Praktikum Genetika (Modul 7 dan 8) – 2019
Amplifikasi Daerah ITS 2 dari DNA Genom Tanaman Fabaceae
Imaduddien Raihan Budiyanto (10618053)
 Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung
Jalan Ganesha 10, Bandung 40132 Indonesia
e-mail: raihan.b@itb.ac.id
Abstrak
Penurunan sifat adalah suatu bidang dalam Biologi yang
telah diobservasi dan dipelajari sejak zaman dahulu.
Gagasan-gagasan mengenai hereditas secara mendasar
dicetuskan oleh Gregor Johann Mendel (1822 -1884)
melalui percobaan persilangan kacang ercisnya. Ia
mencetuskan dua gagasan yaitu Hukum I Mendel yang
menyatakan segregasi dan dominansi alel pada suatu gen.
Kemudian Hukum II Mendel yang berbicara tentang
asortasi bebas. Pengujian hasil persilangan dapat dilakukan
dengan metode analisis statistika chi-square. Dengan chi-
square dapat ditentukan apakah suatu hipotesis mengenai
kesesuaian hasil observasi dengan Hukum Mendel dapat
ditolak atau tidak ditolak. Pada praktikum ini digunakan
mutan ebony dan miniatur dan terdapat faktor sex-linkage.
Perlu ditekankan pentingnya menggunakan lalat virgin dan
morgue untuk akurasi persilangan dan protokol biosafety.
Lalu dari modul ini diperoleh hasil perbandingan F2
72:1:4:18, chi-square test 83,51 dengan α= 0,05 sehingga
tidak terjadi kesesuaian dengan Hukum II Mendel.
Kata kunci
Fabaceae, DNA genom, DNA barcoding, ITS2, PCR
Pendahuluan
DNA barcoding pada tanaman Fabaceae ini dilakukan
untuk menunjang pengembangannya di bidang
industry terutama obat-obatan Fabaceae merupakan
famili tumbuhan obat-obatan terbesar ke dua yang di
dalamnya terdapat 490 spesies tanaman obat-
obatan[1]. Secara umum terdapat beberapa spesies
yang sering digunakan sebagai obat-obatan, tetapi
adulterant-nya juga ikut tercampur (zat tambahan
yang tidak aman) seperti Astragalus membranaceus
dan Astragalys mongolicus. Kemudian, tanaman yang
seringkali tertukar seperti Hedysarum polybotrys dan
radix astragali[2]. Adapula beberapa spesies tanaman
yang berbeda, tetapi diperdagangkan dengan nama
yang sama[3]. Oleh karena adanya kesulitan
identifikasi perbedaan spesies pada tanaman
Fabaceae, diperlukan suatu teknik yang dapat
memudahkan identifikasinya. Sebelumnya terdapat
metode tradisional seperti identifikasi berdasarkan
perbedaan karakteristik morfologi, tetapi masih
terlalu sukar begitu juga dengan pengenalan melalui
taksonomi [4],[5]. Jadi, identifikasi mungkin dapat lebih
1
Fia (10617)
jelas dilakukan pada tingkat molekuler seperti di
DNA, makanya disebut sebagai DNA barcoding.
Dalam identifikasi suatu organisme, dibutuhkan DNA
yang merupakan molekul materi genetik dari
organisme tersebut. Informasi untuk identifikasinya
dapat diperoleh dari DNA genomnya. Jadi, untuk
memperoleh DNA genomnya, perlu dilakukan isolasi
DNA genom[6]. Dalam mengisolasinya, perlu
dilakukan pemurnian agar diperoleh DNA murni yang
terbebas dari kontaminan makromolekul lainnya.
Dari hasil isolasi baru dapt dilakukan pembuatan
labkit ataupun analisis, misalnya identifikasi[7].
Terdapat beberapa DNA barcode seperti matK, rbcl,
psbA-trnH, ITS, atau rpoC1. Namun, tidak semua
barcode dapat digunakan untuk identifikasi, ada yang
terbatas hanya pada beberapa spesies[8]. Salah satu
DNA barcode yang menarik adalah ITS, secara khusus
ITS2. ITS1 masih dipertanyakan efektifivitas dan
kualitasnya primernya sebagai DNA barcode yang
universal[9]. Sedangkan ITS2 (Internal Transcribed
Spacer 2) relatif lebih mudah untuk diamplifikasi
dengan primernya yang cukup universal. Kemudian,
hasil amplifikasinya dapat memberikan data
taksonomi yang dapat dikaitkan dengan evolusi
sistematik[10],[11].
