Tugas Bioteknologi

Macam – macam Seleksi

Oleh : Marvi Nurjanah (0906639335)

Dalam proses rekayasa genetika, ada beberapa tahapan yang harus dilalui. Salah satu
produk dari rekaya genetika yaitu kloning gen, yang merupakan hasil dari teknologi DNA
Rekombinan. Tahapan-tahapan yang harus dilalui dalam melakukan cloning gen, yaitu isolasi
DNA, kemudian dilanjutkan dengan pemotongan DNA, dan penyambungan DNA. Setelah itu,
dilakukan transformasi, yaitu proses pengambilan DNA rekombinan oleh E.coli dengan cara
mengintroduksi DNA murni ke dalam sel yang sudah kompeten. Tahap selanjutnya yaitu
seleksi,dimana E.coli (plasmid DNA rekombinan) diseleksi terhadap E.coli yang tidak membawa
rekombinan.
Terdapat empat macam teknik seleksi yang umum dilakukan, yaitu teknik replica plating,
seleksi warna koloni, komplementasi, dan analisa hibridisasi. Namun, hanya akan dibahas tiga
teknik seleksi pada tugas ini.
a. Teknik Replica Plating
Replica plating adalah suatu teknik dengan menggunakan satu atau lebih cawan petri
sekunder mengandung media pertumbuhan selektif yang berbeda (tanpa nutrisi atau berisi
inhibitor pertumbuhan seperti antibiotik) diinokulasikan dengan koloni mikroorganisme yang
sama dari suatu plat primer, menghasilkan pola koloni yang sama dengan induknya.
Tujuan dari teknik cawan replika yaitu untuk dapat membandingkan plat master dan plat
sekunder lain khususnya untuk skrining fenotip tertentu. Sebagai contoh, ketika sebuah koloni
terdapat dalam plat primer, dan tidak muncul pada plat sekunder, menunjukkan bahwa koloni
tersebut sensitif terhadap material tertentu yang terdapat di plat sekunder. Skrining fenotip yang
biasa dilakukan meliputi auxotrophy dan resistensi antibiotik.
Cawan replika sangat berguna untuk seleksi negatif. Sebagai contoh, jika seseorang ingin
memilih koloni yang sensitif terhadap ampicillin, plat primer harus di replika ke dalam plat agar
Amp+ sekunder. Koloni yang sensitif pada plat sekunder akan mati tapi koloni masih bisa
disimpulkan dari plat primer karena keduanya memiliki pola yang sama dari koloni yang resisten
ampicillin. Koloni yang sensitif kemudian dapat diambil dari plat.
 Dengan meningkatkan variasi pada plat sekunder dengan media pertumbuhan selektif
yang berbeda dapat menskrining secara cepat koloni yang diisolasi secara individu sebanyak
fenotip yang terdapat di plat sekunder.

Gambar 1. Teknik Replica Plating

b. Seleksi Warna Koloni

Seleksi warna koloni disebut juga dengan seleksi biru-putih, dimana nantinya koloni
bakteri yang didapatkan akan terdiri dari dua warna, yaitu koloni biru dan putih. Koloni putih
merupakan koloni yang diperkirakan mengandung fragmen gen sisipan (gen stilbena sintase)
sedangkan koloni biru diperkirakan merupakan koloni yang tidak mengandung fragmen gen
sisipan. Terbentuknya koloni putih biru ini disebabkan adanya marka seleksi pada vektor pGEM-
T Easy. Marka seleksi biasanya berupa gen yang membawa sifat resistensi terhadap antibiotik
tertentu. Vektor pGEM-T Easy memiliki marka seleksi berupa gen resistensi ampisilin dan
marka seleksi tambahan berupa gen Lac Z. Gen pembawa sifat resistensi terhadap ampisilin ini
menyandi enzim -Laktamase. Enzim -Laktamase akan mendegradasi ampisilin sehingga ketika
sel pembawa plasmid rekombinan ditumbuhkan dalam media yang mengandung ampisilin, maka
sel tersebut akan tumbuh sementara sel yang tidak membawa plasmid rekombinan akan mati.
Gen Lac Z menyandi enzim Galaktosidase. Enzim ini akan menghidrolisis X-Gal yang
ditambahkan pada media seleksi menjadi galaktosida dan senyawa turunannya yaitu 5-bromo-4-
kloro indoksil yang berwarna biru. Ketika terdapat fragmen gen sisipan pada plasmid maka
sintesis peptida yang berperan sebagai aktivator terhadap kerja enzim galaktosidase akan
terhambat sehingga warna biru tidak terbentuk. Seleksi transforman melalui pengamatan warna
koloni yang terbentuk tidak selalu sesuai dengan teori. Artinya bahwa tidak semua koloni
berwarna putih pasti membawa fragmen gen sisipan dan sebaliknya belum tentu semua koloni
berwarna biru merupakan koloni yang tidak membawa fragmen gen sisipan. Hal tersebut dapat
disebabkan oleh karakteristik dari fragmen gen hasil PCR yang diklon ke dalam pGEM-T Easy.
Sebagai contoh, koloni biru dapat dihasilkan dari produk PCR yang diklon pada frame yang
sama dengan gen LacZ. Produk PCR tersebut biasanya memiliki tiga basa sama yang berulang
pada beberapa bagian fragmen, termasuk memiliki basa adenin yang berulang pada bagian
ujungnya. Produk PCR yang demikian tidak memiliki kodon stop pada bagian fragmennya
sehingga akan ditranslasi bersamaan dengan gen LacZ dan menghasilkan koloni berwarna biru.
Koloni sel yang terbentuk pada media seleksi selanjutnya diambil beberapa untuk diamplifikasi
dengan teknik PCR koloni dan dikonfirmasi dengan elektroforesis gel agarosa. Tujuan utama
dari PCR koloni adalah untuk mengkonfirmasi koloni transforman yang membawa fragmen gen
sisipan dan menghindari kesalahan dari pengamatan warna koloni.

