LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

STERILISASI ALAT, BAHAN DAN MEDIA SERTA

PEMBUATAN MEDIA UNTUK BIAKAN BAKTERI SECARA ASEPTIK

Disusun Oleh :
1. Anzaina Sukmawati 170106005
2. Azra Safira 170106006
3. Fikri Maulana Abdullah 170106014
4. Fitri Wahyu Widyawati 170106017
5. Ghalda Fadhila 170106020
Kelompok : 4 (empat) A
Prodi : Farmasi 2017
Tanggal praktikum : 15-Januari-2019
Tanggal pengumpulan : 22-Januari-2019

PROGRAM STUDI FARMASI

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH BANDUNG

2019
 STERILISASI ALAT, BAHAN DAN MEDIA SERTA
PEMBUATAN MEDIA UNTUK BIAKAN BAKTERI SECARA ASEPTIK

I. LATAR BELAKANG
Perlu kita ketahui, penghilangan mikroba dapat digunakan dengan cara
sterilisasi. Sterilisasi merupakan suatu proses menghilangkan, membersihkan
dan membunuh mikroorganisme hidup, termasuk bakteri dan sporanya, secara
kimia atau secara fisika. Fungsi dari sterilisasi ini yaitu agar bakteri-bakteri
yang berada pada alat, media dan bahan yang digunakan dalam praktikum ini
dapat steril dan tidak terkontaminasi mikroorganisme lainnya dari luar.
Terdapat tiga cara untuk melakukan sterilisasi ini yaitu mekanik, fisik dan
kimiawi. Dalam praktikum kali ini akan dijabarkan mengenai cara fisik yaitu
dengan Uap air panas bertekanan dan menggunakan alat khusus yaitu Autoklaf..
pada autoklaf termasuk dalam pengoperasian sterilisasi basah dimana pada
proses sterilisasinya memerlukan air. Tekanan yang digunakan pada autoklaf
ini umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu 121ºC. Lama sterilisasi
yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121ºC (Aryulina, D., 2006).
Dalam mengembangbiakkan mikroba diperlukan suatu substrat yang
disebut medium. Sedangkan medium itu sendiri sebelum digunakaan harus
dalam keadaan steril artinya tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak
diharapkan agar mikroba dapat tumbuh dan berkembangbiak dengan baik di
dalam medium, maka diperlukan syarat tertentu yang diantaranya bahwa
didalam medium harus terkandung semua unsur hara yang diperlukan untuk
pertumbuhan dan perkembangan mikroba kemudian susunan makanannya,
tekanan osmosis, keasaman (pH), temperature, sterilisasi (Schlegel, 1994).
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi juga harus
dalam keadaan steril atau bebas dari kuman serta bakteri, virus dan jamur.
Untuk mensterilkannya diperlukan pula pengetahuan tentang teknik sterilisasi.
Hal ini dilakukan karena alat-alat yang digunakan pada laboratorium
mikrobiologi memiliki teknik sterilisasi yang berbeda. Berdasarkan hal
tersebut, maka dilakukanlah percobaan ini untuk mengetahui teknik
 pengenalan, penyiapan dan penggunaan serta fungsi dan prinsip kerja setiap alat
laboratorium mikrobiologi. Selain itu pula untuk mengetahui teknik sterilisasi
dari alat, bahan dan media (Pratiwi, 2008).
Hal yang melatar belakangi dilakukan percobaan ini untuk mengetahui
cara sterilisasi alat bahan dan media. Pada praktikum ini digunakan media Luria
Bertani karena Luria Bertani adalah medium yang kaya akan nutrisi, terutama
digunakan untuk menumbuhkan berbagai jenis bakteri (Luria, 1957).

II. TUJUAN
2.1 Mengetahui teknik sterilisasi alat-alat dan bahan yang akan digunakan
dalam pemeriksaan secara mikrobiologi.
2.2 Mengetahui pembuatan media dalam bentuk padat (Luria Bertani Agar)
dan dalam bentuk cair (Luria Bertani Borth) serta pembuatan larutan
pengencer Natrium Klorida Fisiologis 0,9% b/v.
2.3 Mengetahui cara sterilisasi pada media padat (Luria Bertani Agar) dan
media cair (Luria Bertani Borth) dengan menggunakan autoklaf.
2.4 Mengetahui cara pembuatan media pada plat agar, agar miring, agar
tegak, dan media cair dalam tabung secara aseptis.

III. TEORI DASAR

Sterilisasi merupakan proses untuk menghilangkan semua mikroba

(termasuk endospora) yang dilakukan dengan panas, kimia, maupun radiasi.
Sterilisasi dengan panas dapat dilakukan dengan sterilisasi basah dan sterilisasi
kering. Sterilisasi basah contohnya adalah autoklaf (Coldman dan Green, 2009).