DNA barcoding tidak hanya bermanfaat untuk
identifikasi spesies, tetapi tindakan lanjutan yang
dapat dilakukan adalah inventarisasi data. Hal ini
akan menjadi dasar pengembangan database
tumbuhan secara global yang dapat dimanfaatkan
untuk riset, konservasi, dan pemanfaatan
biodiversitas tumbuhan yang ada[12].
Dengan demikian, pada praktikum ini akan dilakukan
isolasi DNA genom tumbuhan Fabaceae dengan
metode CTAB. Kemudian akan ditentukan
keberhasilan isolasi DNA genom tumbuhan tersebut
melalui elektroforesis gel agarosa. Setelah itu akan
diamplifikasi gen ITS 2 dari DNA genom tumbuhan
Fabaceae melalui PCR dengan primer spesifik ITS 2.
Kemudian juga akan ditentukan keberhasilan
amplifikasi ITS 2 tumbuhan Fabaceae melalui
elektroforesis gel agarosa.
Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati :::
2Praktikum Genetika (Modul 7 dan 8) – 2019
Materi dan Metode
1. Isolasi DNA Genom Tumbuhan Fabaceae
Alat dan Bahan
Pada modul isolasi DNA ini alat dan bahan yang
digunakan adalah mikropipet Eppendorf (putih,
kuning, biru), mortar dan pestle , termos logam,
spatula, rak microtube, microsentrifuge refrigerated,
freezer -20°C, ice box, sprayer alkohol, spidol marker,
waterbath, pelampung microtube, nanodrop
spectrophotometer, set elektroforesis agarosa, tips
(putih, kuning, biru), microtube steril, nitrogen cair,
daun Caesalpinia pulcherima, Delonix regia,
Calliandra sp., Crotolaria sp., Ethanol 70%, CTAB
extraction buffer ,β-merchaptoethanol, PVP , C:I
(24:1), Isopropanol, Etanol 96%, Etanol 70%,
CH3COONa 3 M pH 5,2, TE pH 8,0, TE-RNAse pH 8,0,
TAE 1X, agarosa, dan tisu.
Cara Kerja
Tahapan pertama dari keseluruhan rangkaian
praktikum ini adalah isolasi DNA genom tanaman
yang digunakan. Pertama, sampel daun sebanyak 1
gram dicuci hingga bersih, disemprot dengan alkohol
lalu dikeringkan. Lalu sampel dimasukkan dalam
mortar steril (telah diautoklaf). Kemudian dituangkan
N2O cair dan digerus hingga halus, tetapi jangan
sampai menjadi pasta.
Setelah itu serbuk halus yang terbentuk dimasukkan
ke dalam microtube kosong dan ditimbang terlebih
dahulu massa awalnya. Lalu tabung ditimbang untuk
menentukan massa serbuk yang ditambahkan.
Disiapkan CTAB buffer dan ditambahkan PVP hingga
mencapai 0,02 g/mL buffer ekstraksi CTAB dan diberi
100 μL β-mercaptoethanol 1 % setiap 1 mL buffer
ekstraksi CTAB, pada microtube sampel. Setelah itu
dimasukkan ke dalam buffer CTAB yang (0,1-0,2
gram/500 μL) dan divorteks. Lalu Diinkubasi selama
15 menit pada waterbath dengan suhu 60°C.
Microtube dibiarkan dingin pada suhu kamar. Lalu
ditambahkan 500 μL C:I (1:1) dan divorteks. Setelah
itu microtube disentrifugasi selama 10 menit pada
12.000 rpm, 4°C. Saat sentrifugasi selesai, diambil
supernatannya.
Setelah supernatan yang pertama diambil, isi
microtube dipindahkan ke microtube baru (di-
aliquot). Lalu ditambahkan 500 μL C:I (1:1) ke dalam
microtube yang baru dan disentrifugasi selama 10
menit pada 12.000 rpm, 4°C. Setelah sentrifugasi
selesai, diambil supernatannya.
