UJI EFEKTIFITAS PERASAN AIR JERUK NIPIS (Citrus aurantifolia S)

TERHADAP PERTUMBUHAN BAKTERI Staphylococcus aureus

SECARA IN VITRO

Oleh :

Annisa Amalia

1708010043

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS NUSA CENDANA

KUPANG

2019
Daftar Isi
BAB I ............................................................................................................................ 4
PENDAHULUAN .............................................................................................................. 4
1.1 Latar Belakang..................................................................................................... 4
1.2 Pertanyaan Penelitian ......................................................................................... 6
1.3 Batasan Masalah ................................................................................................. 6
1.4 Tujuan Penelitian ................................................................................................ 6
1.5 Manfaat Hasil Penelitian ..................................................................................... 7
BAB II ................................................................................................................................... 9
TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................................... 9
2.1 Jeruk Lemon (Citrus limon burm f.)........................................................................... 9
2.1.1 Klasifikasi Jeruk lemon (Citrus limon (L) burm f.) ............................................. 10
2.1.2 Kandungan Kimia dan Manfaat ........................................................................ 10
2.2 Streptococcus mutans............................................................................................. 13
2.2.1 Klasifikasi ................................................................................................... 14
2.2.2 Patogenesis ............................................................................................... 14
2.3 Metode Uji Antibakteri ........................................................................................... 16
2.4 Kerangka Teori .................................................................................................. 19
BAB III ................................................................................................................................ 21
METODE PENELITIAN ........................................................................................................ 21
3.1 Kerangka Konsep..................................................................................................... 21
3.2 Identifikasi Variabel ................................................................................................ 22
3.2.1 Variabel Bebas (x) ............................................................................................ 22
3.2.2 Variabel Terikat (y) ........................................................................................... 22
3.3 Definisi Operasional ................................................................................................ 22
3.4 Jenis dan Rancangan Penelitian .............................................................................. 23
3.5 Lokasi dan Waktu .............................................................................................. 24
3.6 Populasi dan Sampel ......................................................................................... 24
3.7 Kriteria Inklusi dan Ekslusi................................................................................. 26
3.7.1 Kriteria Inklusi .................................................................................................. 26
 Bbh .................................................................................................................... 26
 ................................................................................................................................. 26
3.7.2 Kriteria Ekslusi .................................................................................................. 26
 Bjh ..................................................................................................................... 26
 jhi....................................................................................................................... 26
3.8 Alur Penelitian dan Cara Kerja ................................................................................ 27
3.8.1 Alur Penelitian .................................................................................................. 27
3.8.2 Cara Kerja ......................................................................................................... 29
3.9 Analisis Data ...................................................................................................... 32
 BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Rongga mulut merupakan salah satu organ tubuh yang

mengandung mikroorganisme dengan keanekaragaman paling

tinggi dibandingkan organ tubuh yang lain. Salah satu penyakit

rongga mulut yang paling umum adalah karies gigi. Menurut

Riskesdas (2013), terjadi peningkatan prevalensi terjadinya karies

aktif pada penduduk Indonesia dibandingkan tahun 2007 lalu,

yaitu dari 43,4 % (2007) menjadi 53,2 % (2013) (Rikesdas, 2013).

Dalam rongga mulut seseorang mengandung berbagai

macam spesies bakteri yang bersifat komensal. Di antara bakteri

tersebut adalah Streptococcus mutans yang bersifat kariogenik dan

merupakan penyebab utama karies gigi. Salah satu ciri bakteri ini

adalah memiliki kemampuan menempel pada semua lokasi

permukaan habitatnya dalam rongga mulut (Anggraeni et al.,

2005). Bakteri inilah yang mengubah glukosa dan karbohidrat

pada makanan menjadi asam melalui proses fermentasi. Asam

terus diproduksi oleh bakteri dan akhirnya merusak struktur gigi

sedikit demi sedikit. Kemudian bakteri akan mengikuti jalan yang

sudah dibuat oleh asam dan menginfeksi lapisan gigi (Pratiwi,

2007).

Pencegahan karies dapat dilakukan dengan cara

pembersihan plak baik secara mekanis maupun kimiawi. Metode

yang digunakan untuk mencegah karies secara mekanis, seperti

menyikat gigi, membersihkan gigi menggunakan benang gigi,

atau berkumur-kumur dengan menggunakan obat kumur.

