glass dan ditambahkanmetanol secukupnya hingga larut.

Larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL lalu ditambahkan metanol

hingga tanda batas dan digojog hingga homogen. Larutan kemudian
ditempatkan pada botol vial dan diberi label “Stok Na-Diklofenak 1
mg/mL”.
5.3 Pembuatan Larutan Seri Parasetamol dan Natrium Diklofenak
5.3.1 Pembuatan Seri I (100 ng/uL)
Diambil masing-masing sebanyak 0,5 mL larutan stok parasetamol
1 mg/mL dan 0,5 mL larutan stok natrium diklofenak 1 mg/mL
menggunakan pipet ukur dan dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL.

Ditambahkan metanol hingga tanda batas dan digojog hingga homogen.

Larutan kemudian dimasukkan ke dalam botol vial dan diberi label “Seri I”.

5.3.2 Pembuatan Seri II (200 ng/uL)

Diambil masing-masing sebanyak 1 mL larutan stok parasetamol 1 mg/mL

dan 1 mL natrium diklofenak 1 mg/mL menggunakan pipet ukur dan
dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL.

17
 Ditambahkan metanol hingga tanda batas dan digojog hingga homogen.
Larutan kemudian dimasukkan ke dalam botol vial dan diberi label “Seri
II”.

5.3.3 Pembuatan Seri III (300 ng/uL)

Diambil masing-masing sebanyak 1,5 mL larutan stok parasetamol

1 mg/mL dan 1,5 mL larutan stok natrium diklofenak 1 mg/mL
menggunakan pipet ukur dan dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL.

Ditambahkan metanol hingga tanda batas dan digojog hingga homogen.

Larutan kemudian dimasukkan ke dalam botol vial dan diberi label “Seri
III”.

5.3.4 Pembuatan Seri IV (400 ng/uL)

Diambil masing-masing sebanyak 2 mL larutan stok parasetamol

1 mg/mL dan 2 mL larutan stok natrium diklofenak 1 mg/mL menggunakan
pipet ukur dan dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL.

Digojog hingga homogen. Larutan kemudian dimasukkan ke dalam botol

vial dan diberi label “Seri IV”.

5.3.5 Pembuatan Seri V (500 ng/uL)

Diambil masing-masing sebanyak 2,5 mL larutan stok parasetamol

1 mg/mL dan 2,5 mL larutan stok natrium diklofenak 1 mg/mL
menggunakan pipet ukur dan dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL.

Digojog hingga homogen. Larutan kemudian dimasukkan ke dalam botol

vial dan diberi label “Seri V”.

5.4 Pembuatan Larutan Uji

Serbuk jamu ditimbang sebanyak 500 mg kemudian dimasukkan ke dalam
labu Erlenmeyer.

18
 Ditambahkan 2 ml larutan standar parasetamol dan 1,5 ml larutan standar
natrium diklofenak.

Ditambahkan 10 ml metanol.

Disonikasi selama 5 menit kemudian dipindahkan ke tabung sentrifugasi.

Disentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit kemudian
disaring menggunakan kertas saring

Diambil 1 ml filtrat, dimasukkan ke dalam labu ukur 5 ml dan ditambahkan

methanol hingga tanda batas 5 ml.

Digojog hingga homogen, lalu ditampung dalam botol vial. Dilakukan

pengulangan hingga diperoleh larutan uji 2 dan 3.

5.5 Preparasi Sampel

Digerus 1 tablet parasetamol 500 mg dan 4 tablet natrium diklofenak 50

mg.

Sampel jamu sebanyak 7 gram ditambahkan serbuk parasetamol setara 250

mg dan serbuk natrium diklofenak setara 200 mg.

Ketiga serbuk tersebut dicampur hingga terbentuk campuran jamu dan

bahan kimia obat yang homogen.

Campuran serbuk kemudian ditimbang kembali 500 mg sebanyak tiga kali

dan dilarutkan masing-masing dengan 10 mL metanol dalam labu
erlenmeyer.

19
 Disonikasi selama 5 menit kemudian dipindahkan ke dalam tabung
sentrifugasi. Disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2000 rpm.
Disaring menggunakan kertas saring.

Diambil 1 ml filtrat, dimasukkan ke dalam labu ukur 5 ml dan ditambahkan

methanol hingga tanda batas 5 ml.

Digojog hingga homogen dan ditampung dalam botol vial.

5.6 Pembuatan Fase Gerak

Dipipet toluena sebanyak 10,22 mL, etil asetat dipipet sebanyak 8,73 mL,
asam asetat glacial dipipet sebanyak 0,05 mL.

Ketiga larutan tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL. Labu

ukur digojog hingga larutan homogen.

5.7 Penetapan Kadar Parasetamol dan Natrium Diklofenak dengan Metode KLT
Spektrofotodensitometri

Penetapan kadar parasetamol dan natrium diklofenak menggunakan plat

KLT Aluminium Silika Gel 60 F254berukuran 18 cm × 10 cm.

Dilakukan pencucian plat dengan menggunakan metanol dan diaktivasi

pada suhu 110oC selama 10 menit.