Setelah terambil supernatan yang kedua, isi
microtube dipindahkan ke microtube baru. Lalu
ditambahkan isopropanol dingin sebanyak 1 volume
(supernatan: isopropanol = 1:1) dan dikocok perlahan
hingga larutan menjadi homogen, kemudian
disimpan dalam kulkas 4°C selama 30 menit. Setelah
keluar dari kulkas, microtube disentrifugasi selama 10
menit pada 12.000 rpm dan setelah itu dibuang
supernatannya.
Setelah supernatan yang ketiga dibuang, pelet
dikeringkan dari supernatan dan dilarutkan dalam
100 μL buffer TE. Setelah itu ditambahkan larutan
CH3COONa 3 M pH 5,2 sebanyak 1/10 volume (10 μL)
dan ethanol 96% /absolut 250 µL dan dikocok hingga
homogen. Kemudian microtube yang baru disimpan
di freezer -20°C selama 30 menit. Setelah itu
microtube disentrifugasi selama 10 menit pada
12.000 rpm dan dibuang supernatannya.
Pelet yang tersisa dicuci dengan 500 µL ethanol 70%
dan disentrifugasi selama 10 menit pada 12.000 rpm
dan kemudian dibuang supernatannya.
Pelet hasil sentrifugasi kemudian dikeringkan dengan
dibalik pada tisu selama 10-15 menit. Kemudian
ditambahkan 20-30 µL TE-RNAse (jika perlu DNA
dengan konsentrasi tinggi kurangi volume elusi) dan
disimpan pada suhu -20 °C. Jadi, isolat DNA telah
terbentuk.
Tahapan kedua adalah elektroforesis isolat DNA.
Sebanyak 1% (w/v) bubuk agarosa dicampurkan
dalam TAE 1X pada Erlenmeyer 250 mL (contoh: 0,4
gram / 40 mL TAE, umumnya 60 mL agarosa). Lalu
dimasukkan ke dalam microwave (~1 menit) hingga
tidak teramati adanya residu agarosa di larutan atau
dipanaskan dan diaduk pada hotplate stirrer.
Erlenmeyer didinginkan hingga hangat (jangan
sampai gel mengeras kembali). Kemudian dituang
pada cetakan gel agarosa yang telah dipasang dengan
sisir dan tempat gel (jika ada). Lalu didiamkan 20-30
menit pada suhu ruang. Setelah itu gel diangkat dari
cetakannya
Lalu alat elektroforesis dihubungkan dengan power
supply. Kemudian diletakkan gel agarosa pada alat
elektroforesis. Kemudian dituangkan TAE 1x pada alat
elektroforesis hingga gel terendam (~600 mL TAE 1x)
dan diisi sampel DNA ke well agarosa. Kemudian
diteteskan loading dye 6x pada parafilm/selotip
sebanyak 1 µL dan dicampurkan DNA sebanyak 5 µL
dengan loading dye dan diresuspensi. Setelah itu,
diload 6 μL campuran ke dalam gel agarosa. Lalu alat
Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati :::
Praktikum Genetika (Modul 7 dan 8) – 2019
elektroforesis dijalankan pada 100 V, 26 menit
(pastikan loading dye bergerak 2/3 dari gel agarosa,
jika belum dapat ditambahkan waktu elektroforesis).
Setelah itu alat elektroforesis diamatikan dam alat
elektrooresis selesai digunakan.
Kemudian gel agarosa direndam dalam EtBr selama 3
menit dan dicuci pada air selama 5 menit. Setelah itu
gel diamati di bawah UV Transilluminator dan
didokumentasikan. Lalu gel dibuang ke tempat
pembuangan khusus gel. Gel agarosa telah
divisualisasi.
Tahapan ketiga adalah pengukuran konsentrasi dan
kemurnian DNA dengan alat nanodrop
spectrophotometer. Pertama, nanodrop dihubungkan
dengan power supply dan diatur konfigurasinya untuk
mengukur konsentrasi DNA. Lalu Diteteskan 1,5 µL
blanko pada pedestalnya dan ditekan tombol blank.