Pencegahan karies secara kimiawi salah satunya dengan

menggunakan zat antibakteri yang dapat menghambat

pertumbuhan plak (Kidd dan Joyston, 2002). Zat antibakteri

merupakan zat yang mampu mengganggu pertumbuhan dan

mematikan bakteri (Madigan, 2005). Antibakteri selain dapat

diperoleh dari bahan sintetik dapat juga diperoleh secara alami,

yaitu dari bahan tradisional.

Salah satu tanaman herbal yang sering dimanfaatkan yaitu

buah lemon. Pemanfaatan buah lemon sebagai terapi kesehatan

dapat digunakan sebagai jus dan infused water. Air perasan buah

lemon (Citrus limon (L.) Burm. f.) mengandung banyak senyawa

bioaktif seperti flavonoid, karotenoid, limonoid, tannin, dan

 terpenoid. Senyawa bioaktif yang terkandung dalam lemon

masing-masing memiliki sifat antibakteri (Russo, et al., 2014).

Berdasarkan data di atas penulis tertarik untuk meneliti

tentang aktivitas antimikroba perasan buah lemon (Citrus limon

(L.) Burm. f.) terhadap pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans

secara in vitro dengan menggunakan metode disc diffusion.

1.2 Pertanyaan Penelitian

Apakah ada pengaruh perasan buah lemon (Citrus limon (L.)

Burm. f.) terhadap pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans

secara in vitro dengan menggunakan metode disc diffusion?

1.3 Batasan Masalah

1.4 Tujuan Penelitian

1. Tujuan Umun

Mengetahui pengaruh perasan buah lemon (Citrus limon (L.)

Burm. f.) terhadap pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans

secara in vitro dengan menggunakan metode disc diffusion.

2. Tujuan Khusus
 a. Untuk mengetahui aktivitas daya hambat perasan buah

lemon (Citrus limon (L.) Burm. f.) terhadap pertumbuhan

bakteri Streptococcus mutans dengan konsentrasi 10%.

b. Untuk mengetahui aktivitas daya hambat perasan buah

lemon (Citrus limon (L.) Burm. f.) terhadap pertumbuhan

bakteri Streptococcus mutans dengan konsentrasi 25%.

c. Untuk mengetahui aktivitas daya hambat perasan buah

lemon (Citrus limon (L.) Burm. f.) terhadap pertumbuhan

bakteri Streptococcus mutans dengan konsentrasi 50%.

d. Untuk mengetahui aktivitas daya hambat perasan buah

lemon (Citrus limon (L.) Burm. f.) terhadap pertumbuhan

bakteri Streptococcus mutans dengan konsentrasi 75%.

e. Untuk mengetahui aktivitas daya hambat perasan buah

lemon (Citrus limon (L.) Burm. f.) terhadap pertumbuhan

bakteri Streptococcus mutans dengan konsentrasi 100%.

1.5 Manfaat Hasil Penelitian

1. Bagi Mahasiswa

Mahasiswa dapat mengetahui pengaruh perasan buah lemon

(Citrus limon (L.) Burm. f.) terhadap pertumbuhan bakteri

Streptococcus mutans secara in vitro dengan menggunakan

metode disc diffusion.

2. Bagi Peneliti

Dari hasil penelitian ini, peneliti dapat memperoleh

pengalaman serta pemahaman mengenai pengaruh perasan

buah lemon (Citrus limon (L.) Burm. f.) terhadap pertumbuhan

bakteri Streptococcus mutans secara in vitro dengan

menggunakan metode disc diffusion.

3. Bagi Institusi

Dapat dijadikan kepustakaan dalam penelitian yang berkaitan

dengan pengaruh perasan buah lemon (Citrus limon (L.) Burm.

f.) terhadap pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans secara

in vitro dengan menggunakan metode disc diffusion.

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Jeruk Lemon (Citrus limon burm f.)

Lemon (Citrus limon) merupakan tanaman asli Asia Tenggara (Manner et

al., 2006). Lemon pertama kali tumbuh di India, Burma utara dan Cina. Pada tahun

1493, Christopher Colombus membawa biji Citrus limon ke Hispaniola. Budidaya

Citrus limon pertama kali di Genoa pada pertengahan abad ke 15. Pada abad ke 18

dan abad 19, Citrus limon ditanam di Florida dan California. Bagian dari tanaman

Citrus limon yang sering dimanfaatkan adalah kulit buah, bunga, daun, air perasan

(Manner et al., 2006).