Chamber dijenuhkan menggunakan fase gerak toluena :etila setat : asam

asetat glasial (6,5 : 3,5 : 0,02 v/v/v) sebanyak 25 mL.

Ditotolkan larutan seri masing-masing sebanyak 2 µL berdasarkan

konsentrasi yang ditentukan kemudian larutan sampel plat tersebut dielusi
dalam chamber yang telah dijenuhkan dengan fase gerak.

20
 Plat dikeringkan dengan cara diangin – anginkan selama 10 menit lalu
dianalisis dengan menggunakan spektrofotodensitometer.

Plat dimasukkan kedalam CAMAG TLC- SCANNER 3, kemudian discan

dengan panjang gelombang optimum dari parasetamol dan natrium
diklofenak .

Dilakukan identifikasi terhadap puncak senyawa parasetamol dan nartrium

diklofenak untuk mengetahui Rf dan di analisis kadar parasetamol dan
natrium diklofenak menggunakan persamaan regresi linier.

Dilakukan penghitungan beberapa parameter validasi metode seperti

linearitas (persamaan regresi), akurasi (% recovery), presisi (standar deviasi
dan standar deviasi relative), LOD, dan LOQ.
VI. HASIL PENGAMATAN
6.1 Tabel Penimbangan
No. Nama Bahan Jumlah
1 Serbuk baku Parasetamol 0,01002 Gram
2 Serbuk Baku Natrium diklofenak 0,0103 gram
3 Fase gerak :
Toluena 16,22 mL
Etil Asetat 8,7 mL
Asam Asetat Glasial 0,05 mL
4 Tablet Parasetamol 500 mg 546,3 mg
5 Tablet Natrium diklofenak 50 mg 877,8 mg
6 Sampel
Sampel I 500,3 mg
Sampel II 500,6 mg
Sampel III 500,5 mg
7 Serbuk Parasetamol

21
 Sampel I 264,6 mg
Sampel II 264,4 mg
Sampel III 264,5 mg
8 Serbuk Natrium Diklofenak
Sampel I 50 mg
Sampel II 50 mg
Sampel III 50 mg

6.2 Spektrum Overlapping Parasetamoldan Natrium Diklofenak

6.3 Hasil Scanning Spot pada λ 263 nm

Natrium
Track Parasetamol
diklofenak
Rf 0,46 0,13
Seri 1200 ng
AUC 4335,4 1754,5
Rf 0,45 0,12
Seri2 400 ng
AUC 5539,5 2706,2
Rf 0,44 0,12
Seri 3 600 ng
AUC 6413,7 3588,9
Rf 0,45 0,12
Seri 4 800 ng
AUC 7924,1 4411,2
Rf 0,45 0,12
Seri 5 1000 ng
AUC 8478,9 5244,5
Uji 1 Rf 0,42 0,12

22
 AUC 469,3 589,9
Rf 0,41 0,11
Uji 2
AUC 499,5 778,9
Rf 0,42 0,11
Uji 3
AUC 887,2 778,9
Rf 0,43 0,12
Sampel 1
AUC 5076,5 20150,2
Rf 0,44 0,12
Sampel 2
AUC 5292,9 19336
Rf 0,44 0,11
Sampel 3
AUC 5394,6 20070,7

VII. ANALISIS DATA

7.1 Parasetamol
7.1.1 Kurva Kalibrasi dan Persamaan Regresi Linier Parasetamol
Diketahui:
Konsentrasi (ng) AUC
200 ng 4335,4
400 ng 5539,5
600 ng 6413,7
800 ng 7924,1
1000 ng 8478,9
Diambil 3 data yang linier yaitu:
Konsentrasi (ng) AUC
200 ng 4335,4
600 ng 6413,7
1000 ng 8478,9

Ditanya : kurva kalibrasi dan persamaan regresi linier

Jawab :

23
 Berdasarkan 3 data linier yang digunakan dalam penentuan kurva
kalibrasi dan persamaan regresi linier, maka diperoleh kurva
kalibrasi parasetamol sebagai berikut.

Kurva Kalibrasi Paracetamol

9000
8000 y = 5.1794x + 3301.7
7000 R² = 1
6000
5000
AUC

4000 Paracetamol
3000
Linear (Paracetamol)
2000
1000
0
0 500 1000 1500
Konsentrasi (ng)

Persamaan regresi linier yang diperoleh adalah sebagai berikut.

y = 5,1794x + 3301,7dengan nilai R2 = 1
7.1.2 Penetapan Kadar Parasetamol dalam Uji
Diketahui:
Persamaan regresi linier parasetamol: y = 5,1794x + 3301,7
AUC Uji :
- Uji 1 : 469,3
- Uji 2 : 499,5
- Uji 3 : 887,2
Ditanya : kadar Parasetamol pada masing-masing Uji dan kadar
Parasetamol pada campuran jamu BKO berdasarkan
hasil pengukuran
Jawab :
- Uji 1
y = 5,1794x + 3301,7
469,3 = 5,1794x + 3301,7
5,1794x = 469,3 – 3301,7
x = -546,86 ng/2μL

