TEKNIK MENANAM BAKTERI (ENDOFIT)

 Bakteri Endofit

Bakteri endofit pertama kali dilaporkan oleh Darnel et al pada tahun 1904. Sejak itu,
definisi mikroba endofit telah disepakati sebagai mikroba yang hidup di dalam jaringan
internal tumbuhan hidup tanpa menyebabkan efek negatif langsung yang nyata pada
inangnya. Sifat mikroba endofit yang tidak berdampak negatif pada jaringan tumbuhan
menunjukkan kemungkinan  adanya  hubungan  simbiosis  mutualisme  antara  mikroba 
endofit  dan inangnya (Stone et al, dalam Strobel & Daisy, 2003 dalam Hanifati, 2012).
Bakteri endofit hidup dan tumbuh di dalam jaringan tanaman serta secara aktif
mengkolonisasinya baik secara lokal maupun sistemik melalui proses hidrolisis. Bakteri
endofit dapat diisolasi dari permukaan jaringan tanaman yang steril atau diekstraksi dari
jaringan tanaman bagian dalam. Secara khusus, bakteri masuk ke jaringan melalui jaringan
yang berkecambah, akar, stomata, maupun jaringan yang rusak (Zinniel et al.,2002). Populasi
bakteri endofit yang paling tinggi terdapat pada akar. Bakteri endofit maupun rizobakteri
lainnya merupakan bagian dari mikroflora alamiah dari tanaman yang sehat di lapangan.
Bakteri ini dapat dikatakan sebagai kontributor penting bagi kesehatan tanaman (Kloepper et
al., 1999 dalam Aini & Abadi, 2004).
Mikroorganisme yang disebut sebagai endofit jika berada dalam tubuh tumbuhan
setidaknya satu bagian dari siklus hidupnya, sehingga mikroorganisme ini tidak hanya
numpang lewat atau menyebabkan penyakit (patogen). Kelompok bakteri endofit ini pada
umumnya berasal dari genus Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter, dan Agrobacterium
Beberapa pihak bahkan berspekulasi  bahwa  masih  dimungkinkan  adanya  beberapa  jenis 
bakteri  endofit  lain, seperti ricketsia, dan archaebacteria. Karena tumbuh dalam jaringan
tanaman, dimana tanaman yang satu tentunya berbeda dengan tanaman lainnya, maka tempat
hidup bakteri sangat unik sifatnya. Bahkan, fisiologi tumbuhan tinggi termasuk yang berasal
dari spesies yang sama akan beda di lingkungan yang berbeda. Karena itu keanekaragaman
bakteri endofit sangatlah tinggi. Berdasarkan pertimbangan tersebut endofit dapat menjadi
sumber berbagai metabolit sekunder baru yang berpotensi untuk dikembangkan dalam bidang
medis, pertanian, dan industri (Prasetyoputri & Ines, 2006 dalam Anonim, 2012)
 Teknik Menanam Bakteri
Inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium
yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri
(inokulasi) terlebih dahulu diusahakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan
medium agar tetap steril. Hal ini agar menghindari terjadinya kontaminasi. Tujuan inokulasi
adalah untuk mengetahui cara pembuatan medium  pembiakan bakteri dan untuk mengetahui
struktur bakteri pada medium  pembiakan.
A. Teknik Inokulasi
Ada beberapa metode inokulasi yaitu :
1. Metode gores
Teknik ini mempunyai dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu, tetapi
memerlukan ketrampilan-ketrampilan. Prinsip dari metode ini, yaitu mendapatkan koloni
yang benar- benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah proses
inokulasi. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri
dengan jarum pindah (lup inokulasi), diantara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel
yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni
Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yaitu:

a. Goresan T

b. Goresan kuadran

c. Goresan radian

d. Goresan sinambung
2. Metode sebar
Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam cawan petri
dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itu disebarkan
dalam medium batang yang sama dapat digunakan untuk menginokulasikan penyebaran
bakteri yang merata dengan baik. Pada beberapa cawan petri akan muncul koloni-koloni
yang terpisah
3. Metode tuang
Inokulasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan
pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya
ditemukan satu sel di dalam tabung.
4. Metode tusuk
Metode tusuk yaitu metode yang digunakan untuk medium tegak, yang dilakukan dengan
cara menusukkan ujung jarum yang didalamnya terdapat inoculum dan dimasukkan
kedalam media.