Setelah itu diteteskan 1,5 µL blanko pada pedestalnya
dan diusap dengan kertas lensa. Kemudian ditekan
tombol blank untuk mengkonfirmasi blanko dan
diusap dengan kertas lensa. Lalu diteteskan 1,5 µL
sampel pada pedestalnya. Dibaca hasil pengukuran
konsentrasi DNA dan nilai A260/280 nya. Kemudian
diusap dengan kertas lensa dan alat NanoDrop
dimatikan.
2. Amplifikasi Daerah ITS 2 dari DNA genom
tumbuhan
Alat dan Bahan
Dalam eksperimen kali ini digunakan alat dan bahan:
PCR, ice box, mikropipet Eppendorf putih dan kuning,
Set elektroforesis agarosa, spindown centrifuge, Go
Taq Green Master Mix 2X, primer forward (S2F :5’-
ATG CGA TAC TTG GTG TGA AT - 3’), primer reverse
(S3R : 5’ GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT 3’),
nuclease free water, DNA template, tips putih dan tips
kuning, PCR tube 0,2 mL, TAE 1X, agarosa, dan EtBr.
Cara Kerja
Tahapan pertama adalah amplifikasi gen ITS 2
(Internal Transcribed Spacer 2). Pertama, PCR tube
0,2 mL ditambahkan ddH2O steril atau yang disebut
nuclease free water (NFW) sesuai campuran yang
diperlukan. Lalu ditambahkan primer forward dan
primer reverse sesuai campuran yang diperlukan.
Kemudian ditambahkan master mix PCR sesuai
campuran yang diperlukan. Setelah itu ditambahkan
DNA template sesuai campuran yang diperlukan. Lalu
dicampurkan dengan cara quick spin atau di-
spindown. Kemudian dimasukkan ke dalam mesin
PCR yang telah dinyalakan. Setelah itu mesin PCR
3
diatur program PCR-nya meliputi suhu dan durasi
denaturasi awal, denaturasi, annealing, ekstensi,
ekstensi akhir beserta jumlah siklus yang digunakan.
Lalu mesin PCR diatur volume total reaksi yang
digunakan (35 µL).
Tahapan kedua adalah dilakukan elektroforesis isolat
DNA. Sebanyak 1% (w/v) bubuk agarosa dicampurkan
dalam TAE 1X pada Erlenmeyer 250 mL (contoh: 0,4
gram/40 mL TAE, umumnya 60 mL agarosa). Lalu
dimasukkan ke dalam microwave (~1 menit) hingga
tidak teramati adanya residu agarosa di larutan atau
dipanaskan dan diaduk pada hotplate stirrer.
Erlenmeyer didinginkan hingga hangat, tetapi jangan
sampai gel mengeras kembali. Kemudian dituang
pada cetakan gel agarosa yang telah dipasang dengan
sisir dan tempat gel. Lalu didiamkan 20-30 menit pada
suhu ruang. Setelah itu gel diangkat dari cetakannya
dan dikeringkan.
Lalu alat elektroforesis dihubungkan dengan power
supply. Kemudian diletakkan gel agarosa pada alat
elektroforesis. Kemudian dituangkan TAE 1x pada alat
elektroforesis hingga gel terendam (~600 mL TAE 1x)
dan di-load sampel DNA ke well agarosa. Kemudian
diteteskan loading dye 6x pada parafilm/selotip
sebanyak 1 µL dan dicampurkan DNA sebanyak 5 µL
dengan loading dye dan diresuspensi. Setelah itu,
diload 6 μL campuran ke dalam gel agarosa. Lalu alat
elektroforesis dijalankan pada 100 V, 26 menit
(pastikan loading dye bergerak 2/3 dari gel agarosa,
jika belum dapat ditambahkan waktu elektroforesis).
Setelah itu alat elektroforesis diamatikan dam alat
elektroforesis selesai digunakan.
Kemudian gel agarosa direndam dalam EtBr selama 3
menit dan dicuci pada air selama 5 menit. Setelah itu
gel diamati di bawah UV Transilluminator dan
didokumentasikan. Lalu gel dibuang ke tempat
pembuangan khusus gel. Gel agarosa telah
divisualisasi.