Jeruk lemon (Citrus limon (L.) Burm. f.) termasuk salah satu jenis tumbuhan

perdu yang banyak memiliki dahan dan ranting dengan tinggi maksimal mencapai 10

sampai 15 kaki (3-6 m). Citrus limon memiliki batang berduri, daun hijau dan

lonjong, bunga berbentuk oval dan berwarna putih dengan garis-garis ungu

didalamnya. Buah Citrus limon berukuran 7-12 cm dan berbentuk bulat telur dengan

ujung yang runcing pada salah satu ujungnya. Kulit Citrus limon berwarna kuning

terang, kadang terdapat garis berwarna hijau atau putih dan mempunyai tebal sekitar

6-10 mm. Daging buah Citrus limon berbulir, berwarna kuning pucat, terdapat

sekitar 8-10 segmen, bersifat juicy dan mempunyai rasa asam (Manner et al., 2006).
 Gambar II.1. Jeruk lemon (Citrus limon (L) burm f.) (Manner et al.,

2006)

2.1.1 Klasifikasi Jeruk lemon (Citrus limon (L) burm f.)

Klasifikasi botani tanaman Citrus limon menurut Manner et al., 2006) :

Kingdom : Plantae

Sub Kingdom : Tracheobionta

Super Divisi : Spermatophyta

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida-Dicotyledons

Sub Kelas : Rosidae

Ordo : Sapindales

Famili : Rutaceae

Genus : Citrus

Spesies : Citrus limon burm f

2.1.2 Kandungan Kimia dan Manfaat

Citrus limon mengandung sejumlah asam sitrat (3,7%), minyak atsiri

(2,5%), 70% limoneme penine. Citrus limon juga mengandung potassium 145 mg

per 100 g lemon, bioflavonoids, dan vitamin C 40-50 mg per 100 g (Chevallier,

1996).

Senyawa kimia dalam buah Citrus limon (Stanway, 2011) terdiri dari:

a. Asam sitrat

Rumus kimia asam sitrat adalah C6H8O7. Asam sitrat termasuk salah satu

asam organik dengan nama kimia 2-hydroxy-1,2,3-propanetricarboxylic acid

 (Lewis, 2001, p.1205.). Kandungan asam sitrat dalam air perasan Citrus

limon dapat membantu memindahkan cairan yang berlebih dari dalam

jaringan ke dalam pembuluh darah, sehingga mengurangi kemampatan

jaringan dan darah mengalir dengan bebas. Asam sitrat lebih cepat

mengerosi enamel gigi terutama pada pH rendah, 1,5 dan 2,5. Asam ini dua

kali lebih destruktif terhadap enamel gigi dari pada asam klorida ataupun

asam nitrat karena afinitasnya yang tinggi terhadap kalsium.

b. Asam Askorbat (vitamin C)

Citrus limon juga kaya akan vitamin C. Bentuk utama vitamin C adalah

asam askorbat (ascorbic acid) dengan rumus C6H8O6. Kadar vitamin C

yang dibutuhkan tubuh hanya berkisar 90 mg (US) dan 75 mg (UK),

sedangkan dalam satu buah Citrus limon mengandung vitamin C 60-100 mg.

Jadi satu buah Citrus limon dapat melengkapi kebutuhan tubuh.

c. Glucaric acid

Glucaric acid dapat menurunkan kadar kolesterol dalam darah, mencegah

kanker usus dan radang usus dengan mengeluarkan butyric acid dalam usus

besar, mencegah kanker payudara, kanker prostat, kanker ovarium,

mencegah pre menstruasi sindrom dengan mendorong glucoronidation dan

mengurangi kadar polusi dalam tubuh.

d. Polifenol

Citrus limon mengandung polifenol sebagai antioksidan dan

antibakteri terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus subtillis,

Salmonella typhi, Klebsiella pneumonia, dan E. coli (Kumar et al,

2011) dan memiliki efek anti fungi Candida albicans (Kirbaslar et al,

2009).
Polifenol pada Citrus limon (Grohmann & Manthey 2001) meliputi:

a. Flavonoid

Flavonoid dalam Citrus limon menyebabkan warna kuning terang yang

berguna untuk melindungi kekuatan vitamin C dengan meningkatkan

absorpsi dan melindungi dari oksidasi, mengurangi kadar kolesterol sampai

40% dengan mengurangi produksi kolesterol pada liver, dapat mengurangi

resiko penyakit jantung, mencegah kanker, menguatkan dinding pembuluh

darah. Flavonoid yang water-soluble antara lain citrin, bioflavonoid. Kadar

flavonoid paling tinggi terdapat pada kulit Citrus limon.

