KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas
berkat dan pertolongan-Nya penulis dapat menyelesaikan makalah ini
tepat pada waktunya. Makalah ini disusun untuk memenuhi tugas mata
kuliah Teknologi Sediaan Steril. Dalam makalah ini, penulis membahas
mengenai uji pirogen dari sediaan steril.
Makalah ini dapat diselesaikan tak luput oleh adanya dorongan serta
bantuan baik secara materiil maupun moril kepada penulis. Oleh karena
itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang
membantu dalam proses pembuatan makalah ini,
Penulis berharap makalah ini dapat bermanfaat bagi pembaca.
Namun, penulis menyadari makalah ini jauh dari sempurna karena itu
penulis memohon maaf apabila terdapat kesalahan yang kurang
berkenan. Selain itu, penulis juga mengharapkan kritik dan saran yang
membangun. Terima kasih.

Makassar, Maret 2020

Penulis
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR…………………………………………
DAFTAR ISI………………………………………………………
BAB I PENDAHULUAN…………………………………………
1.1. Latar Belakang………………………………………………..
1.2. Rumusan Masalah.................................................................
1.3. Tujuan Penulis..........................................................
BAB II ISI….......................…………………………………….........

BAB III PENUTUP………………………………………………………...

3.1. Kesimpulan………………………………………………………
DAFTAR PUSTAKA.............................................................................
 BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Sediaan steril memiliki beberapa kriteria, seperti bebas dari

mikroorganisme, bebas dari pirogen, bebas dari partikulat dan standar
yang sangat tinggi dalam hal kemurnian dan kualitas, bagaimanapun
tujuan utama pembuatan sediaan steril adalah mutlak tidak adanya
kontaminasi mikroba. Tidak seperti syarat banyak sediaan yang lain,
syarat sterilitas adalah nilai yang mutlak. Sebuah sediaan baik steril
maupun non steril.

Obat yang diberikan dengan rute parenteral/ secara injeksi harus

steril dan bebas pirogen. Pirogen atau bakteri endotoksin adalah produk
metabolik organik dari bakteri gram negatif yang dapat menyebabkan
demam dan hipotensi pada pasien terdapat dalam jumlah yang berlebihan
pada injeksi intravena (IV).
Respon pirogenik sudah dikenal sejak tahun 1865, ketika
dilaporkan bahwa injeksi air suling menyebabkan hipertermia pada anjing.
Kemudian, pada tahun 1876, kehadiran pirogen yang dapat menyebabkan
demam, ditemukan dalam daging yang membusuk. Identifikasi komponen
pirogenik dari bakteri dicoba oleh Roussy pada tahun 1889 dan Centanni
pada tahun 1894, yang menetapkan bahwa pirogen itu nonproteinaceous.
Hort dan Penfold pada tahun 1911 membuat kontribusi yang signifikan
dalam berhubungan produksi demam dan administrasi infus intravena.
Mereka juga adalah yang pertama untuk menggunakan kelinci sebagai
hewan model untuk mempelajari respon pirogenik.
Uji pirogenitas adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui apakan
suatu sediaan uji bebas pirogen atau tidak dengan maksud untuk
menghilangkan risiko berbahaya yang dapat diterima oleh pasien apabila
diinjeksi dengan suatu sediaan farmasi.
 Tes pirogen menjadi tes kontrol kualitas resmi untuk parenteral
pada tahun 1942 di AS Pharmacopeia (USP), edisi ke-12. Kemudian pada
tahun 1945, Code of Federal Regulations (CFR) menyatakan bahwa
antibiotik perlu diuji pirogen. Tes kelinci merupakan tes awal yang resmi
diakui dalam standar kompendium telah dasarnya tetap tidak berubah
meskipun kemajuan dalam ilmu parenteral dan teknologi telah ada tes lain
yang lebih efektif.

1.2 Rumusan Masalah

 Apa yang dimaksud dengan pirogen ?
 Apa saja sumber-sumber pirogen ?
 Bagaimana cara-cara pencegahan pirogen ?
 Bagaimana cara menghilangkan pirogen
 Sebutkan metode uji aktivitas terhadap pirogen ?

