Kromatografi kolom klasik

Wempi Budiana, M.Si., Apt

 Teknik kromatografi kolom
1. Pemilihan sistem
2. Pengemasan kolom
3. Pemasukan cuplikan
4. Pengelusian
5. Pengumpulan fraksi eluat yang keluar dari
kolom
 1. Pemilihan sistem
a. Menggunakan data KLT
adsorben : - jenis dan pabrik sama
- ukuran >, kec. u./ KCV atau
tekan.
b. Data pustaka  ada data penelitian
c. Prekromatografi : u/ cuplikan yg blm dikenal
sm sekali.
 2. Pengemasan kolom
Kolom : umumnya dr gelas
Ukuran : umumnya panjang 10-100 x ɸ kolom.
• Kuantitas adsorben
u/ preparatif scr ksr perbandingan solut : adsorben =
1 : 2 smp 1 : 50.
u/ pemisahan kompleks/memperoleh komponen
murni, solut : adsrbn = 1 : 200 smp 1 : 2000.
• Pemasukan adsorben
Secara kering : adsorben dimasukan langsung kedalam
kolom  elusi
Secara basah : menggunakan lumpuran adsorben dgn
pelarut yg akn digunakan sbg pelarut
pertama.
* Pengelusian dilakukan dengan eluen isokratik
• Pengumpulan fraksi eluat
pengumpulan dpt secara manual atw dgn
alat pengumpul fraksi eluat otomatis
(waktu dan volume).
 Tipe kromatografi kolom
1. Adsorpsi tambatan solut disebabkan oleh
interaksi dgn permukaan adsorben padat.
• Dapat digunakan untuk pemisahan geometrik
dan struktural dgn BM smp 1000.
2. Partisi (interksi solut thd f.d dan f.g)
Kromatografi cair-cair/kr. Partisi.
Terjadi distribusi solut antara 2 pelarut tak
campur.
• Kr. P. fase normal : fase diam lebih polar
• Kr. P. fase balik : fase diam lebih non polar
 lanjutan
• Fase terikat
Silika yang termodifikasi secara kimia antara
gugus silanol dan klorosinol.
1. Silan dgn rantai C-alkil 8-22  partikel
hidrofobik.
2. Inkorporasi gugus alkohol, amina, siano 
lebih polar
3. Dgnkn untk kromatografi fase balik, untuk
kromatografi biasa dan kr. Fase normal.
• Pertukaran Ion
Fase diam : polimer berpori, yg terikat gugus
penukar kation atau anion.
Eluen : biasanya larutan dapar.
Tambatan dan pemisahan solut tjd menurut
derajat ionisasi solut dan afinitas thd sisi
ionik pd fs diam.
Tambatan dpt dikendalikan dgn pengubahan
kekuatan ion, pH dan suhu.
• Eksklusi ukuran :
• Pemisahan berdasarkan ukuran. Molekul
paling besar dieksklusi paling dulu.
• Dapat digunakan juga untuk menentukan BM
atau distribusi bobot dr molekul
• Afinitas
Fd mempunyai ggs khas dengan afinitas tinggi
terhadap solut.
Solut teradsorpsi selektif dr larutan mll
antaraksi dgn ggs ttt pd adsorben
(matriks padat).
Fs diam pd kromatografi cair kolom
Janis fs diam Jenis kromatografi

Padat, adsorben Kromatografi cair padat

Padat, damar penukar Kromatografi pertukaran ion

Cairan dgn penyangga Kromatografi cair-cair,

Kromatografi partisi

Padat, gel, ayakan molekul Kr. Eksklusi molekul

Kr. Permeasi gel
Kr. Filtrasi gel

Padat, ligan Kromatografi afinitas

Padat, fase terikat Kromatografi fase terikat

Cairan, tanpa pendukung penyangga Kromatografi lawan arus

 Teori kolom
• Melibatkan parameter :
1. Resolusi
2. Kapasitas cuplikan kecepatan/waktu analisis.
Untuk mencari kond. Optimum pd pemisahan
pd st ketika mengubah satu parameter saja.
Parameter lain : tambatan kolom (Vr), efisiensi
kolom.
• Tambatan
• Dengan memperhitungkan K (koefisien
distribusi), K’ (faktor kapasitas), maka diperoleh :
• Vr = V0 (1 + K’) Vr = Volume tambat
• Tr = to (1 + K’) tr = waktu tambat
• Tr = L (1 + K’) Vo= vol. fg dlm kolom
V to = wkt yg dibthkn
pelarut u/ mll kolom
L = pjg kolom
V = kecepatan alir
• Tujuan dr metode pemisahan scr kromatografi
: untuk mendapatkan pemisahan solut yang
jaraknya lebih lebar dr lebar puncak solut dlm
waktu seminimal mungkin.
• Dalam prakteknya puncak kromatogram tdk sll
berdasarkan distribusi normal Gauss.
• Nisbah tambat (Rr)
• Rr = 1 .
1 + K’
Makin lama solut berada dalam sistem, puncak
makin lebar.
 Efisiensi pemisahan
• Yang ditinjau 2 atau lebih solut
• Dibedakan 2 hal :
1. berhubungan dgn hanya 2 solut
2. spesifikasi efisiensi sistem
 1. Tinjauan thd 2 solut
a. Faktor pemisahan = nisbah pemisahan = nisbi
Tambat relatif = selektivitas kolom
α = (Vr) B α > 1 = pemisahan baik
(Vr) A
b. Resolusi (Rs)
Rs = 2 tr2 – tr1 = 2 Δ tr .
W2 + W1 W2 + W1
Bila W2 = W1  Rs = Δ tr
W
Puncak berdekatan sekali  lebar puncak dianggap sama.

