Materi: Penetapan Kadar Kafein dengan KLT-Densitometri

A. Pustaka
EGC. Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons. Fourth Edition. Pharmaceutical Press.
London. 2011. p. 1208
 British Pharmacopeia. 2004. p.
300 - 301

B. Alat dan Bahan

 Alat
1. Chamber
2. Pipa kapiler
3. Tutup chamber
4. Gelas ukur
5. Kertas saring
6. Labu ukur
7. Corong gelas
8. Pipet volume
9. Vial
10. Lempeng KLT
11. Pinset
 12. Botol timbang
13. Batang pengaduk
14. Timbangan miligram
15. Penggaris
16. Pensil
 Bahan
1. Kafein
2. Silica gel GF254
3. Fase gerak (metanol : etil asetat : ammonia 25% (13:77:10))

C. Cara kerja
a. Pembuatan eluen
1. Disiapkan chamber yang sudah bersih dan kering
2. Dibuat campuran metanol : etil asetat : ammonia 25% = 13 : 77 : 10
3. Dioleskan vaselin pada tepi – tepi chamber yang telah dicuci bersih dan kering
4. Dimasukkan campuran eluen ke dalam chamber yang telah dicuci dan dimasukkan
kertas saring panjang seukuran dengan chamber
5. Chamber ditutup dengan penutup yang sudah diberi vaselin agar kedap
6. Tunggu sampai chamber jenuh
b. Pembuatan larutan baku induk
1. Ditimbang kafein 100,7 mg di timbangan miligram
2. Menimbang botol timbang kosong di timbangan analitik dan dicatat beratnya
3. Dimasukkan kafein yang sudah ditimbang ke dalam botol timbang lalu dicatat
beratnya
4. Berat kafein = berat total – berat botol timbang kosong
5. Dilarutkan ad larut dengan metanol 70% di dalam botol timbang
6. Larutan kafein dituang ke labu ukur dengan bantuan corong gelas dan batang
pengaduk
7. Botol timbang dibilas dengan metanol 70% sampai menurut kita bersih
8. Dalam labu ukur ditambahkan metanol 70% di ad kan hingga tanda dan dikocok ad
homogen
c. Pembuatan baku kerja
1. Dipipet 10 ml larutan baku kerja dan dipindahkan ke labu ukur
 2. Ditambahkan metanol 70% hingga tanda dan dikocok ad homogen
3. Membuat 1 macam konsentrasi baku kerja
d. Penotolan pada lempeng KLT (Silica gel GF254)
1. Lempeng yang akan dimasukkan ke dalam chamber digaris dahulu dibagian atas (0,5
cm) dan bawah (1,5 cm) dengan pensil dan penggaris
2. Dimulai dengan larutan baku kerja kafein dengan konsentrasi terkecil (10μl, 20μl, 30
μl, 40 μl, 50 μl). Ditotolkan pipa kapiler pada larutan baku kerja kemudian
ditotolkan pada lempeng KLT
3. Saat penotolan, diameter dan jarak penotolan diusahakan sama
4. Kemudian lempeng KLT dikeringkan
5. Membuka tutup chamber dan memasukkan lempeng KLT menggunakan pinset ke
dalam chamber yang sudah jenuh dengan posisi berdiri kemudian ditutup kembali
6. Ditunggu sampai eluen bergerak naik ad tanda garis atas
7. Lempeng KLT dikeluarkan dan dikeringkan di lemari asam
8. Meletakkan lempeng di bawah UV lamp, dilihat fluorosensinya dan ditandai jarak
nodanya
9. Menghitung Rf senyawa dan dibandingkan dengan Rf standar untuk melihat
kebenaran senyawa
10. Dianalisa secara kuantitatif dengan densitometer

D. Perhitungan
a. Pembuatan baku induk
Botol timbang + sampel = gram
Botol timbang kosong = gram -
= 0,1007 gram
= 100,7 mg / 100 ml metanol 70%  1007 mg / 1000 ml
= 1007 ppm
b. Pembuatan baku kerja
Baku kafein = 100,7 ppm
Ditotol (μl) Area densitas Bobot (ng)
10 μl 499 000 (10 / 1) x 100,7 = 1007
20 μl 1 011 000 (20 / 1) x 100,7 = 2014
30 μl 1 498 500 (30 / 1) x 100,7 = 3021
40 μl 1 999 090 (40 / 1) x 100,7 = 4028
50 μl 2 501 900 (50 / 1) x 100,7 = 5035
 Regresi kurva baku kerja bobot (ng) vs area
a = 3731
b = 495,9176
r=1
y = a + bx
y = 3731 + 495,9176x

c. Penetapan kadar sampel kafein

Kafein = 102,5 mg dilarutkan metanol 70% tepat 100,0 ml
102,5 mg / 100 ml  1025 mg / 1000 ml  1025 ppm

Replikasi (μl) Area

I 10 1 050 050
II 20 2 001 500
III 40 3 499 500

Replikasi 1
y = 3731 + 495,9176x
1 050 050 = 3731 + 495,9176x
x = 2109,864623 ng / 10 μl
= 210,9864623 ng / μl (ppm)
210,9864623
Kadar = x 100% = 20,58%
1025

Replikasi 2
y = 3731 + 495,9176x
2 001 500 = 3731 + 495,9176x
x = 4028,42932 ng / 20 μl
= 201,421466 ng / μl (ppm)
201,421466
Kadar = x 100% = 19,65%
1025

Replikasi 3
 y = 3731 + 495,9176x
3 499 500 = 3731 + 495,9176x
x = 7049,09243 ng / 40 μl
= 176,2273107 ng / μl (ppm)
176,2273107
Kadar = x 100% = 17,19%
1025

x̅ = 19,14%
SD = 1,751599269
Rentang = x̅ ± SD
= 17,38840073 – 20,89159927 (replikasi 1 dan 2)
x̅ baru = 20,12%
SD baru = 0,657609307
SD 0,657609307
KV = x 100% = x 100% = 3,27%
x̅ 20,12