1.3 Tujuan Penulisan

Tujuan penulisan makalah ini adalah untuk mengetahui apa
yang dimaksud pirogen, sumber sumber pirogen, cara
pencegahan,menghilangkan pirogen.
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Definisi Pirogen

Pirogenes didefinisikan sebagai produk metabolism mikroorganisme

hidup, atau mikroorganisme mati menyebabkan respon spesifi khusus
pada injeksi. Mereka terjadi dimanapun mikroorganisme yang diizinkan
untuk tumbuh. Terlepas dari sumber mikroba, mereka tampaknya memiliki
sifat yang mirip. Pada kimia, mereka dianggap sebagai lipopolisakarida,
larut dalam air tapi tidak larut dalam pelarut organic. Mereka dapat
menjadi padatan makromolekul filterable dengan berat molekul  dilaporkan
serendah 15.000 atau setinggi 4 juta. Karena mereka larut dalam air, baik
sterilisasi  dengan panas lembab di bawah tekanan atau filtrasi melalui
filter sterilisasi untuk menghilangkan pirogen, walaupun proses ini
menghilangkan mikroorganisme hidup. Pirogen  dihasilkan oleh
mikroorganisme gram negatif yang paling ampuh. Pirogen ekstrak kering
tampaknya stabil selama jangka waktu yang lama, bahkan larutan
pyrogenik kehilangan  sedikit aktivitas mereka selama bertahun-tahun.
(SDF, 1974).

Pirogen berasal dari kata pyro yang artinya keadaan yang

berhubungan dengan panas, dan kata gen yang artinya membentuk atau
menghasilkan .Pirogen adalah suatu produk mikroorganisme, terutama
dari bakteri gram negatif.

Pirogen adalah senyawa dengan berat molekul tinggi yang

dinyatakan sebagai senyawa lipopolisakarida yang diproduksi oleh kira-
kira 5-10% massa total bakteri. Pirogen ini merupakan senyawa yang jika
masuk ke aliran darah akan mempengaruhi suhu tubuh dan biasanya
menghasilkan demam. Pengobatan demam yang disebabkan oleh pirogen
sangat sulit dan pada beberapa kasus dapat menyebabkan kematian.
Pirogen berasal dari kelompok senyawa yang luas, meliputi endotoksin
(LPS). Endotoksin adalah suatu molekul yang berasal dari membran luar
bakteri gram negatif. Organisme gram negatif membawa 3-4 juta LPS
pada permukaannya yang meliputi 75% permukaan membran luar
(Sudjadi, 2008).

Pirogen merupakan substansi yang mampu menyebabkan demam

terutama dari bakteri gram negatif yang terdiri atas suatu senyawa
kompleks lipopilisakarida. Pada saat ini endotoksin diketahui merupakan
pirogen yang paling kuat, namun kehadiran pirogen lain dalam suatu
sediaan perlu diperhitungkan, karena manusia tidak hanya respon
terhadap endotoksin tetapi juga pirogen yang lain (Suwandi, 1988)

Sifat-sifat pirogen:

1.    Termostabil, sehingga hanya dapat dihilangkan dengan pemanasan

pada suhu 650 derajat C selama 1 menit.

2.    Larut dalam air.

3.    Tidak dipengaruhi oleh bakterisida biasa.

4.    Tidak menguap.

5.    Berat Molekul (BM) antara 15.000-4.000000.

6.    Ukuran umumnya 1-50 millimikron.

Pirogen secara garis besar dikelompokkan menjadi dua macam, yaitu:

1.    Pirogen endogen

Pirogen endogen adalah faktor-faktor yang berasal dari dalam tubuh kita
sendiri sebagai reaksi kekebalan melawan kuman penyakit yang masuk
ke tubuh. Misalnya interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6), alpha-
interferon, dan tumor necrosis factor (TNF).
2.    Pirogen eksogen 

Pirogen eksogen merupakan faktor eksternal tubuh yang menyebabkan

gangguan pada fungsi tubuh manusia. Misalnya bagian dari sel bakteri
dan virus. Selain itu, bisa juga berupa zat racun (toksin) yang dihasilkan
oleh bakteri atau virus tertentu. 