24
 - Uji 2
y = 5,1794x + 3301,7
499,5 = 5,1794x + 3301,7
5,1794x = 499,5 – 3301,7
x = -541,028 ng/2μL
- Uji 3
y = 5,1794x + 3301,7
887,2 = 5,1794x + 3301,7
5,1794x = 499,5 – 3301,7
x = -466,174 ng/2μL
7.1.3 Persen Recovery Uji Parasetamol
Persen perolehan kembali Parasetamol dalam sediaan jamu BKO
dihitung dengan menggunakan rumus berikut.
Kadar Parasetamol hasil pengukuran
% Recovery = ×100%
Kadar Parasetamol sebenarnya

- Uji 1
-546,86 ng
%Recovery = ×100%
400 ng

= -136,715 %
- Uji 2
-541,028 ng
%Recovery = ×100%
400 ng

= -135,257%
- Uji 3
-466,174 ng
%Recovery = ×100%
400 ng

= -116,543%
Persen Perolehan Kembali rata-rata Uji adalah
-136,715 + -135,257 + -116,543
% Recovery =( )%
3

= -129,505 %
7.1.4 Standar Deviasi (SD) danStandar Deviasi Relatif (RSD)
- Kadar Rata-rata Uji Paracetamol
-546,86 + -541,028 + -466,174
Kadar rata-rata = ( ) ng
3

= -518,02 ng

25
 - Standar Deviasi
Ng rata-rata x- x
Sampel ng(x) (x- x )2
(x)
1 -546,86 -518,02 -28,8386 831,6651
2 -541,028 -518,02 -23,0078 529,3595
3 -466,174 -518,02 51,8464 2688,051
∑(x- x )2 =
4049,076
∑(x-x̅ )2
SD = √ n-1

4049,076
=√ 2

= ±44,99
- Standar Deviasi Relatif
SD
RSD = Kadar rata-rata ×100%
44,99
= -518,02 ×100%

= -8,68 %
7.1.5. Penetapan Kadar Parasetamol dalam Sampel
Diketahui:
Persamaan regresi linier parasetamol: y = 5,1794x + 3301,7
AUC sampel :
- Sampel 1 : 5076,5
- Sampel 2 : 5292,9
- Sampel 3 : 5394,6
Ditanya : kadar Parasetamol pada masing-masing sampel pada
campuran jamu BKO dan kadar uji Parasetamol
berdasarkan hasil pengukuran
Jawab :
- Sampel 1
y = 5,1794x + 3301,7
5076,5 = 5,1794x + 3301,7
5,1794x = 5076,5 – 3301,7

26
 x = 342,6652 ng/2μL
Maka kadar Parasetamol dalam penotolan 2 μL sampel adalah
342,6652 ng
- Sampel 2
y = 5,1794x + 3301,7
5292,9 = 5,1794x + 3301,7
5,1794x = 5292,9 – 3301,7
x = -384,4461 ng/2μL
Maka kadar Parasetamol dalam penotolan 2 μL sampel adalah
384,4461 ng.
- Sampel 3
y = 5,1794x + 3301,7
5394,6 = 5,1794x + 3301,7
5,1794x = 5394,6 – 3301,7
x = -404,0816 ng/2μL
Maka kadar Parasetamol dalam penotolan 2 μL sampel adalah -
404,816 ng.
7.1.6. Persen Recovery Sampel Parasetamol
Persen perolehan kembali Parasetamol dalam sediaan jamu BKO
dihitung dengan menggunakan rumus berikut.
Kadar Parasetamol hasil pengukuran
% Recovery = ×100%
Kadar Parasetamol sebenarnya

- Sampel 1
342,6652 ng
%Recovery = ×100%
671,14 ng

= 50,05718 %
- Sampel 2
384,4461 ng
%Recovery = ×100%
671,14 ng

=57,28255%

- Sampel 3
404,0816 ng
%Recovery = ×100%
671,14 ng

27
 = 60,20824%
Persen Perolehan Kembali rata-rata Sampel adalah
51,05718 + 57,28255 + 60,20824
% Recovery =( )%
3

= 56,18265 %
7.1.7. Standar Deviasi (SD) dan Standar Deviasi Relatif (RSD)

- Kadar Rata-rata Paracetamol dalam Sediaan Jamu BKO

342,6652ng+ 384,4461 ng + 404,0816ng
Kadar rata-rata = ( ) ng
3

= 377,0643 ng
- Standar Deviasi
ngrata-rata x- x
Sampel ng(x) (x- x )2
(x)
1 342,6652 377,0643 -34,3991 1183,298
2 384,4461 377,0643 7,381807 54,49108
3 404,0816 377,0643 27,01729 729,9338
∑(x- x )2 = 1967,723

∑(x-x̅ )2
SD = √ n-1

1967,723
=√ 2

= 31,36656
- Standar Deviasi Relatif
SD
RSD = Kadar rata-rata ×100%
31,36656
= 377,0643 ×100%

= 8,318625 %
7.1.8 LOD & LOQ Parasetamol
- Penentuan AUC Standar berdasarkan Persamaan Regresi
Linier
Diketahui : standar I = 200 ng
standar III = 600 ng
standar V = 1000 ng

