II.

4 Deteksi atau Analisis Lipid

II.4.1 Uji Kualitatif
a. Uji Kelarutan
Uji kelarutan memiliki tujuan untuk menguji kepolaran lipid. Senyawa lipid
mempunyai tingkat kelarutan yang berbeda-beda. Lipid dapat larut dalam pelarut nonpolar
dan polar yang dipanaskan. Kelarutan lipid ditentukan oleh sifat polaritas panjang rantai
karbon dan derajat kejenuhan lipid. Parameter dari uji ini adalah bersifat polar apabila larut
dalam air dan bersifat non polar apabila tidak larut dalam air, larut dalam kloroform dan eter.
b. Uji Akrolein
Uji Akrolein memiliki tujuan untuk menentukan adanya gliserin atau lemak. Akrolein
mudah dikenali dengan baunya yang menusuk dengan kuat. Jika lemak dipanaskan dan
dibakar akan tercium bau menusuk karena terbentuk akrolein. Dalam uji ini, terjadi dehidrasi
gliserol dalam bentuk bebas atau dalam lemak/minyak menghasilkan aldehid akrilat atau
akrolein.

Gambar II.1 Reaksi Uji Akrolein

Ketika lemak dipanaskan setelah ditambahkan agen pendehidrasi (KHSO4) yang akan
menarik air, maka bagian gliserol akan terdehidrasi ke dalam bentuk aldehid tidak jenuh atau
dikenal sebagai akrolein (CH2=CHCHO) yang memiliki bau seperti lemak terbakar dan
ditandai dengan asap putih.

Gambar II.2 Contoh Uji Akrolein

c. Uji Kejenuhan
Uji kejenuhan dilakukan untuk mengetahui apakah asam lemak bersifat jenuh atau
tidak jenuh menggunakan pereaksi Iod Hubl. Asam lemak ditambah kloroform sama
banyaknya, tabung dikocok sampai bahan larut. Kemudian, tetes demi tetes pereaksi Iod Hubl
dimasukkan ke dalam tabung sambil dikocok. Ketidakjenuhan ditandai dengan perubahan
warna merah kemudian pudar (kembali semula). Parameter yang dilihat berupa :
o Adanya reaksi positif (berupa timbulnya warna merah saat ditetesi ion Hubs)
o Asam lemak tidak jenuh adanya timbul warna merah yang semakin lama pudar
o Asam lemak jenuh timbul warna merah tetapi tidak pudar.

Gambar II.3 Contoh Uji Kejenuhan

Asam lemak tidak jenuh memiliki ikatan ganda pada gugus hidrokarbonnya. Reaksi
positif ketidakjenuhan asam lemak ditandai dengan timbulnya warna merah ketika iod Hubl
diteteskan ke asam lemak, lalu warna kembali lagi ke warna awal kuning bening. Warna
merah yang kembali pudar menandakan bahwa terdapat ikatan rangkap pada rantai
hidrokarbon asam lemak.
d. Uji Ketengikan
Uji ketengikan memiliki tujuan untuk mengetahui oksidasi lipid. Parameter yang
dilihat berupa larutan putih menandakan tidak tengik dan larutan merah muda yang
menandakan tengik. Molekul-molekul lemak yang mengandung radikal asam lemak tidak
jenuh mengalami oksidasi dan menjadi tengik. Bau tengik yang tidak sedap tersebut
disebabkan oleh pembentukan senyawa-senyawa hasil pemecahan hidroperoksida. Tengiknya
suatu larutan karena golongan trigliserida banyak teroksidasi oleh oksigen dalam udara bebas.
 Gambar II.4 Contoh Uji Kejenuhan

Penentuan yang dilakukan adalah bilangan peroksida, jumlah karbonil, oksigen aktif,
uji asam tiobarbiturat, dan uji Oven Schaal.