B. Sumber-Sumber Pirogen

Pirogen dapat masuk kedalam sediaan melalui beberapa cara

berupa mikroorganisme hidup atau mati. Mungkin sumber potensial
terbesar dari berbagai kontaminasi adalah air yang digunakan dalam
proses pembuatan. Walaupun destilasi yang tepat akan menyediakan air
bebas pirogen, kondisi penyimpanan harus tidak dapat dimasuki oleh
mikroorganisme dan pertumbuhannya dicegah. Sumber potensial yang
lain dari kontaminasi adalah perlengkapan. Bahan-bahan pirogen melekat
kuat pada gelas dan permukaan lain. Residu larutan dalam peralatan yang
digunakan sering menjadi media kultur bakteri dengan kontaminasi
pirogenik. Walaupun peralatan yang sudah dicuci dibiarkan basah dan
dibiarkan diudara dapat mengandung nutrisi yang nyata untuk
pertumbuhan mikroorganisme karena pengeringan tidak menghancurkan
pirogen, pirogen dapat tinggal dalam peralatan dalam jangka panjang.
Pencucian akan mengurangi kontaminasi dan pemanasan kering akan
mencegah kontaminasi peralatan yang cocok untuk digunakan. Bahan
terlarut dapat menjadi sumber pirogen. Bahan terlarut dapat mengkristal
atau mengendap dari larutan berair yang mengandung kontaminasi
pirogenik. Pada proses ini, pirogen dapat dihalangi melalui lapisan
partikel. Dalam beberapa kasus, bahan terlarut dapat dimurnikan dengan
rekristalisasi dan pencucian pengendapan atau cara lain untuk
penghilangan pirogen (    RPS 18th: 1550 ).
C. Pencegahan Terhadap Pirogen

Dalam pembuatan sediaan, perlu dilakukan pencegahan agar tidak

terdapat pirogen yang terkandung utamanya pada sediaan steril. Berikut
adalah cara pencegahan pirogen :

Ada beberapa langkah yang dapat diambil untuk mencegah

pemasukan dan peningkatan pirogen dalam cairan parenteral. Hal paling
penting adalah dengan tepat merancang dan pengoperasian penyulingan,
dicocokkan untuk mencegah tetesan dari air mendidih kedalam destilat.
Destilat harus dikumpulkan dalam wadah yang telah dibilas dengan air
destilat segar. Perlakuan untuk menghilagkan tetesan-tetesan air yang
terakumulasi yang dapat mengandung pirogen atau untuk menghilangkan
bahan pirogenik yang dapat mengering dan melekat pada bagian dalam
permukaan wadah. Usaha perlindungan menghindarkan kontaminasi
destilat oleh bakteri tahan udara harus dilatih. Air destilasi harus terlindung
selama penggumpalan dan harus digunakan sesegera mungkin setelah
didestilasi untuk mencegah perkembangbiakan bakteri yang mungkin ada.
Larutan seharusnya disaring, dikemas, disegel, dan disterilkan dengan
secepat mungkin (Scoville’s: 196-197).

D.Cara menghilangkan pirogen

Pirogen dipindahkan dari air dengan destilasi, pirogen tidak

menguap. Destilasi bebas pirogen dikumpulkan dalam wadah steril dan
bebas pirogen. Air untuk injeksi, ketika dikumpulkan dalam wadah bebas
pirogen dan steril, harus digunakan kurang dari 24 jam untuk sediaan
produk parenteral yang disterilkan pada periode ini. Jika air untuk injeksi
disimpan untuk waktu lebih panjang, air untuk injeksi dapat disimpan
dalam wadah bebas pirogen dan steril pada suhu 5-80oC suhu dimana
mikroorganisme tidak akan tumbuh, kemungkinan menghilangkan pirogen.
Pirogen dapat dihilangkan dari wadah logam dan gelas melalui panas
kering. Ketika metode tidak praktis untuk ukuran wadah atau bukan
metode pilihan untuk alat-alat pada panas kering, pirogen dapat
dihilangkan melalui pembilasan wadah dengan baik dengan air untuk
injeksi bebas pirogen, pirogen larut air, dipindahkan melalui pembilasan
yang diulang (SDF: 46-47)

E.Metode Uji Aktivitas Pirogen

Uji pirogen dimaksudkan untuk membatasi resiko reaksi demam

pada tingkat yang dapat diterima oleh pasien pada pemberian sediaan
injeksi. Pengujian meliputi pengukuran kenaikan suhu kelinci setelah
penyuntikan larutan uji secara i.v dan ditujukan untuk sediaan yang perlu
penyiapan pendahuluan atau cara pemberiannya perlu kondisi khusus
ikuti petunjuk tambahan yang tertera pada masing-masing monografi.

Alat dan pengencer. Alat suntik, jarum dan alat kaca dibebas
pirogenkan dengan pemanasan pada suhu 250oC selama tidak kurang
dari 30 menit atau dengan cara lain sesuai dengan perlakuan semua
pengencer dan larutan untuk pencuci dan pembilas alat suntik dengan
cara sedemikian rupa yang dapat menjamin alat tersebut steril dan bebas
pirogen. Lakukan uji pirogen terhadap pengencer dan larutan pencuci dan
pembilas secara berkala. Apabila digunakan injeksi NaCl sebagai
pengencer, gunakan injeksi yang mengandung larutan NaCl PO 9 %.