Autoklaf digunakan untuk sterilisasi basah melalui panas uap air yang
tinggi serta bertekanan. Panas dan tekanan yang digunakan secara bersamaan
membuat proses sterilisasi lebih mudah. Autoklaf banyak digunakan untuk
sterilisasi mikroba yang tahan panas dan tekanan. Sterilisasi yang dihasilkan
adalah konstan (Dolphin, 2008).

Media adalah suatu substrat makanan yang diperlukan untuk

pertumbuhan dan perkembangan mikroba. Sterilisasi dilakukan dengan
menggunakan autoklaf dengan tekanan uap air hingga suhu mencapai 121ºC
dan tekanan 1 atm selama ± 15 menit. Hal ini bertujuan agar dapat
meminimalisasi tumbuhnya mikroba pencemar. Untuk menumbuhkan kultur
dalam suatu media, diperlukan beberapa kriteria-kriteria atau persyaratan yaitu
media yang digunakan harus mengandung semua unsur hara yang diperlukan
oleh mikroorganisme. Hal tersebut dikarenakan supaya mikroorganisme dapat
tumbuh dan berkembang dengan optimum dalam media. Selain itu, media
harus memiliki tekanan osmosis, tegangan permukaan, dan pH yang sesuai
dengan kebutuhan mikroba, media tidak mengandung zat-zat yang dapat
menghambat pertumbuhan mikroba dan media harus dalam keadaan steril
(tidak ditumbuhi dengan mikroba lain yang tidak diharapkan) agar kultur
mikroba yang dihasilkan tidak terkontaminasi (Suriawiria, 2005).

Pada pembuatan media padat di cawan petri, medium Luria Bertani

Agar yang akan dituangkan tidak boleh memiliki suhu yang terlalu tinggi. Hal
tersebut akan menyebabkan kondensasi air yang berlebihan pada tutup cawan
petri sehingga air tersebut akan kembali menitik atau menetes pada permukaan
agar yang telah memadat. Selain itu, pemindahan medium dari tabung reaksi ke
cawan petri harus dilakukan secara aseptis, untuk mencegah tercemarnya
biakan murni, yaitu biakan yang hanya terdiri dari satu spesies tunggal
(Hadioetomo, 1993, 52:163).

Media cair biasanya diletakkan di dalam tabung reaksi dengan keadaan

tegak dan ditutup dengan kapas agar tidak tumpah. Terdapat tiga macam media
dalam bentuk padat, yaitu: Media agar terletak di dalam tabung reaksi dalam
posisi tegak hingga memadat. Media agar miring adalah media agar padat yang
disiapkan langsung dalam tabung reaksi. Namun berbeda dengan agar tegak,
setelah disterilisasi, tabung reaksi diletakkan di atas alas sehingga membentuk
sudut ± 15° hingga memadat. Dengan permukaan yang miring tentunya luas
permukaan media agar miring akan lebih luas dari media agar tegak. Hal
tersebut bertujuan agar mikroorganisme yang tumbuh pada media semakin
banyak dan jumlahnya tersebar sesuai dengan luas permukaan media agar
miring. Media agar cawan adalah agar padat yang menggunakan cawan petri
sebagai wadahnya. Saat menuang media (agar dalam keadaan cair) ke dalam
 cawan harus dilakukan secara aseptik dengan suhu media tidak boleh terlalu
panas (± 45°C) (Gunawan, 2008).

Aseptik sangat diperlukan untuk menghindari mikrrorganisme dari

kontaminan yang dapat menghambat pertumbuhna mikroba. Teknik aseptis
digunkan sepanjang kegiatan berlangsumg baik alat, bahan, lingkungan maupun
praktikannya, pengasaan teknik aseptik ini sangat diperlukan dalam
keberhasilan laboratorium mikrobiologi (Oram, 2001).

IV. ALAT DAN BAHAN

Tabel 1. Alat Tabel 2. Bahan
No. Alat No. Bahan
1 Autoklaf 1 Alumunium foil
2 Batang pengaduk 2 Kapas berlemak
3 Botol media 3 Tali kasur
4 Bunsen 4 Kertas timbangan
5 Cawan petri 5 Kertas label
6 Erlenmeyer 6 Lap tangan
7 Gelas ukur 7 Kain kassa
8 Gunting 8 Media Luria Bertani (LB) cair
9 Jarum ose 9 Natrium klorida (NaCl)
10 Kaki tiga 10 Media Luria Bertani (LB) padat
11 Kassa asbes
12 Labu takar
13 Oven
14 Pipet ukur
15 Rak tabung reaksi
16 Spatel
17 Timbangan listrik
18 Pinset
19 Tabung reaksi