Rs ± 1,5  pemisahan sempurna

Rs ˂ 1  pemisahan kurang baik
 Memperbaiki pemisahan
a. Memperbesar jarak puncak  selektivitas kolom d ˃˃
b. Memperkecil lebar puncak (lebar pita)  efisiensi
kolom w ˂˂
Pemisahan puncak maksimum dipengaruhi a.l oleh jarak
migrasi/perpisahan. Jarak migrasi makin besar,
lebar puncak naik.
Jadi pita memisah lebih cepat dari pelebaran pita 
kolom lebih panjang, pemisahan lebih baik sesuai
dengan :
Tr = L (1 + K’)
V
 2. Tinjauan terhadap sistem
a. Efisiensi kolom
Fs. Dr parameter kolom, seperti : kecepatan laju
pelarut, ukuran partikel, kemasan kolom,
viskositas pelarut dll.
N=L N = jumlah plat teoritsi
H L = Panjang kolom
H = (jarak)
N > besar, pemisahan lebih baik
H > kecil, pemisahan lebih baik
b. Pelebaran pita
sumber utama : - neka alur (pelebaran pita) Hp
- Difusi molekul Hd
- efek alih massa antr fase-
fase Hs dan Hm
 Memperbaiki resolusi
• Dipengaruhi oleh efisiensi kolom, selektivitas, faktor
kapasitas.
• Pemisahan dapat diperbaiki dengan mengatur salah
satu dari ketiga faktor.
1. Memperpanjang kolom (dpt dihit. Dari Nbutuh dan
H).
Co. Rs diamati 0,6, dikehendaki 1,25
𝑅𝑠 2 1,25
( )2 = ( )2 = 4 (pjg kolom hrs dinaikan 4 x)
𝑅𝑠 1 0,6
2. Kr. Daur ulang landai
3. Pemrograman pelarut (elusi gradien)
 Parameter kromatografi kolom yg
penting
1. Panjang kolom 7. elusi gradien
2. Diameter kolom 8. pemrograman alir
3. Bentuk kolom 9. tekanan kolom
4. Penyangga padat 10. suhu kolom
5. Fase gerak 11. asimetri kolom
6. Fase diam
 Memperbaiki resolusi
1. Pemisahan dapat diperbaiki dgn mengatur salah satu
dari tiga faktor berikut : efisiensi, selektivitas dan
faktor kapasitas.
2. Panjang kolom
Memperpanjang kolom akan memperbaiki
pemisahan (Rs lebih tinggi).
3. Diameter kolom
untuk KCKT pemisahan analitik : ɸ ± 2 – 4 mm
pemisahan preparatif : ɸ ± 8 – 10 mm
dengan cuplikan 10 – 1000 mg.
Kapasitas cuplikan naik dengan kuadrat diameter.
4. Bentuk kolom
umumnya untuk KCKT lurus, bila terdiri dari banyak
kolom penghubungnya harus sgt sempit.
5. Penyangga padat
ɸ partikel tergantung dari tipe penyangga yg
digunakan.
Beberapa pendekatan
a. Partikel berpori dan kecil  luas permukaan tinggi,
partikel cukup rata  efisiensi tinggi.
Kelemahan : aliran tertahan, pengemasan sukar.
b. manik-manik berlapis berpori = penyangga
penikular. Manik-manik dilapisi partikel
dan lapisannya berpori.
* Dgn partikel sekecil mungkin resolusi dan
kapasitas cuplikan diperbaiki. Luas
permukaan naik  kapasitas naik.
6. Fase gerak
a. harus selektif u/ berbagai komponen
b. tidak teralu kental, mengurangi penurunan
tekanan dan menaikan kecepatan alih
massa.
c. mudah menguap : memudhkn
menghilangkan dari cuplikan  terutama
pada kr. Preparatif.
d. Kelarutan solut dalam fs gerak  terutama
pada kr. Preparatif.
7. Fase diam
a. tdk boleh larut dalam fase gerak dan stabil thd
fg. Misal silika sgt lrt pd pH >7,5 jg pH <2.
b. u/ adsorben : permukaan harus rata 
menghindari ‘tailing’ dan adsorpsi
‘irreversible’
c. Resin/ damar penukar ion harus mempunyai
cukup sambung silang (agar tahan thd
tekanan)
d. luas permukaan besar kapasitas tinggi (jg
dgn menaikan jumlah cairan)
8. Pemrograman pelarut-elusi gradien-elusi
landaian.
a. Untuk menurunkan wkt analisis dan pemisahan
optimum ditinjau dari waktu resolusi
b. u/ pemisahan campuran kompleks yg mencakup
jarak kr. Preparatif  dibuat cuplikan
sesederhana mungkin.
c. Dapat digunakan pd kr. Daur ulang pd kolom yg
sama (jk menggunakan kolom yg sm).
9. Pemrograman aliran dan kecepatan alir
10. Tekanan
Makin kecil diameter partikel, penurunan
tekana makin tinggi.
Penurunan tekanan diperkecil dgn
menggunakan pelarut dgn viskositas
rendah menaikan efisiensi (Dm > besar)
11. Suhu
Umumnya kromatografi dilakukan pd suhu kamar.
Pengendalian suhu penting untuk
keterulangan pemisahan.
Kenaikan suhu dapat
a. Menaikan resolusi
b. Menaikan kelarutan cuplikan kr. Eksklusi)
c. Menaikan efisiensi kolom
d. Menurunkan tekanan
12. Asimetri puncak kromatogram.
 Kapasitas puncak
• Kapasitas puncak u/ sistem kr. Cair dan kr. Gas
dapat diperbaiki dengan menggunakan satu
atau lebih teknik landaian, seperti alusi
landaian (gradien) atau pemrograman suhu.