28
 persamaan regresi linier :y = 5,1794x + 3301,7
Ditanya : y” =.......?
Jawab :
I: y = 5,1794x + 3301,7
y” = 5,1794(200) + 3301,7
y” = 4337,58
III: y = 5,1794x + 3301,7
y” = 5,1794(600) + 3301,7
y” = 6409,34
V: y = 5,1794x + 3301,7
y” = 5,1794(1000) + 3301,7
y” = 8481,1
- Penentuan Simpangan Baku Residual
C (ng) Y y” y-y” (y-y”)2
200 4335,4 4337,58 -2,18 4,7524
800 6413,7 6409,34 4,36 19,0096
1000 8478,9 8481,1 -2,2 4,84
Σ (y-y”)2 28,602

Sy
Nilai Simpangan Baku Residual ( x ) = .........?
Jawab :

 y  y' '
2
Sy
=
x n2
Sy 28,602
=
x 3 2
Sy
x = ± 5,348084

- Penentuan nilai LOD dan LOQ

Sy
Diketahui :` x = 5,348084

29
 Dari persamaan y = 5,1794x + 3301,7; maka
diketahui b = 5,1794
Ditanya : LOD dan LOQ = ......?
Jawab :
Sy
3
 LOD = x
Slope (b)

3 5,348084
LOD =
5,1794
LOD = 3,097705 ng
Sy
10 
 LOQ = x
Slope (b)

10  5,348084
LOQ =
5,1794
LOQ = 10,32568 ng
7.2 Natrium Diklofenak
7.2.1 Kurva Kalibrasi dan Persamaan Regresi Linier Natrium
Diklofenak
Diketahui:
Konsentrasi (ng) AUC
200 ng 1754,5
400 ng 2706,2
600 ng 3588,9
800 ng 4411,2
1000 ng 5244,5

Diambil 3 data yang linier yaitu:

Konsentrasi (ng) AUC
600 ng 3588,9
800 ng 4411,2
1000 ng 5244,5

30
 Ditanya : kurva kalibrasi dan persamaan regresi linier
Jawab :
Berdasarkan 3 data linier yang digunakan dalam penentuan kurva
kalibrasi dan persamaan regresi linier, maka diperoleh kurva
kalibrasi Natrium diklofenak sebagai berikut.

Kurva Kalibrasi Natrium Diklofenak

6000
y = 4.139x + 1103.7
5000
R² = 1
4000
AUC

3000
Na-DiC
2000
Linear (Na-DiC)
1000

0
0 500 1000 1500
Konsentrasi (ng)

Persamaan regresi linier yang diperoleh adalah sebagai berikut.

y = 4,139x + 1103,7dengan nilai R2 = 1
7.2.2 Penetapan Kadar Natrium Diklofenak dalam Uji
Diketahui:
Persamaan regresi linier Natrium Diklofenak: y = 4,139x +
1103,7 AUC Uji :
- Uji 1 : 589,9
- Uji 2 : 778,9
- Uji 3 : 778,9
Ditanya : Kadar Natrium Diklofenak pada masing-masing Uji
Jawab :
- Uji 1
y = 4,139x + 1103,7
589,9 = 4,139x + 1103,7
x = -124,136 ng/2μL
- Uji 2
y = 4,139x + 1103,7

31
 778,9 = 4,139x + 1103,7
x = -78,4731 ng/2μL
- Uji 3
y = 4,139x + 1103,7
778,9 = 4,139x + 1103,7
x = -78,4731 ng/2μL
7.2.3 Persen Recovery Uji Natrium Diklofenak
Persen perolehan kembali Natrium Diklofenak dalam sediaan
jamu BKO dihitung dengan menggunakan rumus berikut.
Kadar Na Di-C hasil pengukuran
% Recovery = ×100%
Kadar Na Di-C sebenarnya

- Uji 1
-124,136 ng
%Recovery = ×100%
300 ng

= -41,3788%
- Uji 2
-26,1577 ng
%Recovery = ×100%
300 ng

= -26,1577%
- Uji 3
-26,1577 ng
%Recovery = ×100%
300 ng

= -26,1577%

Persen Perolehan Kembali rata-rata Uji adalah

-41,3788 + -26,1577 + -26,1577
% Recovery =( )%
3

= -31,2314 %
7.2.4 Standar Deviasi (SD) dan Standar Deviasi Relatif (RSD)
- Kadar Rata-rata UjiNatrium Diklofenak
-124,136 + -78,4731 + -78,4731
Kadar rata-rata = ( ) ng
3

= -93,6941 ng
- StandarDeviasi
Sampel ng(x) ngrata-rata ( x ) x- x (x- x )2

32
 1 -124,136 -93,6941 -30,4421 926,7236
2 -78,4731 -93,6941 15,22107 231,6809
3 -78,4731 -93,6941 15,22107 231,6809

∑(x- x )2 = 1390,085

∑(x-x̅ )2
SD = √ n-1

1390,085
=√ 2

= ±26,36366
- Standar Deviasi Relatif
SD
RSD = Kadar rata-rata ×100%
26,36366
= ×100%
-93,6941

= -28,138%
7.2.5. Penetapan Kadar Natrium Diklofenak dalam Sampel
Diketahui:
Persamaan regresi linier Natrium Diklofenak: y = 4,139x +
1103,7
AUC sampel :