b. Coumarins

Coumarins paling banyak terdapat pada kulit Citrus limon dan

berminyak. Kadar coumarins pada kulit Citrus limon lebih tinggi

daripada bulir Citrus limon. Coumarins bersifat sebagai antioksidan.

c. Limonene

Limonene ditemukan pada seluruh bagian Citrus limon, namun paling

banyak terdapat pada pith dan pips. Limonene menyebabkan rasa pahit

pada Citrus limon. Penelitian telah membuktikan bahwa limonene

dapat membantu mencegah multiplikasi sel kanker pada mulut,

payudara, kulit, paru-paru, kolon. Limonene juga dapat mengurangi

kadar kolesterol pada liver.

d. Tanin

Tanin ditemukan pada kulit dan daun Citrus limon. Tanin berfungsi sebagai

anti bakteri dan antioksidan. Tanin menyebabkan rasa Citrus limon menjadi

agak pahit dan asam.

 e. Fenol

Fenol terdapat pada kulit, daun dan air perasan Citrus limon. Fenol berfungsi

sebagai anti bakteri, antifungi dan antioksidan. Fenol pada Citrus limon

dapat mengurangi kolesterol dalam darah sehingga dapat mengurangi resiko

penyakit jantung.

2.2 Streptococcus mutans

Gambar II.2. Koloni Streptococcus mutans

dengan pewarnaan Gram Positif.

Streptococcus mutans termasuk kelompok Streptococcus viridans, ciri

khas organisme ini bersifat α-hemolitik tetapi dapat juga non hemolitik dan

komensal oportunistik. Pertumbuhannya tidak dihambat oleh optokin dan

koloninya tidak larut empedu. Streptococcus mutans merupakan anggota flora

normal rongga mulut tetapi dapat berubah menjadi patogen jika

keseimbangan flora normalnya terganggu (Jawetz et al., 2000). Biasanya

penyakit yang di timbulkan Streptococcus mutans adalah karies gigi (Gani et

al., 2006).
 Streptococcus mutans dikenal dengan kemampuanya untuk mensintesis

polisakarida ekstraseluler dari sukrosa, mengalami agregari sek ke sel ketika

bersifat asidogenik yaitu menghasilkan asam dan bersifat asidurik yaitu

mampu hidup pada lingkungan asam. Streptococcus mutans menghasilkan

dua enzim, yaitu glucosyltransferase (GFT) dan fruktosyltransferase (FTF).

Enzim enzim ini bersifat mengubah substrat sukrosa menjadi polisakarida

yang digunakan untuk sintesa glukan (dekstran) dan fruktan (Jawetz et al.,

2000).

2.2.1 Klasifikasi

Kingdom : Monera

Divisio : Firmicutes

Class : Bacilli

Order : Lactobacilalles

Family : Streptococcaceae

Genus : Streptococcus

Species : Streptococcus mutans

2.2.2 Patogenesis

Pembentukan plak dimulai dari deposit glikoprotein pada saliva yang

menempel pada permukaan gigi dan membentuk pelikel. Kemudian bakteri

Streptococcus mutans menempel pada permukaan gigi tersebut.

Streptococcus mutans akan berkembang biak dan mengeluarkan gel ekstrasel

(glukan) yang lengket kemudian akan menjerat mikroorganisme lain dan

akhirnya membentuk plak dan akan berkembang menjadi tebal dan terdiri

dari macam macam mikroorganisme (Kidd et al., 1991).

Etiologi yang penting adalah berhubungan dengan frekuensi konsumsi

karbohidrat. Karbohidrat yang tertahan dalam waktu lebih lama di mulut

mungkin lebih kariogenik daripada produk makanan yang tertahan dalam

waktu singkat (Pratiwi, 2005). Karbohidrat yang kompleks relatif tidak

bahaya karena tidak dicerna untuk dalam mulut. Setelah proses plak

berlangsung, Streptococcus mutans akan memfermentasikan beberapa jenis

karbohidrat makanan misalnya sukrosa dan glukosa hingga membentuk asam

sehingga pH plak akan menurun sampai dibawah 5 dalam tempo 1-3 menit.

Penurunan pH berulang tersebut mengakibatkan demineralisasi permukaan

gigi dan proses karies pun dimulai (Kidd et al., 1991).

