2,5 Protein pasca-translasi modi fi kasi

Banyak polipeptida menjalani kovalen modi fi kasi setelah (atau kadang-kadang selama) ribosom
mereka perakitan. PTM seperti yang paling umum diamati tercantum pada Tabel 2.7. Seperti fi
modi kation umumnya di fl pengaruh baik aktivitas biologis o r stabilitas struktural dari
polipeptida. Mayoritas protein terapeutik mengandung beberapa bentuk PTM. Meskipun
glikosilasi merupakan yang paling umum seperti modi fi kasi , PTM tambahan yang penting
dalam konteks biofarmasi termasuk karboksilasi, hidroksilasi, sulfation dan amidasi ; PTM ini
sekarang dipertimbangkan lebih lanjut.
2.5.1 Glikosilasi
Glikosilasi (perlekatan karbohidrat) adalah salah satu bentuk paling umum dari PTM yang terkait
dengan protein eukariotik secara umum, khususnya protein permukaan sel dan eukariotik. Dalam
kasus beberapa glikoprotein, penghapusan komponen gula memiliki efek tidak terdeteksi pada
sifat biologis ( deglycosylated bentuk glikoprotein yang dapat dihasilkan oleh termasuk inhibitor
dari jalur glikosilasi, misalnya antibiotik tunicamycin , di media pertumbuhan sel, atau dengan
degradasi enzim glikokomponen glikoprotein yang telah terbentuk sebelumnya
menggunakan enzim glukosidase ). Namun, dalam kasus lain komponen gula memainkan peran
langsung dalam aktivitas biologis glikoprotein (Tabel 2.8). HCG asli (Bab 11), misalnya, adalah
hormon gonadotropik glikosilasi berat. Penghapusan komponen gula yang biasanya
menghapuskan kemampuannya untuk menginduksi respon biologis, meskipun hormon ini
mengikat af fi nity untuk reseptor tetap tidak berubah, atau kadang-kadang benar-benar
meningkat. Protein terapeutik yang sekarang disetujui untuk penggunaan medis umum yang
glikosilasi tercantum pada Tabel 2.9. Rantai samping karbohidrat disintesis oleh keluarga enzim
yang dikenal sebagai glikosiltransferase , yang terletak terutama di retikulum endoplasma. Dua
jenis glikosilasi dapat terjadi: N-linked dan O-linked. Dalam kasus glikosilasi terkait-N, rantai
gula (oligosakarida) dilekatkan pada protein melalui atom nitrogen dari residu asparagin ( Asn ),
sedangkan dalam sistem terkait-O, rantai gula melekat pada atom oksigen hidroksil. kelompok,
biasanya residu serin atau theronine (Gambar 2.9). Monosakarida yang paling umum ditemukan
dalam rantai samping gula meliputi mannosa, galaktosa , glukosa, fucosa , N-
asetilgalaktosamin , N- asetilglukosamin , xilosa dan asam sialat . Ini dapat digabungkan
bersama dalam berbagai urutan dan oleh berbagai hubungan glikosidik . Karbohidrat kimia
glikoprotein, oleh karena itu, cukup kompleks. Struktur dua contoh rantai oligosakarida tersebut
disajikan pada Gambar 2.10. Glikosilasi terkait-N adalah sekuens spesifik , yang melibatkan
transfer rantai oligosakarida pra-sintesis ke residu asn yang ditemukan dalam sekuen
karakteristik Asn –X- Ser , atau Asn –X– Thr atau Asn –X- Cys , di mana X mewakili residu
asam amino, dengan pengecualian prolin . Penentu glikosilasi tambahan juga harus berlaku,
karena tidak semua situs terkait N potensial glikosilasi dalam beberapa protein. Pra-disintesis
oligosakarida rantai samping kemudian mengalami tambahan Glycosyltransferase -dimediasi
pemangkasan / modi fi kasi . Penentu glikosilasi terkait-O bahkan kurang dipahami dengan
baik. Pengenalan sekuen karakteristik tidak jelas dalam banyak kasus, dan fitur struktural tiga
dimensi mungkin lebih penting dalam hal ini. Beberapa protein glikosilasi akan ditandai oleh
satu atau lebih rantai samping gula N-linked, yang lain oleh satu atau lebih rantai samping O-
linked, dan yang lain oleh rantai N-dan O-linked. Manusia EPO (Bab 10), misalnya,
menampilkan tiga rantai samping gula yang terkait-N dan satu-terkait-O. Untuk setiap
glikoprotein, komposisi dan struktur yang tepat dari rantai samping karbohidrat dapat sedikit
berbeda dari satu molekul glikoprotein itu ke yang berikutnya. Ini menghasilkan heterogenitas