V. CARA KERJA
5.1 Persiapan Dan Sterilisasi Alat
Alat-alat yang akan disterilkan, dicuci bersih terlebih dahulu dan
dikeringkan. Kemudian untuk alat yang mempunyai mulut seperti tabung
reaksi, erlenmayer, gelas ukur, labu ukur dan gelas kimia di tutup dengan
kapas berlemak yang dilapisi menggunakan kassa. Setelah itu dibungkus
 kembali menggunakan alumunium foil dan plastik wrap kemudian diikat
menggunakan tali kasur. Khusus untuk alat-alat yang permukaannya harus
steril seperti pipet dan batang pengaduk dibungkus seluruhnya
menggunakan alumunium foil dan plastik wrap, untuk cawan petri
dibungkus menggunakan perkamen lebar lalu diikat dengan tali kasur
kemudian dimasukkan kedalam plastik dan dilapisi dengan plastik warp.
Sedangkan untuk karet pipet tetes dan bulb pipet volume direndam
menggunakan alkohol 70% di gelas kimia. Alat dan bahan lainnya seperti
lap dan tissu yang akan digunakan pada saat praktikum perlu disterilkan
dengan cara dimasukkan ke dalam plastik dan dilapisi plastik wrap. Alat-
alat yang berpresisi dan tidak berpresisi seperti diatas disterilisasi
menggunakan autoklaf pada suhu 121oC pada tekanan 0,15 ppm selama
15-20 menit lalu dikeringkan. Alat-alat yang sudah steril diberi label dan
disimpan.

5.2 Pembuatan Dan Sterilisasi Media Serta Larutan Pengencer

Luria Bertani mengandung komposisi Natrium klorida 1%, Pepton
1% dan Yeast Extrak 0,5%. Bahan-bahan ditimbang yaitu Natrium
Klorida sebanyak 100 mg, pepton 100,2 mg dan Yeast Ektrak 50 mg,
setelah semua ditimbang dimasukkan kedalam erlenmayer dan
dilarutkaan menggunakan aquadest sebanyak 10 mL. Kemudian media
cair yang sudah dilarutkan dibagi menjadi 2 bagian ke dalam tabung reaksi
masing-masing sebanyak 5 mL, lalu ditutup menggunakan kapas
berlemak yang dilapisi kain kassa kemudian dilapisi kembali dengan
alumunium foil dan plastik warp serta diikat dengan tali kasur. Sedangkan
untuk pembuatan media padat ditimbang yeast ekstrak sebanyak 250 mg,
peptone 500,3 mg, Natrium Klorida 500 mg dan agar 750 mg, kemudian
dimasukkan kedalam erlenmayer dan dilarutkan menggunakan aquadest
sebanyak 50 mL, lalu dipanaskan diatas nyala api bunsen sambil diaduk
hingga larutan jernih. Media yang sudah dipanaskan dibiarkan suhunya
hingga suhu kamar dan mulut tabung ditutup menggunakan gulungan
kapas berlemak yang dilapisi kain kassa kemudian dilapisi kembali
 dengan alumunium foil dan plastik warp serta diikat dengan tali kasur.
Setiap wadah media diberi tanda atau label. Semua peralatan dan media
serta larutan pengencer yang telah dibuat kemudian disterilisasi
menggunakan autoklaf pada suhu 121oC dengan pada tekanan 0,15 ppm
dengan waktu waktu 15 menit. Setelah media selesai disteril media
dibiarkan pada suhu kamar. Pada media padat disimpan diwaterbath.

5.3 Pembuatan Plat Agar, Agar Miring, Agar Tegak Dan Media Cair
Bunsen dinyalakan sehingga mencapai api biru untuk memperoleh
daerah steril, dibiarkan menyala selama percobaan dilakukan. Tabung
reaksi steril diletakkan pada rak tabung dan cawan petri steril diantara
nyala api. Pada pembuatan plat agar dibuat menjadi 2 bagian cawan petri
masing-masing sebanyak 20 mL, dilakukan dengan cara media Luria
Bertani agar yang telah dibuat diambil dari waterbath (yang telah cair dan
suhunya 50ºC), kemudian diukur menggunakan gelas ukur steril sebanyak
20 mL dan dimasukkan kedalam cawan petri steril, dibiarkan memadat.
dilapisi plastik warp pada sekelilingnya dan diberi label. Pada pembuatan
agar miring, media Luria Bertani agar dengan suhu 50ºC diukur
menggunakan gelas ukur sebanyak 3 mL, lalu dimasukkan kedalam
tabung reaksi steril, kemudian diletakkan miring pada papan pembentuk
agar miring dan biarkan memadat. Pada pembuatan agar tegak, media
Luria Bertani agar dengan suhu 50ºC diukur menggunakan gelas ukur
sebanyak 5 mL lalu dimasukkan kedalam tabung reaksi steril, kemudian
diletakkan di rak tabung agar tetap tegak dan biarkan memadat. Pada agar
miring dan agar tegak ditutup menggunakan gulungan kapas berlemak
yang dilapisi kain kassa dilapisi kembali dengan alumunium foil dan
plastik wrap lalu diberi label. Pada media cair, sudah dimasukkan media
Luria Bertani Cair sebanyak 5 mL, lalu dimasukkan kedalam tabung
reaksi steril. Setelah itu media diamati selama 3 hari untuk melihat terjadi
kontaminasi atau tidak pada media yang telah dibuat.
VI. DATA DAN PERHITUNGAN
6.1 Data Hasil Pengamatan
Tabel 3. Hasil Pengamatan Media