Karies gigi adalah penyakit jaringan gigi yang ditandai dengan

kerusakan yang dimulai dari permukaan gigi ( pits, fissure dan daerah

interproximal) meluas ke arah pulpa. Karies merupaka suatu proses kronis

regresif yang dimulai dengan larutnya mineral email sebagai akibat

terganggunya keseimbangan antara email dan sekelilingnya yang disebabkan

oleh pembentukan asam mikrobial dari substrat sehingga timbul destruksi

komponen komponen organik yang akhirnya terjadi kavitas (Theodora dan

Willianti, 2015).

Karies adalah suatu penyakit yang disebabkan oleh adanya interaksi

antara bakteri plak, diet, dan gigi. Tidak diragukan lagi bahwa tanpa adanya

plak, maka tidak akan timbul karies. Penelitian klasik Keyes dan Fitzsgerald
 tahun 1960, pada binatang bebas kuman memperlihatkan bahwa plak yang

didominasi oleh kuman Streptococcus mutans dan Lactobacillus

menyebabkan terbentuknya karies. Streptococcus mutans dan Lactobasillus

merupakan kuman yang kariogenik karena mampu segera membentuk asam

dari karbohidrat yang dapat diragikan. Kuman tersebut dapat tumbuh subur

dalam suasana asam dan dapat menempel pada permukaan gigi karena

kemampuannya membuat polisakarida ekstra sel. Polisakarida ekstra sel ini

terutama terdiri dari polimer glukosa yang menyebabkan matriks plak

mempunyai konsistensi seperti gelatin, akibatnya bakteri terbantu untuk

melekat pada gigi serta saling melekat satu sama lain. Plak makin lama makin

tebal, sehingga akan menghambat fungsi saliva untuk melakukan aktivitas

antibakterinya (Kidd et al., 1992).

2.3 Metode Uji Antibakteri

Uji antibakteri digunakan untuk mengukur kerentanan bakteri terhadap

suatu antibakteri. Terdapat beberapa metode yang dapat digunakan utnuk

menguji anti bakteri (Damayanti,2014), yaitu :

1. Metode Difusi

Zat antibakteri diletakkan pada media pembenihan yang telah diinokulasi

oleh bakteri, kemudian diinkubasi dan dihitung zona jernih disekitar zat

antibakteri yang diinterpretasikan sebagai daya hambat pertumbuhan

bakteri oleh zat antibakteri. Adapun beberapa cara yang dapat dilakukan,

yaitu:
a. Metode disc diffusion

Metode ini bertujuan untuk menentukan aktivitas zat antibakteri. Zat

antibakteri yang terkandung dalam cakram disk diletakkan diatas

media agar yang telah ditanami bakteri, kemudian diinkubali selama

24 jam atau lebih, kemudian hitung zona hambat yang berada

disekeliling cakram disk.

Diameter Zona Terang Respon Hambatan Pertumbuhan

>20 mm Kuat

16-20 mm Sedang

10-15 mm Lemah

<10 mm Tidak ada

Tabel II.1. Klasifikasi Hambatan Pertumbuhan

Bakteri
Sumber: Greenwood, 1995

b. E-test

Metode ini bertujuan untuk mengukur kadar hambat minimum suatu

zat antibakteri. Strip yang mengandung zat antibakteri dengan kadar

terendah sampai tertinggi diletakkan pada media agar yang telah

ditanami bakteri. Hambatan pertumbuhan bakteri dapat dilihat

dengan adanya area jernih disekitar strip.

c. Ditch-plate technique

Metode ini dilakukan dengan cara membuat potongan membujur

pada media agar sehingga terbentuk parit, kemudian diisi oleh zat
 antibakteri dan bakteri uji (maksimal 6 macam) digoreskan kedalam

parit.

d. Cup-plate technique

Media agar dibuat sumur dan ditanami bakteri, kemudian berikan zat

antibakteri pada sumur tersebut.

e. Gradien-plate technique

Konsentrasi zat antibakteri pada metode ini bervariasi mulai dari nol

sampai maksimal. Media agar yang telah dicairkan dicampurkan zat

antibakteri, kemudian dimasukkan kedalam cawan petri dan

diletakkan dengan posisi miring, inkubasi selama 24 jam agar zat

antibakteri berdifusi maksimal. Bakteri yang diuji (maksimal 6)

digoreskan pada plate tersebut mulai dari konsentrasi tinggi ke

rendah. Hasilnya diinterpretasikan sebagai panjang total pertumbuhan

bakteri maksimal yang mungkin dibandingkan dengan panjang

pertumbuhan aktual hasil goresan.

