Bagaimana sampel swab

diproses untuk deteksi

Covid 19 dengan RT-PCR?
LAB PCR RS UNUD
 TABLE OF

01
CONTENTS

Mengenal Real Time PCR

02
Alur Pemeriksaan Swab

03
qPCR Workflow

2
 01 Real Time PCR

Real time polymerase chain reaction atau sering

disebutquantitative polymerase chain reaction
(qPCR) , merupakan suatu metode biologi
molekuler berbasis reaksi rantai polimerase.
Metode ini mendeteksi amplifikasi gen target
selama proses PCR berlangsung, tidak di akhir
reaksi, seperti pada PCR konvensional. qPCR
menggunakan fluoresens, dimana peningkatan
sinyal fluoresens menunjukkan terjadinya
amplifikasi gen target selama proses PCR.

3
Deteksi qPCR
(a) deteksi berbasisSYBR green. SYBR
green berikatan dengan semua DNA utas
ganda dan menghasilkan sinyal
fluoresens.
(b) deteksi berbasis probes. Jika probe
utuh, tidak ada sinyal yang dideteksi/
tidak ada gen target. Jika primer dan
probe menempel pada gen target
kemudian enzim Taq polymerase
mensintesis utas baru DNA, maka enzim
5′ eksonuklease akan bekerja memecah
probe sehingga pada akhirnya dihasilkan
sinyal fluoresens.

Peningkatan sinyal fluoresens ini

menunjukkan terjadinya amplifikasi gen
target
Smith and Osborn, FEMS, 2008
4
Beberapa catatan
1. Jika material genetik dari target adalah RNA, maka RNA diubah dulu menjadi cDNA sebelum dilakukan
PCR. Langkah ini disebutreverse transcription (RT).
2. RT dapat dilakukan dengan one-step (RT dan amplifikasi dilakukan sekaligus dalam mesin PCR) atau
two- step (dibuat cDNA dulu dalam suatu tabung sebelum dilakukan PCR)

https://www.thermofisher.com/id/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/basic-principles-rt-qpcr.html
5
berapa catatan: cont.
3. qPCR singleplex: hanya 1 gen target yang diamplifikasi per reaksi. Probe gen target diberi
fluoresens tertentu
4. qPCR multiplex: lebih dari 1 gen target yang dideteksi per reaksi. Probe masing-masing gen
target diberi fluoresens yang berbeda sehingga dapat dibedakan gen mana yang diamplifikasi

https://www.thermofisher.com/id/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/
pcr-education/pcr-reagents-enzymes/pcr-methods.html 6
Beberapa catatan:
cont.

5. Saat melakukan qPCR: kontrol negatif, kontrol

running bersamaan
positif, kontrol internal di
dengan sampel
6. Kurva amplifikasi pada hasil qPCR kontrol
positif dan sampel yang positif akan
berbentuk sigmoid
7. Ct (cycle threshold )value atau Cq
menunjukkan jumlah siklus yang diperlukan
sinyal fluoresens untuk melewati ambang/
threshold Ct. value berbanding terbalik
dengan jumlah target DNA pada sampel Ct (
value yang rendah menunjukkan jumlah target
DNA yang besar)

https://www.cogentech.it/realtime-pcr-eng-technical-details.php

7
 02 Alur Pemeriksaan Swab Post-analisis
Interpretasi hasil PCR:
validinput hasil, invalid
ulang proses analisis
Input data hasil di sistem
Verifikasi hasil
Pengiriman hasil

Pre- analisis
2-3 jam
Pengecekan identitas
Pencatatan
Pengkodean
Penyimpanan Analisis
Alikuot sampel
2-3 jam Ekstraksi RNA
Pencampuran reaksi PCR
PCR
7-8 jam

8
 03 workflow untuk deteksi Covid19
qPCR

Reverse
Ekstraksi transcription
Swab (RT) Run PCR Analisis
RNA
RNA cDNA

200ul digunakan untuk Manual atau Metode one-step Singleplex atau multiplex Analisis kurva
ekstraksi, sisanya menggunakan atau two-step amplifikasi danCt
disimpan di -80o C alat ekstraktor PCR value

9
10