 Bilangan Peroksida
Ditentukan berdasarkan jumlah iodin yang dibebaskan setelah lemak atau minyak
ditambahkan KI. Lemak direaksikan dengan KI dalam pelarut asam asetat dan kloroform
(2:1), kemudian iodin yang berbentuk ditentukan dengan titrasi memakai Na2S2O3.
 Jumlah Karbonil
Ditentukan tidak secara langsung dengan menambahkan senyawa tertentu yang
dengan karbonil membentuk warna, lalu dititrasi. Cara Kreiss memakai pereaksi
floroglusinol, sedangkan cara Lappin Clark memakai pelarut 2,4-dinitrofenilhidrazin. Uji
Kreiss merupakan salah satu uji ketengikan, yang berprinsip kepada rekasi kondensasi antara
ephydrin-aldehida dengan floroglusinol, sehingga menghasilkan warna merah jambu (pink).
 Oksigen Aktif
Dihitung dengan cara melewatkan udara dengan keadaan tertentu pada lemak yang
dipanaskan pada suhu tetap 100°C. Kemudian diukur waktu yang diperlukan sampai
dihasilkan 20 miliekuivalen peroksida. Cara ini sering dipakai untuk menentukan keadaan
awal lemak dengan atau tanpa antioksidan.
 Uji Asam Tiobarbiturat
Dipakai untuk menentukan adanya ketengikan. Lemak yang tengik akan bereaksi
dengan asam tiobarbiturat menghasilkan warna merah. Intensitas warna menunjukkan derajat
ketengikan.
 Oven Schaal
Sering dilakukan di industry biskuit. Bahan dalam gelas bersih dengan tutup yang
agak longgar (untuk masuknya udara). Dipanaskan sampai 65°C. Dalam selang waktu
tertentu diukur bau dan rasanya. Pencegahan Ketengikan: Proses ketengikan sangat
dipengaruhi oleh adanya prooksidan dan antioksidan. Prooksidan akan mempercepat
terjadinya oksidasi, sedangkan antioksidan akan menghambatnya. Penyimpanan lemak yang
baik adalah dalam tempat tertutup yang gelap dan dingin. Wadah lebih baik terbuat dari
aluminium atau stainless steel. Adanya antioksidan dalam minyak atau lemak akan
mengurangi kecepatan proses oksidasi. Antioksidan terdapat secara alamiah dalam lemak
nabati, dan kadang-kadang sengaja ditambahkan kedalam minyak atau lemak.
e. Uji Salkowski
Uji ini dilakukan untuk mengetahui keberadaan kolesterol. Kolesterol ditambahkan
kloroform anhidrat, lalu dengan volume yang sama ditambahkan asam sulfat (sebagai
pemutus ikatan ester lipid). Asam sulfat berfungsi sebagai pemutus ikatan ester lipid. Apabila
dalam sampel tersebut terdapat kolesterol, maka lapisan kolesterol di bagian atas menjadi
berwarna merah kecoklatan dan asam sulfat terlihat berubah menjadi kuning dengan warna
fluoresens hijau. Cincin coklat yang terbentuk menunjukkan terjadinya reaksi antara
kolesterol dengan asam sulfat pekat. Warna merah merupakan hasil reaksi antara kloroform
dengan kolesterol yang menghasilkan kolastadiena. Warna fluorosens hijau merupakan hasil
reaksi antara kolastadiena dengan asam sulfat berupa asam sulfonat. Warna kuning
merupakan sisa dari H2SO4.

f. Uji Liebermann-Burchard

Uji ini dilakukan untuk mengidentifikasi adanya kolesterol dengan menambahkan

asetat anhidrid dan asam sulfat. Ketika asam sulfat ditambahkan ke dalam campuran yang
berisi kolesterol, molekul air berpindah dari gugus C3 kolesterol, kolesterol kemudian
teroksidasi membentuk 3,5-kolestadiena. Produk ini dikonversi menjadi polimer yang
mengandung kromofor yang menghasilkan warna hijau. Reaksi positif ditandai dengan
adanya perubahan warna dari terbentuknya warna pink kemudian menjadi biru-ungu dan
akhirnya menjadi hijau tua.