2. Metode dilusi

Metode ini bertujuan untuk menentukan zat antibakteri yang dibutuhkan

untuk menghambat pertumbuhan atau membunuh bakteri yang akan

diuji. Terdapat 2 cara dalam metode ini, yaitu:

a. Metode dilusi cair/ broth dilution test

Zat antibakteri diencerkan terlebih dahulu, kemudian bakteri

dimasukkan kedalam berbagai konsentrasi zat antibakteri yang akan

 diuji pada media cair. Kemudian inkubasi selama 18-24 jam, dan

diamati pertumbuhan bakteri dengan melihat kekeruhan dari cairan.

b. Metode dilusi padat/ solid dilution test

Zat antibakteri yang akan diuji digabungkan kedalam agar, kemudian

tanami bakteri diatas permukaannya. Konsentrasi dari masing-masing

zat antibakteri dibagi dengan membuat permukaan agar menjadi

kotak-kotak. Inkubasi selama 24 jam atau lebih, dan dapat dihitung

pertumbuhan dari bakteri yang diuji tersebut.

2.4 Kerangka Teori

 BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Kerangka Konsep

Perasan buah lemon (Citrus limon

(L.) Burm. f.) dalam konsentasi
10%, 25%, 50%, 75%, 100%

Kandunagn dalam buah

lemon:

1. Flavonoid
2. Karotenoid
3. limonoid
4. tannin
5. Terpenoid

Biakan bakteri
Karies gigi
Streptococcus mutans

Pertumbuhan bakteri Pertumbuhan bakteri

terhambat normal
 Keterangan :

= variabel yang tidak diteliti

= variabel yang diteliti
Gambar III.1. Kerangka Konsep Penelitian tentang Pengaruh Perasan Buah
Lemon (Citrus limon (L.) Burm. f.) terhadap Pertumbuhan Bakteri
Streptococcus mutans

3.2 Identifikasi Variabel

3.2.1 Variabel Bebas (x)

Perasan buah lemon dalam konsentrasi 10%, 25%, 50%, 75%, dan 100%.

3.2.2 Variabel Terikat (y)

Zona hambat (zona bening) pada pertumbuhan biakkan bakteri

Streptococcus mutans di media Mueller Hinton Agar (MHA) yang diukur

diameternya menggunakan penggaris dengan satuan milimeter (mm).

3.3 Definisi Operasional

Tabel III.1: Definisi Operasional

No. Variabel Definisi Alat Ukur Skala Data Hasil Ukur

1. Zona Daerah yang tidak Penggaris Rasio Ditemukannya
Hambat ditemukannya zona hambat
pertumbuhan (mm) atau
bakteri tidak.
Streptococcus
mutans
2. Konsentrasi Perasan buah Mikropipet Ordinal Jumlah ekstrak
perasan lemon yang sesuai dengan
buah lemon dilarutkan dengan berbagai
aquades dan konsentrasi
dibuat dalam (%)
berbagai
konsentrasi
3. Larutan Pelarut aquades Mikropipet Nominal Cakram/disc
kontrol digunakan sebagai uji berisi
 kontrol aquades steril
pertumbuhan
Streptococcus
mutans secara in
vitro

3.4 Jenis dan Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian yang digunakan adalah rancangan penelitian

eksperimental dengan post test only control group design menggunakan

teknik disc diffusion untuk melihat pengaruh perasan buah lemon (Citrus

limon (L.) Burm. f.) terhadap pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans

secara in vitro.

Ketererangan :

SA = Biakan Streptococcus mutans

R = Random

Pc = biakan + larutan kontrol

P1 = biakan + perasan buah lemon 10%

P2 = biakan + perasan buah lemon 25%

P3 = biakan + perasan buah lemon 50%

P4 = biakan + perasan buah lemon 75%

P5 = biakan + perasan buah lemon 100%

 Dc = diameter zona hambat pada Pc

D1 = diameter zona hambat pada P1

D2 = diameter zona hambat pada P2

D3 = diameter zona hambat pada P3

D4 = diameter zona hambat pada P4

D5 = diameter zona hambat pada P5

3.5 Lokasi dan Waktu

3.5.1 Lokasi Penelitian

Penelitian ini akan dilaksakan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas

Kedokteran Universitas Nusa Cendana Kupang.

3.5.2 Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan April 2019.