Kondisi
Nama media dan
Hari ke-1 Hari ke-2
larutan pengencer Hari ke- 3
Rabu, 16-01- Kamis, 17-01-
Jum’at, 18-01-2019
2019 2019
Plat agar 1 Media tidak Media Media terkontaminasi
Luria bertani agar terkontaminasi terkontaminasi bakteri berbentuk
bakteri lingkaran menyebar
berbentuk sebanyak 3 bagian
lingkaran kecil berwarna putih
Plat agar 2 Media tidak Media tidak Media tidak
Luria bertani agar terkontaminasi terkontaminasi terkontaminasi
Agar miring Media tidak Media tidak Media tidak
Luria bertani agar terkontaminasi terkontaminasi terkontaminasi
Agar tegak Media tidak Media tidak Media tidak
Luria bertani agar terkontaminasi terkontaminasi terkontaminasi
Media cair 1 Media tidak Media tidak Media tidak
Luria bertani broth terkontaminasi terkontaminasi terkontaminasi
Media cair 2 Media tidak Media tidak Media tidak
Luria bertani broth terkontaminasi terkontaminasi terkontaminasi

6.2 Perhitungan
Diketahui : LB (Luria Bertani) dengan komposisi:
- Natrium klorida 1%
- Peptone 1%
- Yeast ektrak 0,5 %
Natrium Klorida fisiologis 0,9 %
Agar 1,5%
Ditanya: - Media Luria Bertani padat 50 mL?
- Media Luria Bertani cair 10 mL?
- Natrium klorida Fisiologis 5 mL?
Jawab:
 Luria bertani pada media padat
1 gram
Natrium klorida 1% = x 50 mL = 0,5 gram
100 mL
 1 gram
Peptone 1% = x 50 mL = 0,5 gram
100 mL

0,5 gram
Yeast ektrak 0,5% = x 50 mL = 0,5 gram
100 mL
1,5 gram
Agar 1,5 % = x 50 mL = 0,75 gram
100 mL

Aquades 50 mL

 Luria bertani (LB) pada media cair

1 gram
Natrium klorida 1% = x 10 mL = 0,1 gram
100 mL

1 gram
Peptone 1% = x 10 mL = 0,1 gram
100 mL

0,5 gram
Yeast ektrak 0,5% = x 10 mL = 0,05 gram
100 mL

Aquades 10 mL
0,9 gram
 Natrium klorida fisioogis 0,9 % = x 5 mL = 0,045 gram
100 mL

VII. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini, dilakukan suatu percobaan sterilisasi alat,
bahan dan media. Sterilisasi yaitu proses menghilangkan dan pemusnahan
bakteri dengan cara membunuh mikroorganisme suatu bahan atau benda. Bahan
ataupun peralatan yang dipergunakan di dalam mikrobiologi, harus dalam
keadaan steril. Artinya, pada bahan atau peralatan tersebut tidak terdapat
mikroba yang akan mengganggu atau merusak media ataupun mengganggu
proses yang sedang dikerjakan.

Pada percobaan sterilisasi alat, bahan dan media. Pertama-tama alat

yang akan disterilkan, dicuci bersih terlebih dahulu dan dikeringkan. Kemudian
untuk alat yang mempunyai mulut seperti tabung reaksi, erlenmayer, gelas ukur,
dan labu ukur ditutup dengan kapas berlemak yang dibungkus kain kassa. Kapas
berlemak berfungsi untuk menahan uap air yang masuk dan sebagai penguji
kebutuhan bakteri terhadap udara atau kebutuhan oksigen terhadap
pertumbuhan bakteri atau mikroorganisme, sedangkan kassa berfungsi untuk
menghindari terjadinya uap air masuk kedalam alat gelas yang dapat
menyebabkan kontaminasi pada saat melakukkan sterilisasi basah
menggunakan autoklaf. Setelah itu dibungkus kembali menggunakan
alumunium foil dan plastik wrap yang bertujuan agar semua alat yang di
sterilkan benar-benar steril dari mikroba sehingga tidak ada lagi spora atau
mikroba yang masuk. Kemudian diikat dengan menggunakan tali kasur agar
tidak lepas pada saat tekanan uap autoklaf meningkat. Sedangkan untuk alat-
alat yang permukaannya harus steril seperti pipet dan batang pengaduk di
bungkus satu persatu dengan alumunium foil dan plastik wrap.Cawan petri
dibungkus menggunakan perkamen lebar yang berfungsi untuk mencegah
terjadinya kontaminasi pada waktu pendinginan atau penyimpanan, lalu diikat
dengan tali kasur kemudian dimasukkan kedalam plastik dan dilapisi dengan
plastik warp. Karet pipet tetes dan bulb pipet volume disterilkan dengan cara di
rendam menggunakan cairan alkohol 70% didalam gelas kimia. Alkohol 70%
berfungsi sebagai cairan yang mengandung 70% etil alkohol (CH3CH2OH) dan
30% air. Etil alkohol (etanol) membunuh bakteri melalui 2 cara, yakni
denaturasi protein dan pelarutan membran lemak. Protein merupakan salah satu
penyusun dari sel bakteri. Kerja alkohol ini akan lebih efektif jika ada air
didalamnya. Alkohol 70% merupakan campuran antara alkohol sebanyak 70%
volume dan air 30% volume (v/v) dan pada alkohol yang konsentrasinya sangat
tinggi hanya akan mampu mendenaturasi protein diluar sel bakteri. Tidak
mampu menembus membrane sel bakteri dan mendenaturasi protein di dalam
sel bakteri yang sebenarnya merupakan target utamanya. Alat dan bahan
lainnya seperti lap dan tissu yang akan digunakan pada saat praktikum perlu
disterilkan dengan cara dimasukkan kedalam plastik yang dilapisi plastik wrap
untuk dilakukan sterilisasi. Alat-alat yang berpresisi dan tidak berpresisi
disterilisasi menggunakan autoklaf. Autoklaf termasuk dalam pengoperasian
sterilisasi basah dimana pada proses sterilisasinya memerlukan air.Tekanan
yang digunakan pada autoklaf ini umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan
dengan suhu 121oC selama 15-20 menit. Alasan digunakan suhu 121ºC atau
249,80F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan
15 psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air
mendidih pada suhu 1000 ºC, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di
ketinggian sama, menggunakan tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada
suhu 121ºC.