B. Macam-macam Media
1. Nutrient Agar
Nutrient  Agar (NA) adalah suatu medium berbentuk padat yang merupakan
perpaduan antara bahan alamiah dan senyawa-senyawa kimia.
Komposisi Nutrient Agar:
pepton 10 g, NaCl 5 g, air desitilat 1.000 ml dan 15 agar g/L.
2. Nutrient Broth
Nutrient Broth (NB) adalah medium yang berbentuk cair.
Perbedaan konsentris antara Nutrient Agar dengan Nutrient Broth yaitu nutrient agar
berbentuk padat dan Nutrient Broth berbentuk cair. Susunan kimia sama-sama
sintetik.
Komposisi Nutrient Broth :
5 g pepton, air distilasi/aquadest
C. Bentuk-Bentuk Media Inokulasi
1. Pertumbuhan pada plat agar
Ciri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut:

a. Ukuran;

Pinpoint/ small moderate Large

Punctiform (kecil) (sedang) (besar)
(titik)
b. Pigmentasi
Mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler,
beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yangdapat terlarut dalam
media.
c. Karakteristik optik
Diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni. Opaque (tidak dapat
ditembus cahaya),Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian),
Transparant (bening).
d. Bentuk
Circular, Irregular, Raised, Spindle, Convex, Filamentous, Umbonate, Rhizoid
e. Permukaan
Halus mengkilap, kasar, berkerut, kering seperti bubuk

2. Pertumbuhan pada Agar miring

Prinsip pembuatan medium agar miring adalah mengkulturkan 1 jenis mikroba
secara murni, dan menumbuhkan 1 jenis mikroba. Tujuannya untuk mengetahui
pertumbuhan mikroba pada medium agar miring.

3. Pertumbuhan pada Agar tegak

Cara penanamannya adalah dengan menusukkan jarum inoculum kedalam media
agar tegak. Perbedaannya dilihat dari ciri-ciri koloni berdasarkan bentuk dan
berdasarkan kebutuhan O2
4. Pertumbuhan pada Media cair
Media cair adalah salah satu cara membiakkan mikroba, medium ini berbentuk
cair yang dapat digunakan untuk menumbuhkan atau membiakan suatu mikroba.
Media cair dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung
kebutuhan.