3.6 Populasi dan Sampel

3.6.1 Populasi

Populasi dalam penelitian ini adalah seluruh bakteri Streptococcus mutans

di dalam Mueller Hinton Agar (MHA) yang diperoleh dari Laboratorium

Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Nusa Cendana Kupang.

3.6.2 Sampel

a. Besar Sampel
 Pengambilan sampel dalam penelitian ini dihitung dengan

menggunakan rumus Federer. Dalam penelitian ini terdapat lima

kelompok, terdiri dari kelompok perlakuan yang berjumlah lima

(10%, 25%, 50%, 75%, dan 100%) dan satu kelompok kontrol.

Rumus Federer :

(T-1) X (n-1) ≥ 15

Keterangan :

T = Jumlah perlakuan yang diberikan = 5

n = Besar sampel

Hasil perhitungan :

(T-1) X (n-1) ≥ 15

(5-1) X (n-1) ≥ 15

4(n-1) ≥ 15

4n-4 ≥ 15

4n ≥ 15 + 4

4n ≥ 19

n ≥ 19/4

n ≥ 4,75 dibulatkan menjadi 5

Berdasarkan rumus Federer, didapatkan hasil untuk besar

sampel minimal 5 sampel untuk setiap kelompok.

b. Prosedur dan Teknik Pengambilan Sampel

 Pengambilan sampel dilakukan sebanyak 26 kali dimana setiap

kelompok terdiri dari 5 agar plate dan 1 agar plate sebagai kontrol.

Setiap konsentrasi diletakkan pada satu agar plate untuk menghindari

pengaruh dari konsentrasi lainnya, maka total ada 26 agar plate.

3.7 Kriteria Inklusi dan Ekslusi

3.7.1 Kriteria Inklusi

 Bbh


3.7.2 Kriteria Ekslusi

 Bjh
 jhi
 3.8 Alur Penelitian dan Cara Kerja

3.8.1 Alur Penelitian

Perasan buah lemon

Variasi konsentrasi

Kelompok A Kelompok B Kelompok C Kelompok D Kelompok E Kelompok F

Larutan 5 cawan 5 cawan 5 cawan petri 5 cawan 5 cawan

kontrol petri berisi petri berisi berisi petri berisi petri berisi
(Aquades perasan perasan perasan buah perasan buah perasan buah
teril) buah lemon buah lemon lemon lemon lemon
konsentrasi konsentrasi konsentrasi konsentrasi konsentrasi
10% dengan 25% dengan 50% dengan 75% dengan 100%
pelarut pelarut pelarut pelarut dengan
aquades aquades aquades aquades pelarut
steril steril steril steril aquades
steril

Uji disc diffusion

Biakan bakteri Streptococcus Diinkubasi di dalam

mutans dalam Mueller Hinton inkubator dengan suhu 37o
Agar (MHA) selama 24 jam

Rerata tiap kelompok

dengan mengukur masing-
masing zona hambat

Uji staristik
Keterangan Alur Penelitian

Perasan buah lemon dalam konsentrasi 10%, 25%, 50%, 75%, 100% dibagi

menjadi 5 kelompok perlakuan (B, C, D, E, F) dengan 1 kelompok kontrol (A)

yang menggunakan aquades steril. Masing-masing kelompok konsentrasi (B, C,

D, E, F) dan kontrol (A) diletakkan di dalam 5 cawan petri sehingga ada 26

cawan petri yang berisi perasan buah lemon dengan berbagai konsentrasi dan

larutan kontrol. Setiap cawan petri diletakkan blank disk di dalamnya selama 15-

30 menit kemudian blank disk yang sudah terendam selama 15-30 menit di dalam

perasan buah lemon dan larutan kontrol diletakkan di atas Mueller Hinton Agar

(MHA) plate yang berisi biakan bakteri Streptococcus mutans.

Selanjutnya plate diinkubasi di dalam inkubator dengan suhu 37o selama

24 jam. Kemudian disk akan berdifusi pada media Mueller Hinton Agar

(MHA) tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan

mikroorganisme di permukaan media nutrient agar. Kemudian diukur

diameter zona hambat menggunakan penggaris. Masing-masing kelompok

dihitung rerata zona hambat yang terbentuk pada nutrien agar Streptococcus

mutans dan dimasukkan ke dalam uji statistik, setelah didapatkan hasil,

selanjutnya dibuat kesimpulan.