Gambar II.5 Reaksi Uji Liebermann-Burchard

g. Uji Bligh dan Dyer

Bligh dan Dyer adalah metode ekstraksi dan purifikasi lipid yang didapatkan melalui
studi dekomposisi lipid dari ikan yang telah dibekukan. Prinsip kerja metode ini adalah
dengan menghomogenisasi jaringan basah dengan menggunakan campuran kloroform dan
metanol. Pengenceran dengan kloroform dan air akan menyeparasikan jaringan yang telah
terhomogenisasi tersebut menjadi dua lapisan, dimana lapisan kloroform akan mengandung
semua lipid/lemak non polar, sementara lapisan metanol akan mengandung semua senyawa
non-lemak atau senyawa lipid polar.

II.4.2 Uji Kuantitatif

a. Angka Asam
Angka asam adalah jumlah KOH (mg) yang dibutuhkan untuk menetralkan 1 g
sampel. Prinsip yang digunakan dalam uji angka asam adalah menitrasi sampel dengan KOH.

Perhitungan yang digunakan :

 b. Bilangan FFA
Bilangan Asam Lemak Bebas atau bilangan FFA (free fatty acids) adalah nilai yang
menunjukkan jumlah asam lemak bebas yang terdapat di dalam lemak setelah setelah
mengalami proses hidrolisis.
Perhitungan bilangan FFA :

Keterangan :
V = volume titran yang digunakan (mL)
N = normalitas KOH (N)
M = bobot molekul asam lemak
M = bobot sampel (gram)

c. Bilangan Reichert - Meissel

Bilangan Reichert-Meissel adalah jumlah 0,1 N basa yang di perlukan setiap 5 gram
lemak untuk menetralkan asam-asam lemak yang mudah menguap pada destilasi, yaitu asam
lemak dengan C6 dan C4 (kaproat dan butirat). Uji ini untuk mengetahui komposisi lemak
dan mendeteksi pemalsuan lemak dengan rantai karbon lebih dari 10. Metode ini
memanfaatkan keberadaan gliserida yang volatile dari asam terlarut engan jumlah karbon
sedikit dalam lemak butter. Metode ini kemudian dipadukan dengan teknik saponifikasi
dengan larutan NaOH.
d. Bilangan Poleinski
Bilangan ini menentukan kadar asam lemak yang volatile, tetapi tidak larut dalam air,
yaitu asam lemak C8-C14. Bilangan polenske adalah jumlah millimeter (ml) 0,1 N alkali
yang di perlukan untuk menetralkan asam lemak C8- C14 yang terdapat dalam 5 gram
sampel. Bilangan Poleinski juga dapat di gunakan untuk menguji pemalsuan terhadap
mentega.
e. Uji Bilangan Kirschner Baru
Uji bilangan Kirschner Baru adalah jumlah ml basa 0,1 N yang di perlukan setiap 5
gram lemak/minyak untuk menetralkan asam lemak volatile yang gram-gram peraknya larut
dalam campuran etanol air. Penentuan ini di gunakan untuk membedakan margarin dan
mentega, yaitu untuk mengetahui ada tidaknya pemalsuan. Distilat hasil penentuan ini
ditambah Ag2SO4, dan akan terbentuk gram perak yang larut dalam air, kemudian di asamkan
dengan H2SO4 dan di distilasi.
f. Uji Bilangan Hebner
Bilangan Hebner digunakan untuk menentukan jumlah asam lemak yang tidak larut
dalam air. Lemak dengan BM yang tinggi akan mempunyai bilangan Hebner yang rendah.
Filtrat yang di peroleh dari uji bilangan penyabunan, di uapkan alkoholnya. Sabun di
larutkan dalam air panas dan di tambah HCl pekat sehingga terbentuk asam lemak bebas. Bila
campuran tersebut segera di dinginkan, di peroleh lapisan asam lemak yang tak larut dalam
air. Lapisan ini di saring dan di timbang.
g. Bilangan Penyabunan
 Angka sabun adalah jumlah KOH (mg) yang diperlukan untuk men-saponifikasi ester
yang ada dalam 1 g sampel dan menetralkan asam lemak bebas dalam 1 g sampel. 3 molekul
KOH akan bereaksi dengan 1 molekul trigliserida. Prinsip dari uji angka sabun adalah
menitrasi campuran sampel dan KOH dengan HCl. Larutan alkali yang tersisi dititrasi dengan
HCl sehingga KOH yang bereaksi dapat diketahui.