D. Preparasi Inokulasi
Pada percobaan inokulasi dan peremajaan bakteri pada medium padat dan cair ini,
hal pertama yang harus dilakukan adalah membersihkan tempat yang akan digunakan
untuk penanaman bakteri. Tempat yang akan digunakan untuk menanam bakteri harus
bersih dan steril agar tidak terjadi kontaminasi pada penanaman, sehingga tidak terjadi
kesalahan dalam pengamatan hasil percobaan. Mikroorganisme memiliki ukuran yang
sangat kecil dan terdapat dimana-mana, sehingga kita harus dapat menjaga kesterilan
alat dan bahan yang akan digunakan. Semua pekerjaan dalam praktikum ini harus
memperhatikan prosedur teknik aseptis.
Teknik kerja aseptis dilakukan mulai dari penyiapan tempat yang dibersihkan
dengan alcohol 70% dan bekerja diantara 2 nyala api (baik menggunakan spiritus
maupun bunsen) dengan jarak kurang lebih 20 cm. Hal ini dilakukan untuk
mengurangi terjadinya kontaminasi. Alcohol yang digunakan untuk membersihkan
meja tempat dilakukan inokulasi adalah yang memiliki konsentrasi 70% karena
alcohol 70% memiliki sifat sebagai desinfektan, sedangkan alcohol 95% memiliki
perbandingan alcohol yang lebih sedikit dari pada air jadi tidak dapat digunakan
sebagai desinfektan, dan biasanya digunakan sebagai pelarut dalam ekstraksi bahan
alam. Sedangkan api harus dinyalakan minimal 10 menit sebelum mulai dilakukan
pekerjaan agar terjadi radiasi sehingga mikroorganisme menjauh dari tempat yang
dipanaskan.
Setiap alat tahan panas yang digunakan selama inokulasi harus diflambir
(dipanaskan sampai pijar) terlebih dahulu untuk menghindari kontaminasi. Jarum ose
diflambir pada ujungnya hingga membara dan kemudian terus bergerak mendekati
gagang. Hal ini dilakukan triplo di atas api. Arah gerak flambir ini sesuai arah gerak
bakteri dan bertujuan agar bakteri yang ada, tidak dapat lari saat diflambir. Untuk alat
lain, seperti tabung reaksi, flambir hanya cukup dilakukan dengan melewatkan mulut
alat beberapa kali di atas api biru bunsen. Setelah selesai, alat-alat tersebut didiamkan
beberapa detik terlebih dahulu agar suhunya sedikit turun. Hal ini mengingat bakteri
akan mati pada suhu yang terlalu panas, sehingga tidak akan ada biakan yang dapat
teramati pada saat pengamatan. Apabila tidak digunakan, jarum ose harus disimpan di
dalam alcohol 70% agar terhindar dari kontaminasi dan tetap dalam keadaan steril.
Sedangkan untuk pipet ukur yang telah selesai digunakan harus disimpan di dalam
desinfektan yang telah disediakan supaya bakteri sisa dari pemindahan tidak
berpindah ke tempat lain. Bakteri yang akan digunakan harus disuspensikan terlebih
dahulu dalam larutan NaCl 0,9%. NaCl 0,9% berfungsi sebagai larutan pengencer
konsentrasi bakteri. Pemilihan NaCl 0,9% dikarenakan bakteri tidak dapat tumbuh
dan berkembang biak dalam larutan tersebut, tetapi bakteri dapat hidup sehingga
dapat digunakan sebagai inokula.
 Teknik Menanam Bakteri berdasarkan Jurnal
1. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Endofit Pada Tanaman Teh (Camellia
Sinensis (L.) O Kuntze)
Bahan tanaman digunakan adalah bagian daun, batang dan akar tanaman teh/
tanaman belum menghasilkan (TBM). Masing-masing bagian yang diambil
merupakan jaringan muda dan sehat.
Metode ekstraksi tanaman diawali dengan mencuci bahan tanaman yang
didapatkan dari lapangan. Setiap bagian tanaman ditimbang sebesar satu gram.
Bagian permukaan bahan tanaman disterilkan dengan menggunakan alkohol 70%
selama 60 detik kemudian dibilas sebanyak dua kali (2x) dengan menggunakan air
aquadest steril. Bagian tanaman diekstrak menggunakan mortar steril didalam
laminar air flow. Pengenceran ekstrak dilakukan hingga 1.000 kali (10-3).

Media yang digunakan pada penelitian ini adalah Trypic Soy Agar (TSA)
Merck. Media TSA merupakan media selektif yang digunakan untuk mengisolasi
mikroba endofitik yang ada pada tanaman teh. Metode isolasi yang digunakan
adalah metode sebar dan metode tuang.
Formula Media TSA gr/liter terdiri dari Peptone Casein 15 g, Peptone
Soymeal 5.0 g, Sodium Chloride 5.0 g, agar-agar15 g.
Media dibuat dengan cara:
(i) Melarutkan 40 gram campuran media ke dalam 1 liter air distilasi (aquades) ;
(ii) Memanaskan dengan air mendidih atau aliran uap hingga homogeny;
(iii) Sterilisasi ke dalam autoklaf selama 15 menit pada
(iv) pH dimodifikasi dengan asam sulfat (H2SO4) hingga 5.5 pada 25 oC

2. Isolasi dan Pengujian Bakteri Endofit dari Tanaman Lada (Piper nigrum L.)
sebagai Antagonis terhadap Patogen Hawar Beludru( Septobasidium sp.)