Prinsip kerja autoklaf yaitu saat sumber panas mulai dinyalakan, air di
dalam autoklaf akan mulai mendidih. Air yang digunakan untuk sterilisasi yaitu
akuades karena akuades adalah air destilasi hasil penyulingan satu kali yang
memiliki kandungan senyawa lebih sedikit dibanding air keran, sehingga dapat
mencegah kerak dan karat serta meminimalisir terjadinya kontaminasi saat
sterilisasi. Uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Jika
udara telah terganti uap air, katup udara atau katup uap akan ditutup sehingga
tekanan di dalamnya semakin bertambah. Saat tekanan telah mencapai suhu
sesuai, proses sterilisasi dimulai dan timer akan mulai menghitung mundur.
Setelah proses selesai dijalankan, sumber panas akan langsung dimatikan dan
tekakan akan kembali turun secara perlahan hingga suhunya mencapai 0ºC.
Demikian prinsip kerja autoklaf dalam mensterilkan aneka peralatan. Berikut
adalah cara menggunakan autoklaf untuk mensterilkan aneka peralatan serta
bahan tertentu :

1. Sebelum melakukan sterilisasi, dicek terlebih dahulu air yang tertampung

dalam autoklaf. Apabila air yang ada ternyata masih kurang dari batas
minimum, maka tambahkan lagi air hingga mencapai batas tersebut.
Sebaiknya gunakan air yang merupakan hasil destilasi guna menghindari
kerak serta karat.
2. Masukkan peralatan dan juga bahan yang hendak disterilkan.
3. Ditutup autoklaf rapat-rapat dan kencangkan baut pengaman supaya tak ada
uap keluar dari bibir autoklaf. Jangan kencangkan klep pengaman terlebih
dahulu.
4. Nyalakan autoklaf dan atur timer minimal 15 menit di suhu 121 ºC. Timer
ini tentunya akan berfungsi guna mengatur lama atau sebentar proses yang
dijalankan sesuai kebutuhan pengguna.
5. Tunggu hingga air mendidih agar uapnya memenuhi seluruh bagian
autoklaf. Setelah itu kencangkan klep pengaman dan tunggu hingga
prosesnya selesai. katup pengamanan berfungsi untuk mengunci penutup
 autoklaf. Perhitungan 15 menit baru dimulai pada saat tekanan mencapai 2
atm.
6. Apabila alarm telah berbunyi dan menandakan proses telah selesai, tunggu
sampai tekanan dalam kompartemen mulai turun dan menjadi sama dengan
tekanan udara pada lingkungan. Buka klep-klep pengaman lalu keluarkan
isi autoklaf secara hati-hati.