1.    Rabbit Test

a.    Rekaman suhu

Gunakan alat pengukur suhu yang teliti seperti termometer klinik

atau termistor atau alat sejenis yang telah dikalibrasi untuk menjamin
ketelitian skala kurang lebih 0,1 yang telah diuji bahwa pembacaan suhu
maximum tercapai <5 menit masukkan alat pengukur suhu kedalam anus
kelinci dengan kedalam tidak <7,5  cm dan sesudah jangka waktu tidak
kurang dari yang telah ditetapkan sebelumnya, tekan suhu tubuh kelinci.

b.    Hewan uji

Gunakan kelinci dewasa yang sehat. Tempatkan kelinci satu ekor

dalam satu kandang dalam ruang dengan suhu yang seragam antara 20-
23oC dan bebas dari gangguan yang menimbulkan kegelisahan. Beda
suhu tidak boleh berbeda kurang lebih 3oC dari suhu yang telah
ditetapkan. Untuk kelinci yang belum pernah digunakan untuk uji pirogen,
adaptasikan kelinci tidak boleh lebih dari tujuh hari dengan uji
pendahuluan yang meliputi semua tahap pengujian yang tertera pada
prosedur, kecuali penyuntikan, kelinci tidak boleh digunakan untuk uji
pirogen lebih dari sekali dalam waktu 48 jam atau sebelum 2 minggu
setelah digunakan untuk uji pirogen bila menunjukkan kenaikan suhu
maksimal 0,6oC atau lebih.

c.    Prosedur

Lakukan pengujian dalam ruang terpisah yang khusus untuk uji

pirogen dan dengan kondisi lingkungan yang sama dengan ruang
pemeliharaan, bebas dari keributan yang menyebabkan kegelisahan.
Kelinci tidak diberi makan selama waktu pengujian. Minum dibolehkan
pada tiap saat, tetapi dibatasi pada saat pengujian. Apabila pengujian
menggunakan termistor, masukkan kelinci kedalam kotak penyekap
sedemikian rupa sehingga kelinci tertahan dengan letak leher yang
longgar sehingga dapat duduk dengan bebas. Tidak lebih dari 30 menit
sebelum penyuntikan larutan uji, tentukan “suhu awal” masing-masing
kelinci yang merupakan dasar untuk menentukan kenaikan suhu. Beda
suhu tiap kelinci dalam satu kelompok tidak boleh lebih 1oC dan suhu
awal setiap kelinci tidak boleh lebih dari 39,8oC. Kecuali dinyatakan lain
pada masing-masing monografi, suntikkan 10 ml/kg bb, melalui vena tepi
telinga 3 ekor kelinci dan penyuntikan dilakukan waktu 10 menit. Larutan
uji berupa sediaan yang bila perlu yang dikonstitusi seperti yang tertera
pada masing-masing monografi dan disuntikkan dengan dosis seperti
yang tertera. Untuk uji pirogen alat atau perangkat injeksi, gunakan
sebagai larutan uji hasil cucian atau bilasan dari permukaan alat yang
berhubungan langsung dengan sediaan parenteral, tempat penyuntikan
atau jaringan tubuh pasien. Semua larutan harus bebas dari kontaminasi.
Hangatkan larutan pada suhu 37o + 2o sebelum penyuntikan. Rekam
suhu berturut-turut antara jam ke-1 dan jam ke-3 setelah penyuntikan
dengan selang waktu.

d.   Penafsiran hasil

Setiap penurunan suhu dengan nol. Sediaan memenuhi syarat

apabila tak seekor kelinci pun menunjukkan kenaikan suhu 0,5oC atau
lebih. Jika ada kelinci yang menunjukkan kenaikan suhu 0,5oC atau lebih.
Lanjutkan pengujian dengan menggunakan lima ekor kelinci. Jika tidak
lebih dari tiga ekor dari 8 ekor kelinci masing-masing menunjukkan
kenaikan suhu 0,5oC atau lebih dan jumlah kenaikan suhu maksimal 8
ekor kelinci tidak lebih dari 3,3oC sediaan dinyatakan memenuhi syarat
bebas pirogen
2. LAL (Limulus amebocyte lysate)

Baru-baru ini telah ditemui bahwa ekstrak sel darah ketam sepatu
kuda (Limulus polyphemus) mengandung sistem enzim dan protein yang
menggumpal bila ada liposakarida dalam jumlah kecil. Penemuan ini,
merangsang perkembangan uji Limulus amebocyte lysate (LAL) untuk
mengetahui adanya pirogen dalam kerja penelitian dan pengawasan
selama proses berlangsung. Usulan-usulan untuk uji produk akhir obat
dengan LAL sedang dipertimbangkan oleh FDA (Ansel, 1989).