Gambar II.6 Reaksi Bilangan Penyabunan

Bilangan penyabunan menunjukkan berat molekul lemak dan minyak secara kasar.
Pada trigliserida dengan asam lemak rantai C nya pendek akan di dapat SN yang lebih tinggi
dari pada asam lemak dengan rantai C panjang.
Perhitungan yang digunakan :

h. Bilangan
Iodin
Bilangan iodin adalah bilangan yang menunjukkan berapa mg halogen (dinyatakan
sebagai iodine) yang dapat diikat oleh 100 gram lemak atau minyak. Dapat dinyatakan
sebagai persen halogen yang dapat diikat oleh minyak atau lemak. Uji ini dilakukan untuk
menunjukkan ketidakjenuhan asam lemak penyusun lemak atau minyak, dimana asam lemak
tidak jenuh mampu mengikat iodium dan membentuk senyawa yang jenuh. Menunjukkan
banyaknya ikatan rangkap yang terdapat dalam asam lemak sampel. Ikatan rangkap pada
asam lemak tidak jenuh akan bereaksi dengan iodin atau senyawa iodin dalam jumlah
berlebih.
Perhitungan yang digunakan :
Keterangan :
Vblangko = volume blangko yang terpakai (mL)
VNa2S2O3 = volume titran Na2S2O3 yang terpakai
N = normalitas Na2S2O3 (0,1 N)
m = bobot sampel (gram)
Ada dua cara yang digunakan untuk mengukur bilangan iodine tersebut, yaitu cara
hanus dan cara wijs. Pada cara hanus, larutan iodine standarnya dibuat dalam asam asetat
pekat. (glacial) yang berisi bukan saja iodine tetapi juga iodium bromide, adanya iodium
bomida akan mempercepat reaksi. Sedangkan cara wijs menggunakan larutan iodine dalam
asam asetat pekat, tetapi mengandung iodium klorida sebagai pemacu reaksi. Titik akhir
titrasi kelebihan iodine diukur dengan hilangnya warna biru dari amylumiodine.

II.4.3 Instrumentasi
a. Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)
GC-MS berfungsi untuk memisahkan berbagai macam asam lemak dalam sampel,
mengetahui komposisi setiap asam lemak dalam sampel, serta untuk memperjelas asam
lemak yang mempunyai panjang rantai yang mirip dan mempunyai posisi ikatan rangkap
berbeda.

Gambar II.7 GC-MS

Prinsip kerja yang dilakukan dengan memisahkan senyawa-senyawa dalam sampel yang
bersifat volatile berdasarkan titik didih, ukuran dan kepolaran.Titik didih lemak dipengaruhi
oleh panjang rantai lemak. Sehingga untuk memodifikasi asam lemak agar menjadi volatile
dan rantai pendek dilakukan saponifikasi dan metilasi menjadi metil ester.
Komponen pada GC:
• Gas Pembawa yang berfungsi membawa sampel ke dalam kolom kromatografi
• Oven GC berfungsi mengontrol temperatur dan menguapkan metil ester-metil ester
yang masuk, temperatur harus seragam di semua area.
• Fase diam berfungsi mengikat metil ester-metil ester sesuai kepolarannya
Komponen pada MS :
• Setelah melewati tahap GC, selanjutnya memasuki MS
• Sampel yang masuk harus berupa uap, satu/lebih elektron dari molekul dihilangkan
untuk membentuk ion VE, ion dengan massa yang lebih besar dan muatan terkecil
 akan berbelok paling kecil sudutnya, ion akan menyentuh dinding detektor dan
menghasilkan arus kecil.
GC pada Lipid
• Sebelum analisis GC, senyawa yang dipakai haruslah sederhana dengan berat molekul
yang kecil
• Asam lemak harus diubah menjadi turunannya (metil ester) agar terdeteksi
• Terdiri dari 3 tahap :
– Tahap Ekstraksi : Diperoleh asam lemak dengan metode soxhet dan ditimbang
0.02-0.03 gram dalam bentuk minyak.
– Pembentukan Metil Ester (Metilasi) : Membentuk senyawa turunan dari asam
lemak menjadi metil esternya
– Identifikasi Asam Lemak : Menginjeksi metil ester ke kromatografi gas. Jenis
dan jumlah asam lemak dapat diidentifikasi dengan membandingkan peak
kromatogram sample dengan standard yang telah diketahui konsentrasinya.