Pada percobaan kedua yaitu pembuatan dan sterilisasi media serta

larutan pengencer. Pada percobaan ini akan dilakukan cara membuat medium
pertumbuhan mikroba. Media yang akan dibuat yaitu media cair dan media
padat. Media padat sangat baik untuk memisahkan campuran mikroorganisme
sehingga masing-masing jenisnya menjadi terpisah. Sedangkan Medium cair
merupakan media yang tidak ditambahkan agar sehingga bersifat cair yang
berfungsi untuk proses metabolik dan pertumbuhan mikrobia serta mengetahui
kebutuhan O2 pada mikrobia. Pada percobaan ini, medium pertumbuhan yang
dibuat adalah Luria-Bertani (LB) yang digunakan untuk membiakkan kultur
murni bakteri. Medium Luria Bertani dibuat dengan komposisi yang berbeda-
beda. Media Luria Bertani yang dibuat ada dua yaitu Luria Bertani cair dan
Luria Bertani padat. Pada percobaan ini, Luria Bertani mengandung komposisi
Natrium klorida 1%, Pepton 1% dan Yeast Extrak 0,5% yang digunakan
sebagai bahan dasar untuk membuat media Luria Bertani cair. Bahan dasar
memiliki fungsi masing-masing untuk pertumbuhan mikroba yang akan diuji.
Pepton berfungsi sebagai sumber protein, karbon dan nitrogen, Yeast Ekstrak
berfungsi sebagai sumber karbohidrat dan memberi suplai vitamin bahan
organik seperti asam lemak dan Natrium Klorida sebagai sumber garam mineral
dan ion-ionnya diperlukan untuk pertumbuhan bakteri dan menjaga tekanan
osmotik sel bakteri agar tidak pecah. Ketiga bahan ini nanti akan diperlukan
oleh mikroba untuk nutrisinya. Bahan ditimbang untuk membuat larutan
pengencer Natrium Klorida fisiologis 0,9% b/v sebanyak 450 mg dan aquadest
sebanyak 5 mL. Bahan-bahan ditimbang untuk pembuatan Luria Bertani Cair
sebanyak 10 mL yaitu Natrium klorida 1% sebanyak 100 mg, pepton 1%
sebanyak 100 mg dan yeast extrak 0,5% 50 mg dan akuades sebanyak 10 mL.
Sedangkan untuk pembuatan media Luria Bertani padat sebanyak 50 mL,
ditimbang semua bahan yaitu Natrium klorida 1% sebanyak 500 mg, Pepton 1%
sebanyak 500 mg dan Yeast Extrak 0,5% 250 mg. Selain itu dalam pembuatan
media padat digunakan agar 1,5% sebanyak 750 mg dan akuades sebanyak 50
mL. Penggunaan agar merupakan suatu bahan yang cocok, meskipun padat,
akan tetapi lunak dan mudah ditembus oleh biakan. Selain itu agar mengandung
sejumlah air yang diperlukan bagi biakan dan berfungsi sebagai pemadatnya.
Bahan yang bersifat higroskopis merupakan bahan yang dapat menyerap atau
berekasi dengan air dari udara, mudah menguap seperti Pepton, Yeast ekstrak
dan Natrium Klorida ditimbang menggunakan alumunium foil di atas neraca
digital. Bahan yang telah ditimbang dimasukkan kedalam erlenmeyer yang
sudah diberi tanda sesuai dengan nama media. Pada media Luria Bertani Padat
dipanaskan diatas nyala api bunsen sambil diaduk menggunakan batang
pengaduk hingga larutan jernih, Pemanasan berfungsi untuk mempercepat
reaksi. Media yang sudah dipanaskan dibiarkan suhunya hingga suhu kamar,
lalu mulut labu erlenmeyer ditutup menggunakan kapas berlemak yang dilapisi
kassa dan alumunium foil serta diikat dengan menggunakan tali kasur. Setiap
wadah media diberi tanda atau label. Semua peralatan dan media serta larutan
pengencer yang telah dibuat kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada
suhu 121oC pada tekanan 0,15 ppm dengan waktu waktu 15 menit. Setelah
media steril, media dibiarkan pada suhu kamar. Pada media Luria Bertani padat
disimpan diwaterbath, waterbath berfungsi untuk menyimpan media agar
media tetap dalam kondisi leleh atau cair dan tidak memadat, biasanya suhu
diatur pada kisaran 40-50ºC.