3.8.2 Cara Kerja

a. Sterilisasi Alat

Seluruh peralatan yang akan digunakan selama penelitian harus

dibersihkan dengan cara dicuci kemudian dikeringkan lalu dibungkus

dengan kertas. Kemudian dilakukan sterilisasi di dalam autoclave

selama 30 menit dengan mengatur tekanan sebesar 1 atm pada suhu

121°C.

b. Pembuatan Biakan Bakteri

Pembuatan biakan bakteri dilakukan untuk memperbanyak stok

dengan cara menginokulasikan 1 ose biakan murni Streptococcus

mutans ke dalam agar nutrien, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C

selama 24 jam di dalam inkubator.

c. Prosedur Pembuatan Perasan buah lemon

1. Menyiapkan bahan yang akan diekstrak yaitu buah jeruk nipis

(Citrus limon (L.) Burm. f.).

2. Mencuci buah jeruk nipis hingga bersih kemudian diperas dengan

menggunakan perasan jeruk.

 3. Saring hasil perasan dengan kertas saring dan masukkan dalam

botol ekstraksi

4. Hasil perasan siap dipakai

5. Membuat larutan konsentrasi perasan melalui pengenceran dengan

aquades.

d. Pembuatan Variabel Konsentrasi

Uji antibakteri dengan perasan buah lemon dan diencerkan

menggunakan aquades steril dengan berbagai konsentrasi, yaitu 10%,

25%, 50%, 75%, 100% dan larutan kontrol menggunakan pelarut

aquades. Semua konsentrasi perasan buah lemon dibuat dengan

volume 5 ml.

Volume zat terlarut

Konsentrasi = X 100%
Volume zat terlarut + Volume pelarut

Volume pelarut = volume larutan - volume zat terlarut

Berdasarkan rumus konsentrasi di atas maka didapatkan volume zat

terlarut (perasan buah lemon) dan volume pelarut (aquades) sebagai

berikut :

i) Pembuatan konsentrasi perasan buah lemon 10% adalah

dengan melarutkan 0,5 ml perasan buah lemon ke dalam 4,5 ml

aquades steril.
 ii) Pembuatan konsentrasi perasan buah lemon 25% adalah

dengan melarutkan 1,25 ml perasan buah lemon ke dalam 3,75

ml aquades steril.

iii) Pembuatan konsentrasi perasan buah lemon 50% adalah

dengan melarutkan 2,5 ml perasan buah lemon ke dalam 2,5

ml aquades steril.

iv) Pembuatan konsentrasi perasan buah lemon 75% adalah

dengan melarutkan 3,75 ml perasan buah lemon ke dalam 1,25

ml aquades steril.

v) Konsentrasi perasan buah lemon 100%. Pembuatan konsentrasi

perasan buah lemon 100% adalah dengan 5 ml perasan buah

lemon tanpa dilarutkan dengan aquades steril.

e. Uji Pengaruh Perasan buah lemon terhadap Pertumbuhan

Bakteri Streptococcus mutans

Bakteri diencerkan dengan mencampurkan 1 ose suspensi

bakteri Streptococcus mutans menggunakan pelarut NaCl. Kemudian

dicampurkan menggunakan vorteks dan dibandingkan dengan larutan

standar 0,5 mF.

Suspensi bakteri Streptococcus mutans dioleskan menggunakan

kapas lidi steril (cotton swab) pada media pertumbuhan Mueller

Hinton Agar (MHA). Kemudian blank disk direndam selama 15-30

menit di dalam cawan petri yang berisi perasan buah lemon yang

telah dibagi ke dalam beberapa konsentrasi. Kemudian blank disk

 yang sudah terendam selama 15-30 menit diletakkan di cawan petri

yang sudah berisi biakan murni bakteri Streptococcus mutans.

Selanjutnya diinkubasi di dalam inkubator dengan suhu 37 o

selama 24 jam. Disk akan berdifusi pada media Mueller Hinton

Agar (MHA) tersebut. Adanya area jernih mengindikasikan terdapat

hambatan pertumbuhan mikroorganisme di permukaan media

Mueller Hinton Agar (MHA). Kemudian zona hambat diukur

diameternya menggunakan penggaris.

3.9 Analisis Data

Analisis data diameter zona hambat diuji normalitas dan homogenitas

terlebih dahulu, apabila distribusi normal maka menggunakan uji one way

anova, namun apabila uji normalitas dan homogenitas tidak terpenuhi maka

memakai uji Kruskal-Wallis. Analisis data menggunakan program SPSS.