- Sampel 1 : 20150,2
- Sampel 2 : 19336
- Sampel 3 : 20070,7
Ditanya : kadar Natrium Diklofenak pada masing-masing
sampel pada campuran jamu BKO
Jawab :

- Sampel 1
y = 4,139x + 1103,7
20150,2 = 4,139x + 1103,7
4,139x = 20150,2 – 1103,7
x = 4601,715 ng/2μL

33
 Maka kadar Natrium Diklofenak dalam penotolan 2 μL sampel
adalah 4601,715 ng
- Sampel 2
y = 4,139x + 1103,7
19336 = 4,139x + 1103,7
4,139x = 19336 – 1103,7
x = 4405,001 ng/2μL
Maka kadar Natrium Diklofenak dalam penotolan 2 μL sampel
adalah 4405,001 ng.
- Sampel 3
y = 4,139x + 1103,7
20070,7 = 4,139x + 1103,7
4,139x = 20070,7 – 1103,7
x = 4582,508 ng/2μL
Maka kadar Natrium Diklofenak dalam penotolan 2 μL sampel
adalah 4582,508 ng.
7.2.6. Persen Recovery Sampel Natrium Diklofenak
Persen perolehan kembali Natrium Diklofenak dalam sediaan
jamu BKO dihitung dengan menggunakan rumus berikut.
Kadar Na Di-C hasil pengukuran
% Recovery = ×100%
Kadar Na Di-C sebenarnya

- Sampel 1
4601,715 ng
%Recovery = ×100%
536,912 ng

= 857,0707 %
- Sampel 2
4405,001 ng
%Recovery = ×100%
536,912 ng

= 820,4326%
- Sampel 3
4582,508 ng
%Recovery = ×100%
536,912 ng

= 853,4933%
Persen Perolehan Kembali rata-rata Sampel adalah

34
 857,0707 + 820,4326 + 853,4933
% Recovery =( )%
3

= 843,6655 %
7.2.7. StandarDeviasi (SD) danStandar Deviasi Relatif (RSD)

- Kadar Rata-rata Natrium Diklofenak dalam Sediaan Jamu

BKO
4601,715ng+ 4601,715 ng + 4582,508ng
Kadar rata-rata = ( ) ng
3

= 4529,741 ng
- StandarDeviasi
ngrata-rata x- x
Sampel ng(x) (x- x )2
(x)
1 4601,715 4529,741 71,97391 5180,243
2 4405,001 4529,741 -124,74 15560,14
3 4582,508 4529,741 52,76637 2784,29
∑(x- x )2 = 23524,67

∑(x-x̅ )2
SD = √ n-1

23524,67
=√ 2

= 108,4543
- StandarDeviasiRelatif
SD
RSD = Kadar rata-rata ×100%
108,4543
= 4529,741 ×100%

= 2,394271 %

7.2.8. LOD & LOQ Natrium Diklofenak

- Penentuan AUC Standar berdasarkan Persamaan Regresi
Linier
Diketahui : standar III = 600 ng
standar IV = 800 ng

35
 standar V = 1000 ng
persamaan regresi linier : y = 4,139x + 1103,7
Ditanya : y” =.......?
Jawab :
III : y = 4,139x + 1103,7
y” = 4,139(600) + 1103,7
y” = 3587,1
IV: y = 4,139x + 1103,7
y” = 4,139(800) + 1103,7
y” = 4414,9
V: y = 4,139x + 1103,7
y” = 4,139(1000) + 1103,7
y” = 5242,7
- PenentuanSimpangan Baku Residual
C (ng) Y y” y-y” (y-y”)2
600 4601,715 3587,1 1014,615 1029444
800 4405,001 4414,9 -9,89879 97,98608
1000 4529,741 5242,7 -660,192 435853,7
Σ (y-y”)2 1465396

Sy
Nilai Simpangan Baku Residual ( x ) = .........?
Jawab :

 y  y' '
2
Sy
=
x n2
Sy 1.465.396
=
x 32
Sy
x = ± 1210,535

- Penentuan nilai LOD dan LOQ

Sy
Diketahui :` x = 1210,535

36
 Dari persamaan y = 4,139x + 1103,7; maka
diketahui b = 4,139
Ditanya : LOD dan LOQ = ......?
Jawab :
Sy
3
 LOD = x
Slope (b)

3 1210,535
LOD =
4,139
LOD = 877,4115 ng
Sy
10 
 LOQ = x
Slope (b)