Pada percobaan ketiga yaitu pembuatan plat agar, agar miring, agar
tegak dan media cair dalam tabung reaksi secara kerja aseptis. Pertama-tama
bunsen dinyalakan dan api bunsen diatur sehingga diperoleh nyala api biru
untuk memperoleh daerah steril. Bunsen berfungsi untuk menciptakan kondisi
yang steril. Api yang menyala dapat membuat aliran udara karena oksigen
dikonsumsi dari bawah dan diharapkan kontaminan ikut terbakar dalam pola
aliran udara tersebut. Bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya
dalam sterilisasi adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas) dibiarkan
menyala selama percobaan dilakukan. Kerja Aseptis dilakukan pada radius 20
cm untuk melindungi praktikan dari mikroorganisme patogen maupun non
patogen. Tabung reaksi steril diletakkan pada rak tabung reaksi dan cawan petri
steril diantara nyala api. Pada pembuatan plat agar dibuat menjadi 2 bagian
cawan petri masing-masing sebanyak 20 mL, dilakukan dengan cara media
Luria Bertani agar yang telah dibuat diambil dari waterbath (yang telah cair dan
suhunya 50ºC), Suhu berada dalam 50ºC karena setelah di sterilisasi
menggunakan autoklaf dengan suhu 121ºC, apabila langsung didiamkan pada
suhu ruangan akan menyebabkan agar mudah mengeras karena suhu ruangan
terlalu ektrem, Bila suhu 50ºC agar masih berada dalam kondisi cair. Kemudian
diukur menggunakan gelas ukur steril sebanyak 20 mL dan dimasukkan
kedalam cawan petri steril. Cawan petri berfungsi untuk membiakkan
mikroorganisme. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan
bagian atas sebagai penutup dan biarkan memadat. Setelah memadat cawan
petri diflambir kemudian dilapisi plastik warp pada sekelilingnya dan diberi
label. Pada pembuatan media padat di cawan petri, medium Luria Bertani Agar
yang akan dituangkan tidak boleh memiliki suhu yang terlalu tinggi. Hal
tersebut akan menyebabkan kondensasi air yang berlebihan pada tutup cawan
petri sehingga air tersebut akan kembali menitik atau menetes pada permukaan
agar yang telah memadat. Pada pembuatan agar miring, media Luria Bertani
agar dengan suhu 50ºC diukur menggunakan gelas ukur sebanyak 3 mL, lalu
dimasukkan kedalam tabung reaksi steril, kemudian diletakkan miring pada
papan pembentuk agar miring dan biarkan memadat, lalu ditutup menggunakan
gulungan kapas berlemak yang dilapisi kassa dan ditutup kembali
menggunakan alumunium foil dan plastik wrap lalu diberi label. Dengan
permukaan yang miring tentunya luas permukaan media agar miring akan lebih
luas dari media agar tegak. Hal tersebut bertujuan agar mikroorganisme yang
tumbuh pada media semakin banyak dan jumlahnya tersebar sesuai dengan luas
permukaan media agar miring. Pembuatan agar tegak, media Luria Bertani agar
dengan suhu 50ºC diukur menggunakan gelas ukur sebanyak 5 mL lalu
dimasukkan kedalam tabung reaksi steril, kemudian diletakkan di rak tabung
agar tetap tegak dan biarkan memadat, lalu ditutup menggunakan gulungan
kapas berlemak yang dilapisi kassa dan ditutup kembali menggunakan
alumunium foil dan plastik wrap lalu diberi label. Pada pembuatan media cair,
media Luria Bertani Cair diukur menggunakan gelas ukur sebanyak 5 mL, lalu
dimasukkan kedalam tabung reaksi steril. Setelah semua media dibuat,
kemudian media diamati selama 3 hari untuk melihat terjadi kontaminasi atau
tidak pada media yang telah dibuat.

Dalam percobaan ini, kerja dilakukan secara aseptis. Hal ini bertujuan
untuk menghindari kemungkinan terjadinya kontaminasi dengan mikroba yang
digunakan. Kerja aseptis dari percobaan ini dapat dilihat contohnya yaitu saat
sterilisasi seperti membakar ujung tabung reaksi,cawan petri yang di flambir,
melakukan sterilisasi dengan autoklaf pada alat sebelum praktikum,
menggunakan masker, menggunakan sarung tangan, serta mencuci tangan
dengan alkohol.

Pada hasil pengamatan terhadap medium yang telah disterilkan dari hari
pertama hingga hari ketiga. Pada hari pertama untuk media plat agar, agar
miring, agar tegak dan media cair tidak terdapat mikroba dan tidak terjadi
perubahan fisik seperti perubahan warna, tidak berbau, tidak terlihat permukaan
medium yang tidak ditumbuhi oleh koloni mikroba. Hal ini menunjukkan
bahwa medium tidak terjadi kontaminasi mikroba, tetapi pada hari kedua dan
ketiga pada plat agar 1 terjadi perubahan fisik pada medium tersebut. Terjadinya
perubahan fisik menunjukkan bahwa medium terkontaminan atau terdapat
mikroorganisme dan tidak dapat digunakan untuk biakan bakteri pada
praktikum selanjutnya.