Bahan yang digunakan adalah tanaman lada (batang dan buah), tanaman
tembakau, dan isolat Septobasidium s.
Isolasi bakteri dilakukan dengan metode tuang. Sebelum jaringan tanaman
diisolasi ke media NA, terlebih dahulu dilaku Kan sterilisasi permukaan
menggunakan akuades steril, NaOCl 5% dan alkohol 70%. Bakteri yang didapat
dari hasil isolasi kemudian dilakukan identifikasi berdasar warna, bentuk, elevasi,
pinggiran dan permukaan koloni,serta bentuk sel bakteri dan uji Gram dengan
 pemberian KOH 3% selanjutnya dilakukan pemurnian ke media NA miring. Jenis
dan jumlah bakteri yang didapat dari hasil isolasi kemudian dihitung jumlah dan
kerapatannya
3. Isolasi dan Pemurnian Bakteri Endofit dari Batang Mangrove
Sampel yang digunakan sebagai sumber isolat bakteri endofit berasal dari
batang mangrove Avicennia yang diperoleh dari Taman Wisata Alam Angke
Kapuk, Jakarta.
Sampel dipilih dari 3 pohon dan masing-masing pohon diambil perwakilan 3
ranting. Bekas petikan ranting bantang mangrove yang diambil kemudian ditutup
dengan kapas dan kain kassa steril untuk menghindari kontaminasi bakteri lain.
Batang mangrove yang telah dipetik harus langsung diisolasi untuk menghindari
perubahan dari bakteri endofit yang ada di dalam batang mangrove tersebut
sebelum 2x24 jam. Sebelum ditanam pada media TSA (Triptic Soy Agar) dan
ketokonazol sebagai anti jamur, ranting batang mangrove tersebut disterilisasi
permukaannya untuk menghindari pertumbuhan dari bakteri lain. Sterilisasi
permukaan batang dilakukan dengan merendam batang yang telah dipotong
berukuran kurang lebih 5 cm kedalam etanol 70% selama 5 menit, larutan narium
hipoklorit 0,1% selama 3 menit, larutan etanol 70% kembali selama 1 menit dan
terakhir dibilas dengan akuades steril selama beberapa kali untuk mendapatkan
batang steril. Natrium hipoklorit dan etanol berfungsi sebagai desinfektan yang
berguna untuk mensterilisasi permukaan dari batang mangrove secara kimia.
Batang steril yang didapat kemudian dibelah menjadi dua bagian dan ditanam
dengan posisi menelungkup kearah media yang telah padat. Cawan petri yag telah
berisi batang mangrove Avicennia kemudian diinkubasi selama 3x24 jam pada
suhu 270C-290C. Setelah 3 hari, bakteri endofit yang tumbuh kemudian dilakukan
permunian hingga 7 kali untuk mendapatkan isolat tunggal. Hasil pemurnian isolat
bakteri endofit didapatkan 9 isolat yang berasal dari batang mangrove Avicennia
marina. Kesembilan isolat tersebut kemudian dilakukan uji aktivitas antibiotik
terhadap bakteri Vibrio harveyi dan Staphylococcus aureus untuk mengetahui sifat
antagonisnya.
Media inokulum yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri endofit adalah
medium TSA (Triptic Soy Agar) yang memiliki kandungan soya peptondan kasein
pepton yang menyediakan nitrogen, vitamin, dan mineral bagi bakteri
endofit(Sigma-aldrich). Sedangkan untuk proses fermentasi dipilih medium MHB
(Mueller Hinton Broth) karena merupakan medium yang cocok digunakan untuk
pengujian antimikroba. MHB memiliki kandungan karbon, nitrogen, vitamin,
 sulfur, dan asam amino yang berasal dari ekstrak beef dan kasein untuk memenuhi
kebutuhan nutrien dari bakteri endofit(Sigma-aldrich)