10  1210,535
LOQ =
4,139
LOQ = 2924,705 ng
VIII. PEMBAHASAN
Jamu merupakan obat tradisional yang mengandung bahan atau ramuan
bahan berupa bahan tumbuhan, hewan, mineral, sediaan sarian (galenik), atau
campuran dari bahan tersebut yang secara turun temurun telah digunakan untuk
pengobatan berdasarkan pengalaman. Sesuai dengan peraturan perundang-
undangan yang berlaku, obat tradisional dilarang mengandung bahan kimia hasil
isolasi atau sintetik berkhasiat obat atau BKO (Bahan Kimia Obat), narkotika atau
psikotropika, serta hewan atau tumbuhan yang dilindungi (Yulianti, 2009).
Namun, sampai saat ini BPOM masih menemukan beberapa produk obat
tradisional yang masih mengandung BKO. Sehingga perlu dilakukan kualiti
kontrol terhadap jamu yang beredar dimasyarakat.
Pada praktikum kali ini dilakukan penetapan kadar Parasetamol dan
Natrium Diklofenak dalam sediaan jamu. Hal ini karena di pasaran jamu yang
beredar sebagian besar merupakan jamu pegal linu. Dimana parasetamol memiliki
efek sebagai antipiretik dan analgesik serta natrium diklofenak berefek sebagai
terapi non-steroid agen antiinflamasi yang serupa dengan efek dari jamu pegal
linu.

37
 Penetapan kadar parasetamol dan natrium diklofenak dilakukan dengan
metode KLT-Spektrofotodensitometrik. Jamu yang mengandung banyak
komponen akan dipisahkan dengan KLT sehingga akan menghasilkan spot yang
berbeda-beda sesuai dengan sifat fisika kimia dari komponen tersebut. Hasil
pemisahan berupa spot tersebut yang kemudian berinteraksi dengan REM pada
saat discanning dengan spektrofotodensitometer yang menghasilkan nilai AUC.
Dalam penetapan kadar parasetamol dan natrium diklofenak dilakukan
dengan menggunakan beberapa larutan, yaitu larutan stok parasetamol dan
natrium diklofenak, larutan seri, larutan uji, dan larutan sampel. Larutan stok
dibuat untuk memudahkan pemipetan pada saat membuat larutan seri dan larutan
uji. Larutan seri dibuat untuk menghitung persamaan regresi linear yang nantinya
akan digunakan untuk penetapan kadar. Larutan uji dibuat sebagai validasi
metode. Dan larutan sampel akan digunakan untuk analisis adanya BKO
parasetamol dan natrium diklofenak dalam jamu.
Pembuatan larutan stok parasetamol dan natrium diklofenak masing-
masing dibuat dengan konsentrasi 1mg/mL sebanyak 25 mL. Pembuatan larutan
stok ini dilakukan dengan melarutkan serbuk baku dengan pelarut metanol.
Pemilihan metanol sebagai pelarut karena metanol merupakan pelarut universal
yang dapat melarutkan zat polar, semi polar, maupun non polar. Kelebihan
lainnya penggunaan metanol sebagai pelarut yaitu lebih stabil dibandingkan air
dalam penyimpanan cukup lama karena metanol bukan media pertumbuhan
mikroba.
Selanjutnya dibuat larutan seri yang mengandung parasetamol dan natrium
diklofenak dengan konsentrasi yang bervariasi. Dalam pembuatan larutan seri
untuk penentuan linieritas minimal dibuat 3 seri dengan konsentrasi 5-% - 150%
dari kadar analit dalam sampel (Harmita, 2004). Adapun konsentrasi parasetamol
dan natrium diklofenak dalam seri yang dibuat pada praktikum ini adalah 100
ng/µL, 200 ng/µL, 300 ng/µL, 400 ng/µL, dan 500 ng/µL. Larutan seri ini dibuat
dengan memipet larutan stok sesuai dengan konsentrasi yang dibuat dan
diencerkan dengan metanol.
Hal yang paling penting yaitu penyiapan larutan sampel. Larutan sampel
disiapkan dengan metode penambahan baku (standard addition method), yaitu

38
penambahan tablet parasetamol dan tablet natrium diklofenak yang telah digerus
ke dalam sediaan jamu. Pada metode adisi, kadar analit dalam sampel tidak
diketahui. Dalam pembuatan larutan sampel dilakukan dengan cara mencampur
7000 mg serbuk jamu, serbuk parasetamol setara dengan 250 mg, dan serbuk
natrium diklofenak setara dengan 200 mg. Kemudian campuran tersebut diambil
sebanyak 500 mg lalu ditambahkan metanol. Penambahan metanol ini berfungsi
sebagai pelarut. Metanol dapat melarutkan senyawa parasetamol dan natrium
diklofenak dalam campuran serbuk. Proses sonikasi dilakukan untuk
meningkatkan kelarutan analit dalam metanol. Sedangkan sentrifugasi dilakukan
untuk memisahkan komponen analit berdasarkan berat molekulnya, dimana berat
molekul yang besar akan tertarik menuju titik sentrifus. Hal ini akan memudahkan
dalam proses pemisahan senyawa-senyawa yang larut dalam metanol dan yang
tidak larut pada saat penyaringan. Filtrat sebanyak 1 mL diencerkan hingga 5 mL
untuk ditotolkan pada plat KLT. Larutan sampel dibuat sebanyak 3 larutan,
dimana larutan pertama berfungsi sebagai kontrol, larutan kedua berfungsi sebagai
pembanding, dan larutan ketiga berfungsi sebagai pengoreksi.
Setelah dibuat larutan sampel, selanjutnya dibuat larutan uji. Konsentrasi
parasetamol dan natrium diklofenak dalam larutan uji yang dibuat yaitu
mengandung 335,57 ng parasetamol dalam 1 µL pelarut dan 268,456 ng dalam 1
µL pelarut. Larutan uji ini dibuat sebanyak 3 larutan, dimana akan digunakan
untuk validasi metode presisi. Pembuatan larutan uji dilakukan dengan cara
menambahkan 1,7 mL larutan stok parasetamol dan 1,3 mL larutan stok natrium
diklofenak ke dalam 500 mg jamu. Larutan tersebut disonikasi dan disentrifugasi,
kemudian diambil 1 mL dan diencerkan dengan metanol hingga 5 mL.
Setelah penyiapan larutan, dilakukan proses pemisahan dengan KLT. Plat
yang digunakan yaitu plat Al silika gel GF254 yang dipotong dengan ukuran 18 cm
x 10 cm. Dimana jumlah larutan yang ditotolkan yaitu sebanyak 17 larutan (5
larutan seri, 3 larutan uji kelompok III, 3 larutan sampel kelompok III, 3 larutan
uji kelompok IV, dan 3 larutan uji kelompok IV). Plat KLT yang digunakan
dicuci dengan metanol dengan tujuan membersihkan plat dari pengotor-pengotor
yang dapat menganggu proses pemisahan. Kelebihan metanol dibandingkan
etanol yaitu lebih cepat menguap. Setelah pencucian, plat diaktivasi pada suhu