b. Electron Spray Ionisation – Mass Spectrometry

ESI adalah metode ionisasi umum dalam MS untuk analisis lipid dari cairan tubuh,
sel, bakteria, virus, dan jaringan. Keuntungan dari penggunaan ESI-MS adalah keakuratannya
yang tinggi, sensitif, dapat direproduksi, dan aplikatif untuk larutan kompleks tanpa perlu
derivatisasi. ESI-MS juga dapat digunakan untuk mencari letak ikatan rangkap dalam lipid.
ESI-MS bergantung pada pembentukan ion gas dari molekul polar, labil secara termal, dan
non-volatil. Memiliki sifat ionisasi halus yang tidak mengganggu sifat kimia dari analit.

Gambar II.8 ESI-MS

c. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

 HPLC (High Performance Liquid Chromatography) adalah improvisasi dari Column
Chromatography, dimana ketinggian kolom dikurangi, sehingga jumlah piringannya
bertambah menjadi 100.000 piringan per meter (normal : 40.000 hingga 60.000 piringan per
meter) dan ditambahkan tekanan pada proses penghantaran fase bergerak (mobile phase)
melewati fase stasioner (stationary).

Gambar II.9 Instrumentasi HPLC

Prinsip dasar metode ini digunakan untuk memisahkan lipida non-volatil dan labil
yang memiliki berat molekul tinggi. Biasanya digunakan pada suhu ruang dan sering
dipakai untuk isolasi dan mengukur kadar (kuantitasi) kolesterol dan kolesteryl ester. HPLC
Teknik pemisahan HPLC berdasarkan kepolaran dan menggunakan tekanan tinggi untuk
mendorong fasa gerak. Fasa geraknya adalah liquid dan fasa gerak ini bergerak akibat
dorongan tekanan yang tinggi.
Uji ini dilakukan untuk:
 Mengurangi interaksi hidrofobik rantai hidrokarbon.
 Melemahkan ikatan hidrogen dan interaksi elesktrostatik yang mengikat lipid dengan
protein membrane.
Identifikasi HPLC pada lemak terbagi menjadi dua yaitu :
HPLC Asam Lemak
• Jenis kolom HPLC yang digunakan : Normal dan Reversed
• Asam lemak jenuh dan tak jenuh dapat dipisahkan sebagai metil ester
• Asam lemak dengan gugus OH dapat dideteksi 254 nm tanpa derivatisasi
HPLC Gliserida
• Banyak dilakukan pemisahan trigliserida berdasarkan jumlah atom c
• Terdapat hubungan liner antara log waktu retensi dengan atom C kejenuhan
• Setiap tambahan ikatan rangkap 2 atom memperpendek waktu retensi

d. Thin Layer Chromatography (TLC)

Metode ini menggunakan prinsip perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut
yang digunakan. Metode ini memisahkan dengan menggunakan fasa diam dari bentuk plat
silika dan fasa geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang dipisahkan. TLC sangat sesuai
untuk memisahkan ester kolestrol, mono, di, triacylglycerols, asam lemak bebas, kolestrol,
dan fospolipid.