Hasil dan Pembahasan
Hasil Pengamatan
1. Hasil Elektroforesis DNA Genom
Gambar 1. Hasil elektroforesis isolasi DNA
Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati :::
4Praktikum Genetika (Modul 7 dan 8) – 2019
genom pada tumbuhan famili Fabaceae
2. Hasil Elektroforesis Amplikon ITS2
Gambar 1. Hasil elektroforesis PCR amplikon gen ITS2
, dan jangan sampai lalat mutan terlepas.
Pembahasan
Secara umum dalam praktikum isolasi DNA genom
dan amplifikasi gen ITS2 untuk barcoding DNA
tanaman terdiri dari dua tahapan besar. Pertama
dilakukan isolasi DNA genom (gen secara keseluruhan
di dalam struktur molekul DNA) dari sampel tanaman
Fabaceae yang ada dengan metode CTAB (Cetyl
Trimethyl Ammonium Bromide)[13]. Di dalam protokol
kerja isolasi DNA, sebagian besar runtutan kerjanya
adalah: penggerusan sampel hingga menjadi bubuk,
vorteks, penambahan reagen, sentrifugasi berulang
kali, pengambilan supernatan dan pelet berulang kali,
pengeringan dan pendinginan berulang kali, beserta
elektroforesis agarosa. Kedua, dari isolat DNA-nya
secara spesifik sekuens DNA untuk gen ITS2-nya
diamplifikasi dengan metode PCR (Polymerase Chain
Reaction)[14]. Protokolnya secara beruntutan adalah
penambahan NFW (nuclease free water), primer
forward dan reverse, Taq polymerase, terakhir DNA
template. Lalu di-spin down dan setelah itu
dimasukkan ke mesin PCR, dan terakhir
dielektroforesis agarosa.
Pada metode CTAB, terdapat beberapa tahapan dan
digunakan sejumlah reagen. Akan dilakukan
pencucian, sentrifugasi, pengambilan supernatan,
perendaman di waterbath, dan pendinginan berulang
kali untuk optimasi kemurnian DNA yang diisolasi.
Reagen-reagen yang digunakan bertujuan pemisahan
secara kimiawi. Sedangkan beberapa proses mekanis
digunakan dengan tujuan pemisahan DNA dari
makromolekul lainnya secara fisis.
Awalnya sampel tumbuhan dibersihkan dan
disemprot alkohol supaya steril. Selanjutnya pada
saat digerus digunakan nitrogen cair karena suhu
yang sangat dingin mampu menghancurkan
membran sel, organel, dan protein. Pada dinding sel
tumbuhan terdapat polifenol, polisakarida, dan
metabolit sekunder, penambahan N2 cair dapat
mencegah aktivasi enzim nuklease yang dapat
merusak DNA dan juga untuk membekukan jaringan.
Penggerusan sendiri bertujuan untuk
menghancurkan dinding sel tanaman dan
mengubahnya menjadi serbuk.
Setelah itu serbuk halus ditambahkan CTAB yang
bersifat deterjen kationik. Karena deterjen memiliki
sifat sebagian hidrofobik, dapat digunakan untuk
melisiskan membran fosfolipid pada sel. Di dalam
CTAB sendiri terkandung PVP yang berperan untuk
mengikat polifenol dengan ikatan hidrogen karena
polifenol berpotensi menganggu proses isolasi DNA.
Selain PVP, juga terdapat β-merchaptoethanol yang
berfungsi untuk mereduksi ikatan disulfida pada
protein. Jadi, CTAB digunakan untuk memurnikan
DNA dari makromolekul lainnya seperti protein dan
polifenol. Agar pelet berupa zat pengotor dapat
dipisahkan dari DNA, maka larutan divorteks dan
peletnya akan mengendap. Setelah itu larutan
diinkubasi di waterbath dengan suhu 60°C dengan
tujuan agar larutan tercampur menjadi homogen.