39
1100C selama 10 menit untuk menghilangkan sisa air dan metanol pada plat dan
mengaktifkan sisi plat yang semula tidak aktif karena mengikat air dan metanol.
Plat yang telah siap, ditotolkan dengan larutan seri, uji, dan sampel
masing-masing 2 µL dengan jark antar totolan yaitu 1 cm, jarak tepi kiri, kanan,
atas, dan bawah 1 cm. Adanya jarak antar totolan ini bertujuan agar tidak terjadi
penumpukan atau pencampuran spot satu dengan yang lain yang menganggu
proses pemisahan. Kemudian dilakukan proses elusi dengan menggunakan fase
gerak toluena : etil asetat : asam asetata (6,5 : 3,5 : 0,02 v/v/v) hingga jarak
pengembangan 8 cm.
Setelah proses elusi, selanjutnya dilakukan scanning dengan
spektrofotodensitometer. Scanning plat KLT dengan spektrofotodensitometer
dilakukan pada panjang gelombang optimum. Dimana pada panjang gelombang
tersebut, kedua senyawa yang dianalisis dapat memberikan serapan dan apabila
discan ulang akan memenuhi reprodusibel keterulangan. Cara pemilihan panjang
gelombang optimum yaitu dengan menscann plat KLT pada rentang panjang
gelombang 200 nm – 400 nm, dimana panjang gelombang maksimum
parasetamol (245 nm) dan natrium diklofenak (273 nm) berada dalam rentang
tersebut. Spektrum hasil scanning parasetamol dan natrium diklofenak kemudian
ditumpukkan. Berikut ini hasil scanning parasetamol dan natrium diklofenak :

Dari kedua spektrum tersebut dapat dilihat berpotongan pada panjang

gelombang 263 nm. Sehingga digunakan panjang gelombang 263 nm sebagai
panjang gelombang optimum. Hasil scanning pada panjang gelombang 263 nm,
diperoleh data sebagai berikut :
No Larutan Rf AUC Senyawa

40
 1 Seri I 0,13 1754,5 Natrium Diklofenak
0,46 4335,4 Parasetamol
2 Seri II 0,12 2706,2 Natrium Diklofenaklofenak
0,45 5539,5 Parasetamol
3 Seri III 0,12 3588.9 Natrium Diklofenaklofenak
0,44 6413.7 Parasetamol
4 Seri IV 0,12 4411.2 Natrium Diklofenaklofenak
0,45 7924.1 Parasetamol
5 Seri V 0,12 5244,5 Natrium Diklofenak
0,45 8478,9 Parasetamol
6 Uji I 0,12 589,9 Natrium Diklofenak
0,42 469,3 Parasetamol
7 Uji II 0,11 604,7 Natrium Diklofenak
0,41 499,5 Parasetamol
8 Uji III 0,11 778,9 Natrium Diklofenak
0,42 887,2 Parasetamol
9 Sampel I 0,12 20150,2 Natrium Diklofenak
0,43 5076,5 Parasetamol
10 Sampel II 0,12 19336,0 Natrium Diklofenak
0,44 5292,9 Parasetamol
11 Sampel III 0,11 20070,7 Natrium Diklofenak
0,44 5394,6 Parasetamol

Dari kelima seri tersebut digunakan seri I, III, dan V unuk menghitung
persamaan regresi larutan parasetamol karena memiliki nilai R2 = 1 dengan
persamaan regresinya y = 5.179x + 3301,708. Sedangkan untuk nattrium
diklofenak digunakan seri III, IV, dan V untuk menghitung persamaan regresi
karena memiliki nilai R2 = 1 dengan persamaan regresinya y=4,139x + 1103,667.
Berikuti ini kurva regresi parasetamol dan natrium diklofenak:

41
 Parasetamol Natrium Diklofenak
10000 6000
AUC 4000

AUC
5000
2000
0 0
0 500 1000 1500 0 500 1000 1500
Kadar (C) Kadar (C)

Gambar 8.1. Kurva regresi parasetamol dan natrium diklofenak.