Faktor-faktor yang memungkinkan terjadinya kontaminasi media

adalah sterilisasi media yang kurang sempurna, lingkungan laboratorium yang
kurang steril, media memenuhi semua kebutuhan nutrient, dan proses
praktikum yang tidak aseptis. Kemampuan mikroorganisme untuk tumbuh dan
tetap hidup merupakan suatu hal yang penting untuk diketahui. Pengetahuan
tentang faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba sangat penting
di dalam mengendalikan mikroba. Berikut ini faktor-faktor penting yang
mempengaruhi pertumbuhan mikroba:
 Suhu atau Temperatur
Suhu merupakan salah satu faktor penting di dalam mempengaruhi dan
pertumbuhan mikroorganisme. Suhu dapat mempengaruhi mikroba dalam
dua cara yang berlawanan:
1. Apabila suhu naik atau turun secara drastis, tingkat pertumbuhan akan
terhenti, kompenen sel menjadi tidak aktif dan rusak, sehingga sel-sel
menjadi mati.
2. Apabila suhu naik maka kecepatan metabolisme naik dan pertumbuhan
dipercepat. Sebaliknya apabila suhu turun, maka kecepatan
metabolisme akan menurun dan pertumbuhan diperlambat.
Berdasarkan hal di atas, maka suhu yang berkaitan dengan
pertumbuhan mikroorganisme digolongkan menjadi tiga, yaitu: Suhu
minimum yaitu suhu yang apabila berada di bawahnya maka pertumbuhan
terhenti. Suhu optimum yaitu suhu dimana pertumbuhan berlangsung paling
cepat dan optimum. (Disebut juga suhu inkubasi) Suhu maksimum yaitu
suhu yang apabila berada di atasnya maka pertumbuhan tidak terjadi.
 Keasaman atau Kebasaan (pH)
Setiap organisme memiliki kisaran pH masing-masing dan memiliki
pH optimum yang berbeda-beda. Kebanyakan mikroorganisme dapat
tumbuh pada kisaran ph 8,0 – 8,0 dan nilai pH di luar kisaran 2,0 sampai
10,0 biasanya bersifat merusak.
 Suplai Nutrisi
Mikroba memerlukan suplai nutrisi sebagai sumber energi dan
pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebut adalah karbon, nitrogen,
hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi dan sejumlah kecil logam lainnya.
Ketiadaan atau kekurangan sumber-sumber nutrisi ini dapat mempengaruhi
pertumbuhan mikroba hingga pada akhirnya dapat menyebabkan kematian.
Kondisi tidak bersih dan hygenis pada lingkungan adalah kondisi yang
menyediakan sumber nutrisi bagi pertumbuhan mikroba sehingga mikroba
dapat tumbuh berkembang di lingkungan seperti ini. Oleh karena itu, prinsip
daripada menciptakan lingkungan bersih dan hygenis adalah meminimalisir
sumber nutrisi bagi mikroba agar pertumbuhannya terkendali.
VIII. KESIMPULAN
8.1 Dapat melakukan teknik sterilisasi alat, bahan dan media yang akan
digunakan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC dengan
tekanan 0,15 ppm selama 15-20 menit.
8.2 Dapat melakukan pembuatan media dalam bentuk padat (Luria Bertani
Agar) sebanyak 50 mL dan dalam bentuk cair (Luria Bertani Borth)
sebanyak 10 mL serta pembuatan larutan pengencer Natrium Klorida
Fisiologis 0,9% b/v sebanyak 5 mL.
8.3 Dapat melakukan pembuatan media pada plat agar sebanyak 20 mL, agar
miring sebanyak 3 mL, agar tegak sebanyak 5 mL, dan media cair
sebanyak 5 mL dalam tabung secara aseptis.
8.4 Dari hasil pengamatan pada hari pertama didapat plat agar, agar miring,
agar tegak, dan media cair tidak terkontaminasi oleh bakteri. Pada hari
kedua dan ketiga plat agar sudah terkontaminasi oleh bakteri, sedangkan
agar miring, agar tegak dan agar cair tidak terkontaminasi.
 DAFTAR PUSTAKA

Coldman, E. dan L. H. Green. 2009. Practical Handbook of Microbiology 2nd

Edition. CRC Pres: London.
Diah, Aryulina. 2006. Biolog Jilid 1Untuk SMA. Erlangga: Jakarta.
Dolphin, W. D. 2008. Biological Investigation: Form, Function, Diversity, and
Process 8th Edition.McCraw-Hill Companies Inc: New York.
Gunawan, Agustin Wydia. 2008. Usaha Pembibitan Jamur Cetakan ke-8.
Penebar Swadaya: Jakarta.
Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek Teknik dan
Prosedur Dasar Laboratorium. PT. Gramedia: Jakarta.
Luria, SE, Burrous, JW. (1957).” Hibridasi antara Escheria coli dan Shigella”.
J Bacteriol. 74 (4): 461-476. Diakses pada tanggal 19 januari 2019.
Oram, R.F. S., Paul. J. Hummer, Jr.2001. Biology Living System. Glencoe
Division. Mc Millan Company. Waterville.
Pratiwi, ST. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga: Yogyakarta.
Schlegel. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Universitas Indonesia
Press. Jakarta.
Suriawiria, H. U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Penerbit Papas Sinar Sinanti:
Jakarta.
 LAMPIRAN
 Pengamatan Hari ke-1 Rabu, 16-01-2019

Gambar 1. Media plat agar Gambar 2. Media agar cair

Gambar 3. Media agar miring Gambar 4. Media agar tegak

 Pengamatan Hari ke-2 Kamis, 17-01-2019

Gambar 5. Media plat agar Gambar 6. Media agar tegak

 Gambar 7. Media agar cair Gambar 8. Media agar miring
 Pengamatan Hari ke-3 Jum’at, 19-01-2019

Gambar 9. Media plat agar

Gambar 10. Media agar miring dan agar tegak

Gambar 11. Media agar cair