Uji LAL adalah metode spesifik untuk bakteri endotoksin, hanya

untuk pirogen yang signifikan pada kebanyakan pabrik farmasetikal dan
peralatan medis. Test didasarkan pada mekanisme primitif penggumpalan
darah dari kepiting seperti Kuda Amerika (Limulus polyphemus).
Berberapa enzim diletakkan pada sel darah amoeba kepiting yang dipicuh
oleh endotoksin perpanjangan koagulasi enzimatik yang di akhiri dengan
produksi di gel protenose (Aulton, 1990).

Test harus dihindarkan dari kontaminasi antimikroba sebelum

dihindarkan, test ini penting untuk memastikan bahwa tidak ada factor
campuran dalam sediaan, peralatan tidak menyerap endotoksin (seperti
pada beberapa plastic) dan sensitifitas dari lisat diketahui (Aulton, 1990).

Reagen test LAL disediakan dengan lyopilisasi sel di mubasit

limulus. Volume setara reagen LAL dan larutan test (0,1 mikron per
masing-masing) dicampurkan dalam gelas tube test elipirogenasi. Tube
diinkubasikan pada suhu 37oC selama 1 jam, setelah test wadah dibaca.
Tube diambil dari inkubator dan diubah. Bekuan oleh yang rusak
mengandung energi padatan merupakan factor dari test positif. Ketika
digunakan pada bagian ini bekuan gel uji awalnya, melewati test
kegagalan dibatasi dan reagen sensitive LAL (Aulton, 1990).

Test LAL tambahan test ini dapat digunakan dalam laboratorium

farmaseutikal. Test ini spesifik untuk endotoksin gram negatif, dimana test
pirogen kelinci sensitif untuk semua pirogen endotoksin dan sumber lain
disbanding gram negatif (Aulton, 1990).
 BAB III
PENUTUP

Kesimpulan
 Pirogen merupakan substansi yang mampu menyebabkan demam
terutama dari bakteri gram negatif yang terdiri atas suatu senyawa
kompleks lipopilisakarida.
  Sumber-sumber pirogen pada prinsipnya sumber pirogen adalah
air destilat yang terlalu terkontaminasi oleh bakteri yang tahan
udara yang tumbuh dan menghasilkan endotoksin.
 Cara pencegahan pirogen yaitu dengan tepat merancang dan
pengoperasian penyulingan, dicocokkan untuk mencegah tetesan
dari air mendidih kedalam destilat.
 Cara menghilangkan pirogen yaitu dengan cara memindahkan dari
suatu larutan melalui destilasi.
  Metode Uji Aktivitas Pirogen yaitu Rabbit Test dan LAL (Limulus
amebocyte lysate).
 DAFTAR PUSTAKA
Aulton, Michael. 1990. Pharmaceutical Practice. London: Oritic Livingston.

Ganong, W.F. 2002. Pengaturan Sentral Fungsi Visera. Dalam :

Widjajakusumah M.D., Editor.  Buku Ajar Fisiologi Kedokteran.
Edisi 20. Jakarta: EGC.

Gennaro, A. R, et al. 1990. Remingons Pharmaceutical Science

18th Edition. Pensylvania: Marck publishing company.

Sudjadi. 2008. Bioteknologi kesehatan. Yogyakarta: Kanisius.

Suwandi. 1988. Uji Pirogenitas dengan Kelinci dan Limulus Amebocyt

Lysate. Cermin Dunia Kedokteran  no.52.

Turco, Salvatore dan Robert E. 1974. Sterile Dosage Forms. London  :

Published in Great Britain by Henry Kimpton Publishers.

Walter F., PhD. Boron. 2003. Medical Physiology: A Cellular And

Molecular Approaoch. Elsevier/Saunders. p. 1300. ISBN 1-4160-2328-
3. Jenkins, G.L. Scoville's:The Art of Compounding. USA: Burgess
Publishing.