Selanjutnya ditambahkan reagen CI dengan tujuan
terbentuknya dua fasa, yaitu aqueous berupa
supernatan berisi DNA dan solid berupa pelet yang
berisi zat pengotor yang telah terpresipitasi. CI dan
CTAB memurnikan DNA dari pengotornya dengan
cara mengendapkan atau membentuk ikatan dengan
zat pengotornya. Agar DNA benar-benar murni,
dilakukan sentrifugasi berulang kali. Prinsip dasarnya
adalah pemisahan substrat berdasarkan perbedaan
massa molekulnya. DNA akan berada di atas
sedangkan zat pengotor yang lebih berat akan berada
di bawah. Lalu supernatannya yang pertama diambil,
dipindahkan ke microtube baru dan diberi perlakuan
reagen CI sekali lagi dengan tujuan yang sama.
Setelah itu diperoleh supernatan II.
Setelah itu supernatan II dipindahkan ke microtube
baru. Ditambahkan reagen selanjutnya, yaitu
isopropanol dengan tujuan mengikat DNA, sehingga
DNA yang terpresipitasi dan bukan zat pengotornya.
Lalu didinginkan dengan tujuan terjadi interaksi yang
lebih kuat di antara molekul asam deoksiribonukleat
dengan isopropanol. Kemudian disentrifugasi dan
setelah disentrifugasi, supernatan yang berisi
makromolekul selain DNA dibuang. Jadi hanya akan
tersisa pelet berupa DNA.
Selanjutnya pelet dikeringkan dan dicampurkan
dengan reagen TE dan CH3COONa. Tujuannya adalah
untuk melarutkan DNA dalam kondisi basa dansalting
out alias dehidrasi. Kemudian dilakukan pendinginan
lagi guna menghambat aktivitas enzim nuklease. Lalu
disentrifugasi dan diambil pelet II.
Pelet II dicuci dengan ethanol 70% dengan dasar
perlakuan yang sama ketika dicuci dengan
isopropanol, yaitu untuk mengendapkan DNA.
Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati :::
Praktikum Genetika (Modul 7 dan 8) – 2019
Setelah itu dilakukan sentrifugasi dan diambil pelet
III. Pada tahap terakhir, pelet III dikeringkan
kemudian ditambahkan reagen TE-RNAse guna
melarutkan pelet DNA dan mengkatalis RNA jika
masih ada sehingga diperoleh murni hanya DNA.
Isolat DNA disimpan dengan suhu -20°C supaya DNA
tetap stabil dan DNAse dihambat aktivitasnya.
Ucapan Terima Kasih
Penulis mengucapkan puji syukur dan terima kasih
kepada Tuhan yang Maha Esa, atas berkat-Nya
laporan ini dapat selesai tepat waktu dengan baik dan
lancar. Terima kasih juga kepada asisten atas
bimbingannya dan rekan-rekan untuk bantuannya.
Daftar Pustaka
[1] Snustad, D. P. & Simmons, M. I. 2012. Principles of
Genetics. 6th ed. Boston: John Wiley & Sons, Inc.
[2] Campbell, N., Reece, J., Urry, L., Cain, M.,
Wasserman, S., Minorsky, P. and Jackson,
5
R. 2008. Campbell Biology. 8th ed. California:
Pearson Education, Inc.
[3] Falk, R., 2009. Genetic Analysis. U.S: Benjamin
Cummings.
[4] Pierce, B. A. 2006. Genetics: A Conceptual
Approach. London: University Book Press.
[5] MacDonald, D., 2005. “Analysis of Genes and
Genomes”. Bioscience Education. 1(5): 27 – 30.
[6] Ödeen, A. and Moray, C.M., 2008. “Drosophila
melanogaster virgins are more likely to mate with
strangers than familiar flies”. Naturwissenschaften.
[7] Berg, L. 2015. “An Introduction to Fruit Flies”.
http://depts.washington.edu/cberglab/wordpress/
outreach/an-introduction-to-fruit-flies/. Diakses 24
Oktober 2019.
[8] Markow, T. 2011. “’Cost’ of virginity in wild
Drosophila melanogaster females”. Ecol Evol, 1(4):
596-600.
[9] Hartwell, L., Goldberg, M. C & Hood, L.E. 2018.
Genetics from Genes to Genomes. New York:
McGraw-Hill Education..
[10] Dahmann, C. 2008. Drosophila: Methods and
Protocols. Totowa: Humana Press.
Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati :::