MAKALAH HPLC High Performance Liquid Cro
MAKALAH HPLC High Performance Liquid Cro
Pendahuluans
1. Sejarah singkat
Tswett adalah penemu kromatografi pada tahun 1903.
Perkembangan kromatografi antara lain:
a. kromatografi cair-padat (KCP).
b. Kemudian, pada akhir tahun 1930an dan pada awal tahun 1940an, cara ini
mulai berkembang.Dasar kromatografi lapis tipis (KLT) diletakkan oleh
Izmailov.
c. Schraiber pada tahun 1938, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada
tahun 1958. Karya Martin dan Synge yang pada tahun 1041 membuahkan
hadian Nobel, tidak hanya merevolusikan kromatografi cair, tetapi juga
secara umum meletakkan landasan bagi perkembangan kromatografi gas
dan kromatografi kertas.
d. Pada tahun 1952, Martindan James mempublikasikan makalah
pertamanya mengenaim kromatografi gas. Antara tahun 1952 dan akhir
tahun 1960 an kromatografi gas berkembang menjadi alat analisis yang
canggih.
e. Hal ini menjadi dasar ditemukannya kromatografi yang canggih yaitu
kromatografi cair kinerja tinggi (High Perfomance Liquid Chromatografi).
2. Pengertian kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan
pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen
(berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase
gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam.
3. Jenis-jenis kromatografi
Kromatografi dibedakan menjadi 2 jenis yaitu:
a. Kromatografi cair (Liquid Chromatography) merupakan teknik yang
tepat untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu
larutan. Terdapat beberapa jenis kromatografi cair,
diantaranya: reverse phase chromatography, High Performance Liquid
Chromatography (HPLC), size exclusion chromatography,
serta supercritical fluid chromatography.
Reverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang
kuat dengan memadukan sifat hidrofobik serta
rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia
pada padatan inert seperti silika.
High performance liquid chromatography (HPLC) mempunyai
prinsip yang mirip dengan reverse phase. Hanya saja dalam
metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi.
Size exclusion chromatography atau yang dikenal juga
dengan gel permeation atau filtration chromatography biasa
digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein.
Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digunakan
untuk pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein.
4. Manfaat
a. Mengetahui teori–teori tentang HPLC (High Perfomance Liquid
Crhomatografi)
b. Mengetahui prinsip dasar kerja HPLC (High Perfomance Liquid
Crhomatografi)
c. Mengetahui cara mengoperasikan HPLC (High Perfomance Liquid
Crhomatografi)
5. Tujuan
a. Untuk mengetahui pengertian dan definisi kromatografi cair kinerja tinggi
b. Untuk memahami prinsip dasar kerja HPLC (High Perfomance Liquid
Crhomatografi)
c. Untuk mengetahui cara kerja HPLC (High Perfomance Liquid Crhomatografi)
untuk menerapkannya dalam analisis instrumental bahan anorganik
d. Mampu menggunakan HPLC (High Perfomance Liquid Crhomatografi) dalam
analisis bahan anorganik dalam laboratorium khusus instrumen.
B. Isi
1. Pengertian HPLC
Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid
chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair
yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi.
2. Jenis-jenis HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase
diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase
diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada
kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal
dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat
dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada
mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
e. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan
kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan
menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian
sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya.
Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi
dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang
berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat
menyebabkan puncak yang berekor.
f. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang
dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang
digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon
non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil.
Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS
atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan
air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah
atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak
tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi.
Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya
dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam
bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang
mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.
g. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar
kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion
yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas
penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan
kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena
sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran
misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar
ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam
total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar
garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan
oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak
untuk gugus penukar ion pada resin.
h. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan
sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat
pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang
mempunyai muatan yang berlawanan.
i. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan
dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa
dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat
berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat
melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase
diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan
terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran
medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini
disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan
tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam
pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia
antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
j. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi
biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus
molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi
yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang
sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).
Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein
(enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
a. Meningkatkan deteksi.
b. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan
menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik.
c. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik.
d. Menstabilkan analit yang sensitif.
Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis
sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan
gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di
samping itu, juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor
(senyawa yang mamapu berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan
fluorometri.
Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut,
yakni: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau
sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi
dengan spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan
produk yang sebesar mungkin (100 %); produk hasil derivatisasi harus stabil
selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus
tidakmenganggu pemisahan kromatografi.
Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain :
Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column
panjang gelombang.
Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah
senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu
d. Interpretasi output dari detector
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak,
dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam
campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.
Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan
waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang
diperoleh
.
Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X
yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara
otomatis melalui layar komputer.Area dihitung sebagai bagian
yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
7. Perawatan HPLC
Efisiensi pemisahan kolom HPLC tidak hanya tergantung pada kualitas kolom,
namun juga pada bagaimana kolom digunakan secara umum, kolom yang sering
digunakan adalah Silika. Kestabilan mekanik yang besar, sangat baik sifat
permukaan fisikokimia, berbagai ikatan kimia, dan kompatibel dengan berbagai
pelarut organik.
Berikut beberapa cara perawatan HPLC agar tetap dapat digunakan secara
efisien.
a. Stabilitas pH
kolom HPLC yang stabil dalam rentang pH 2 sampai 8. Jika
mengukur nilai pH, pengukuran harus dilakukan dalam media air
sebelum mencampur eluen dengan pelarut organik. HPLC kolom dapat
digunakan di luar rentang pH. Ikatan kimia baru yang memungkinkan
penggunaan sampai pH 1 untuk beberapa fasa diam. Fase stasioner
didasarkan pada silika gel ultra murni juga dapat digunakan pada
rentang pH yang lebih tinggi, sampai untuk pH 11, tergantung pada
sifat kimia pengubah yang digunakan dalam fase gerak. Basis Besar
(seperti Pyrolidine) tidak mampu menyerang permukaan silika dan
oleh karena itu dapat digunakan pada pH lebih tinggi.
b. Teknik Stabilitas
Fase stasioner didasarkan pada silika secara mekanik sangat
stabil, dikemas dalam kolom yang menunjukkan tidak ada batas
tekanan, dan dapat digunakan di lebih dari 40 MPa (6000 psi)
tanpa masalah. Tekanan menyebabkan guncangan penyaluran dalam
kolom, yang menghasilkan puncak membelah pada kromatogram
c. Eluen
Penggunaan pelarut murni non HPLC menyebabkan adsorpsi
ireversibel dari kotoran pada kolom. Kotoran ini memblokir situs
adsorpsi, mengubah selektivitas kolom dan mengarah ke puncak
memisahkan di kromatogram tersebut.
d. Penyimpanan Kolom
Untuk penyimpanan jangka pendek, kolom dapat
disimpan dalam eluen yang digunakan dalam terakhir analisis.
Untuk penyimpanan jangka menengah, yaitu 2 hari atau selama
akhir pekan, kolom harus dibilas dengan air yang murni untuk
mencegah pertumbuhan mikroba.
Untuk penyimpanan jangka panjang, silika kolom tersebut
harus dapat disimpan dalam pelarut aprotik. Kandungan air
tidak boleh lebih tinggi dari 50%. Yang terbaik adalah
pelarut Asetonitril.
C. Contoh Percobaan
1. Alat
a. High Perfomance Liquid Chromatograph (HPLC) Alliance 2695
b. Detector UV/VIS 2489 dilengkapi dengan kolom C-18, diameter 5 µl,
ukuran 4,6 x 150 mm dan Detektor UV-VIS terhubung.
c. Labu ukur 10 ml dan 100 mL
d. Pipet otomatik
e. Pipet tetes
f. Tabung filter
g. Beker glass
h. Tissue
2. Bahan
a. Vitamin C berbagai merek dan berbagai kadar (Vitacimin dan Xon-ce)
b. Standar vitamin C
c. Aqua bidest
3. Cara kerja
a. Pembuatan larutan standart
1) Ambil dan timbang standar vitamin C sebanyak 0,005 gr
2) Encerkan dengan aquabidest sampai 100 ml. masukkan ke dalam
labu ukur 100 ml.
3) Kemudian ambil 10 ml dari larutan tersebut dan masukkan ke
dalam labu ukur 10 ml
b. Pengujian sampel
1) Gerus halus masing-masing vitamin C yang tersedia (Vitacimin dan
Xon-Ce).
2) Ambil dan timbang vitamin C sebanyak 300 mg dan larutkan
dengan aquabidest.
3) Masukkan ke dalam labu ukur 100 mL
4) Ambil sebanyak 10 mL larutan dan encerkan sampai 100 mL
dengan aquabidest.
5) Ambil sebanyak 10 mL dari larutan sebelumnya dan masukkan ke
dalam labu ukur 10 mL
6) Masukkan larutan sampel dan larutan standart kedalam waterbath
selama 5 menit dan sempurna gelembung yang ada didinding
tabung hilang.
7) Pindahkan larutan sampel dan larutan standart ke dalam tabung
effendorf dengan menggunakan spuit 5 cc.
8) Masukkan larutan sampel dan larutan standart kedalam alat HPLC
( High Perfomance Liquid Chromatography).
9) Tunggu hasilnya yang akan di tampilkan oleh detektor.
4. Pembahasan
Dari hasil praktikum diatas di dapati hasil yang gagal karena tidak di dapati
persamaan linear yang akan digunakan untuk menghitung kadar sampel
vitamin C. Hal ini disebabkan karena kesalahan dalam melakukan
pengenceran (human error). Pada kurva yang di tampilkan di atas
menunjukkan peak kurva yang berbeda-beda di karenakan kadar vitamin C
yang diukur berbeda-beda.
5. Kesimpulan
a. Pengenceran merupakan faktor yang sangat penting karena mempengaruhi
kadar/konsentrasi vitamin C.
b. Seharusnya semakin tinggi peak dari kurva yang terlihat maka semakin
besar konsentrasi vitamin C.
c. HPLC merupakan suatu metode yang baik untuk menganalisa suatu produk
obat.