Gambar 2. Seleksi Warna Koloni ( Biru-putih )

c. Komplementasi

Galur E. coli DH5α merupakan salah satu galur E. coli yang banyak digunakan dalam
teknologi rekombinasi DNA. Beberapa gen pada galur E. coli ini sudah mengalami mutasi dari
galur aslinya sehingga menguntungkan bila dipakai sebagai inang pada rekombinasi DNA. Gen
yang dimanfaatkan untuk menseleksi klon rekombinan yang diintroduksikan ke dalam sel inang
E. coli DH5α adalah gen lacZ∆M15. Gen ini merupakan produk mutasi dari gen lacZ. Protein
ß-galaktosidase merupakan produk dari gen lacZ yang terdiri atas subunit α dan subunit ω. Gen
lacZ∆M15 hanya menghasilkan subunit ω. Jika plasmid yang membawa gen yang dapat
menghasilkan subunit α dari protein ß-galaktosidase dimasukkan ke dalam galur E. coli ini, maka
akan terbentuk protein ß-galaktosidase yang memiliki aktivitas menguraikan senyawa X-gal (5-
bromo-4-kloro-3-indolil-ß-D-galaktosida) menjadi senyawa 5-bromo-4-kloro-3 indolil yang
berwarna biru dan D-galaktosa.
Keberadaan gen lacZ∆M15 pada E. coli galur ini dapat dimanfaatkan untuk menyeleksi
koloni yang membawa dan yang tidak membawa plasmid rekombinan. DNA akan disisipkan di
Multiple Cloning Site (MCS) yang merupakan bagian dari gen lacZ pada plasmid. Jika plasmid
tidak tersisipi maka subunit α dapat dihasilkan sehingga dapat bergabung dengan subunit ω yang
dihasilkan inang. Gabungan kedua subunit protein tersebut akan menghasilkan protein ß-
galaktosidase aktif yang dapat menghasilkan koloni berwarna biru jika terdapat senyawa X-gal
pada media, tetapi jika plasmid tersisipi maka subunit α tidak akan dihasilkan sehingga walaupun
terdapat senyawa X-gal pada media tumbuhnya koloni tetap akan berwarna putih.

Gambar 3. Komplementasi
 Referensi

Lilis, Embi. 2009. Konstruksi DNA Rekombinan Pcambia 1303-Stilbena Sintase Pencegah Busuk
Akar Kelapa Sawit. Bogor : Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor.

Millar,Neil. 2000. Module 2 : Gene and Genetic Engineering.

http://www.mrothery.co.uk/module2/mod2trimmednotes.htm, diunduh pada 26 Februari
2012, pukul 20.05 WIB

Satria, Heri. 2009. Studi Penggunaan Indikator X-Gal Dalam Kloning Gen Pada Escherichia Coli
DH5α (Study Of X-Gal Indicator Uses On Gene Cloning In Escherichia Coli DH5α).
Lampung : FMIPA Universitas Lampung.