Dari persamaan regresi tersebut dilakukan validasi metode yaitu akurasi,
presisi, LOD, dan LOQ. Akurasi dinyatakan dengan % recovery. Nilai perolehan
kembali parasetamol untuk uji I, II, III berturut-turut -68,36%; -67,63%; -58,27%
dengan rata-rata -64,755. Sedangkan perolehan kembali natrium diklofenak
berturut-turut -20,688%; -20,092%; -13,076% dengan rata-rata -17,953%. Dari
nilai perolehan kembali tersebut, dapat dikatakan bahwa metode yang digunakan
dan hasil yang diperoleh kurang valid karena tidak memenuhi syarat yaitu bernilai
negatif.
Validasi metode yang kedua yaitu presisi yang dinyatakan dengan nilai
RSD. RSD untuk parasetamol yaitu 8,31 % dan natrium diklofenak yaitu 2,4 %.
Baik nilai RSD parasetamol maupun natrium diklofenak tidak memenuhi
persyaratan. Dimana persyaratan nilai RSD berkisar antara 1-2% (Gandjar dan
Rohman, 2007).
Selain akurasi dan presisi, nilai LOD dan LOQ juga dihitung. Nilai LOD
untuk parasetamol 3,104 ng dan natrium diklofenak 3,25 ng. Apabila kadar
senyawa parasetamol dan natrium diklofenak berada di bawah nilai LOD maka
senyawa tersebut tidak dapat dideteksi dengan metode yang dilakukan pada
praktikum ini. Nilai LOQ parasetamol diperoleh sebesar 10,35 ng dan natrium
diklofenak 10,84 ng. Nilai LOD dan LOQ kedua senyawa berada di bawah jumlah
kadar senyawa yang ditotolkan.
Selanjutnya penghitungan kadar larutan sampel. Diperoleh kadar
parasetamol dalam sampel I, II, dan III secara berturut-turut 171,345 ng/µL;
192,23 ng/µL; dan 202, 055 ng/µL. Kadar natrium diklofenak dalam sampel yaitu
secara berturut-turut 2300,86 ng/µL; 2202,504 ng/µL; 2291,197 ng/µL. Kadar

42
parasetamol yang diperoleh jauh berada di bawah dari kadar penambahan
parasetamol. Hal ini dapat disebabkan karena metode yang digunakan tidak
memenuhi syarat validasi metode. Selain itu ladar parasetamol yang berada jauh
di bawah kadar yang ditambahkan dapat disebabkan karena proses preparasi
sampel yaitu kemungkinan parasetamol tidak seluruhnya terlarut.
IX. KESIMPULAN
Diperoleh kadar parasetamol dalam sampel I, II, dan III secara berturut-
turut 171,345 ng/µL; 192,23 ng/µL; dan 202,055 ng/µL. Kadar natrium
diklofenak dalam sampel yaitu secara berturut-turut 2300,86 ng/µL; 2202,504
ng/µL; 2291,197 ng/µL.

43
 DAFTAR PUSTAKA
Depkes RI. 1979. Farmakope Indonesia Edisi III.Jakarta: Departemen Kesehatan
Republik Indonesia.

Gandjar, I. G. dan A. Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:

Pustaka Pelajar.

Gandjar, I.G. dan A. Rohman. 2012. Analisis Obat secara Spektrofotometri dan
Kromatografi. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.

Kulkarni M. B., Pratibha B. D., and Sanjay G. W. 2012. Stability Indicating Thin-
layer Chromatographic Determination of Chlorzoxazone, Diclofenac
Sodium and Paracetamol as Bulk Drug: Application to Forced
Degradation Study. Der Pharmacia Sinica 3(6): 643-652.

Moffat, C. A., M. D. Osselton, dan B. Widdop. 2005. Clarke’s Analysis of Drugs

and Poisons. Great Britain: Pharmaceutical Press.

Settel, F. 1997. Handbook of Instrumental Techniques for Analytical

Chemistry.New Jersey : Prentice Hall PTR.
Sherma, J. and B. Fried. 1996. Handbook of Thin-Layer Chromatography 3rd
edition. New York: Marcel Dekker Inc.

Stahl, E. 1985. Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi.Bandung:

Penerbit ITB.
Sukmawati, A. dan Suprapto. 2010. Efek Berbagai Peningkat Penetrasi Terhadap
Penetrasi Perkutan Gel Natrium Diklofenak secara In Vitro. Jurnal
Penelitian Sains & Teknologi 11(2): 117-125.
Yulianti, N. 2009. Sehat, Cantik, Bugar dengan Herbal dan Obat Tradisional.
Yogyakarta: C. V. Andi.

44
 LAMPIRAN

Gambar 1. Hasil scan pada 254 nm

Gambar 2. Hasil scan pada 366 nm

Gambar 3. Kromatogram untuk menentukan panjang gelombang yang

berpotongan dari Parasetamol dan Natrium Diklofenak.

45