mikro yang dapat secara langsung divisualisasikan dengan teknik analitik seperti fokus
isoelektrik (Bab 7). Juga berkontribusi terhadap heterogenitas dapat menjadi glikosilasi situs
variabel, di mana beberapa situs glikosilasi tetap tidak dihuni dalam proporsi molekul
glikoprotein. Dasar keseluruhan heterogenitas kemungkinan karena faktor-faktor
seperti spesifik substrat glikosiltransferase dan fakta bahwa proporsi protein glikosilasi dapat
diekspor dari sel sebelum mereka sepenuhnya diproses oleh glikosiltransferase . Hampir semua
glikoprotein terapeutik, bahkan ketika diproduksi secara alami dalam tubuh, menunjukkan
heterogenitas seperti itu; misalnya, dua spesies manusia interferon-γ (IFN-γ), satu dari massa
molekul 20 kDa dan yang lain dari 25 kDa , berbeda satu sama lain hanya dalam derajat dan situs
glikosilasi (terkait-N). Lebih lanjut, pola glikosilasi yang diperoleh ketika glikoprotein manusia
diekspresikan dalam sistem ekspresi eukariotik non-manusia (misalnya kultur sel hewan)
biasanya agak berbeda dari pola glikosilasi yang terkait dengan protein manusia asli. Pola
glikosilasi tPA manusia yang diproduksi pada hewan transgenik, misalnya, berbeda dengan pola
yang diperoleh ketika gen yang sama diekspresikan dalam garis sel tikus rekombinan. Kedua
pola ini, pada gilirannya, berbeda dengan pola manusia asli. Klinis signifikan fi cance , jika ada,
pola glikosilasi diubah / microheterogeneity tidak selalu dapat diprediksi dan terbaik ditentukan
oleh uji klinis langsung. Jika produk tersebut ditemukan aman dan efektif, maka analisis kontrol
kualitas akhir produk rutin (QC) untuk mikro heterogenitas berbasis karbohidrat dilakukan lebih
untuk menentukan konsistensi batch-ke-batch (yang diinginkan) daripada untuk
mendeteksi mikro heterogenitas per se.
2.5.2 Karboksilasi dan hidroksilasi
γ-Karboksilasi dan β-hidroksilasi adalah karakteristik PTMs dari sejumlah protein, terutama
subset protein yang berfungsi dalam proses hemostatik . γ-karboksilasi memerlukan konversi
enzimatik rantai sisi spesifik c glutamat residu dalam protein sasaran, membentuk γ-
carboxyglutamate (konversi ' Glu residu' ke ' Gla residu'; Gambar 2.11a). β-
Hidroksilasi biasanya memerlukan hidroksilasi residu target aspartat (Asp) yang menghasilkan β-
hidroksiaspartat (Asp → Hya ; Gambar 2.11b). Kedua PTM membantu memediasi pengikatan
ion kalsium, yang penting / esensial untuk berfungsinya faktor darah VII, IX dan X secara
efektif, serta protein C yang diaktifkan dan protein S dari sistem antikoagulan (Bab 12).
2.5.3 Sulfasi dan midasi
Sulfation dan amidasi dua PTM tambahan karakteristik sejumlah kecil
biofarmasi. Sulfasi melibatkan perlekatan sulfat yang dikatalisis oleh enzim (SO42) Kelompok
untuk polipeptida sasaran, biasanya melalui spesifik c tirosin rantai samping. Sulfasi sering
memainkan peran dalam interaksi protein-protein, dan kurangnya sulfasi cenderung mengurangi
aktivitas polipeptida, yang bertentangan dengan penghapusan sepenuhnya. Protein terapeutik
penting yang tersulfasi dalam keadaan alami mereka termasuk hirudin antikoagulan (Bab 12) dan
faktor darah VIII dan IX. Bentuk rekombinan dari protein-protein ini yang dihasilkan oleh
rekayasa genetika umumnya telah mengurangi tingkat / tidak adanya sulfasi , tetapi mereka tetap
efektif secara terapi. Amidasi mengacu pada penggantian kelompok karboksil C-terminal protein
dengan kelompok amida (COOH → CONH2). PTM ini biasanya karakteristik peptida (rantai
sangat pendek asam amino), yang bertentangan dengan polipeptida lagi, tapi satu polipeptida
terapi (salmon kalsitonin, Bab 11) adalah amidated , dan amidasi diperlukan untuk fungsional
penuh aktivitas. Secara keseluruhan, fungsi-fungsi dari intermediasi tidak dipahami dengan baik,
meskipun dalam beberapa kasus setidaknya tampaknya berkontribusi terhadap stabilitas dan /
atau aktivitas peptida / polipeptida.