Accelerat ing t he world's research.

PEWARNAAN GRAM BUFFY COAT

najwa elyahya

Related papers Download a PDF Pack of t he best relat ed papers 

Sarkep Imun Laporan kasus T yphoid

zulfadli hussein

New doc 2018 02 23 21.10.10 20180223215347021x

Bernhard Purba

Jawet z, Melnick,& Adelberg Mikrobiologi Kedokt eran

melisa put ri
 PEWARNAAN GRAM BUFFYCOAT
MAKALAH

Oleh NAJWA
(Poltekkes Kemenkes Banjarmasin Jurusan Analis Kesehatan)

PENDAHULUAN
Pewarnaan Gram atau pewarnaan Gram, juga disebut metode Gram,
adalah metode pewarnaan yang digunakan untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar (gram-positif dan gram-negatif). Nama berasal
dari bakteriologi Denmark Hans Christian Gram, yang mengembangkan
teknik ini (John G. Holt., et al., 1994).

Pewarnaan Gram membedakan bakteri dengan sifat kimia dan fisika

dari dinding sel mereka dengan mendeteksi peptidoglikan, yang hadir dalam
dinding sel bakteri Gram-positif. bakteri gram positif mempertahankan
pewarna kristal violet, dan dengan demikian violet patri, sedangkan bakteri
Gram-negatif tidak; setelah mencuci, counterstain ditambahkan (umumnya
safranin atau fuchsine) yang akan mewarnai bakteri Gram-negatif ini warna
merah. Kedua bakteri Gram-positif dan bakteri Gram negatif mengambil
counterstain tersebut. counterstain, bagaimanapun, adalah tak terlihat pada
bakteri Gram-positif karena gelap dari warna kristal violet (John G. Holt., et
al., 1994).

Gram stain hampir selalu langkah pertama dalam identifikasi awal

dari organisme bakteri. Sementara pewarnaan Gram adalah alat diagnostik
yang berharga di kedua pengaturan klinis dan penelitian, tidak semua bakteri
dapat definitif diklasifikasikan dengan teknik ini. Hal ini menimbulkan gram-
variabel kelompok dan gram-tak tentu (John G. Holt., et al., 1994).

Pengembangan jenis dan metode pemeriksaan untuk deteksi dini

bermanfaat bagi para klinis untuk menetapkan penatalaksanaan. Manfaat ini
tidak hanya pada peningkatan angka kesembuhan dan penurunan angka
mortilitas, melainkan jua mengurangi penggunaan antibiotik yang tidak perlu
sehingga mengurangi resistensi antibiotik (Christina KN., et al., 2005).

Pewarnaan Gram dari buffy coat bisa digunakan untuk melakukan

deteksi awal bakteremia. Tes diagnostik yang cepat dengan pewarnaan Gram
dapat di interpretasikan dalam waktu satu jam dan dalam penelitian yang

1
 2

telah dilakukan Richmond et al. 2002, mempunyai sensitifitas 75% dan

spesifisitas 79% (Leka Lutpiatina., 2015).
Pemeriksaan apusan buffy coat dengan pewarnaan Gram adalah
alternatif untuk mendeteksi sepsis bakterial secara dini. Pemeriksaan ini
mudah dilakukan, cepat dan ekonomis. Bertujuan untuk mengetahui nilai
diagnostik pemeriksaan apusan darah buffy coat dengan pewarnaan Gram
(Christina KN., et al., 2005).

Gambar : Buffy coat (Husna AA., 2015)

Saat darah dalam sebuah tabung yang mengandung antikoagulan kita

sentrifuge, maka akan terbentuk 3 fraksi atau 3 lapis komponen darah dalam
tabung tersebut. Lapisan paling atas adalah plasma yang merupakan
komponen punyusun darah paling banyak yaitu sekitar 55%, lapisan paling
bawah merupakan eritrosit (kurang lebih 45%) dan lapisan tipis ditengah
merupakan buffy coat yang merupakan sebuah lapisan kecil terdiri atas
leukosit dan trombosit. Jadi buffy coat merupakan suspensi leukosit dan
trombosit yang besarnya <1% dari total darah. Jika dilihat secara visual, buffy
coat ini merupakan lapisan berwarna putih yang terletak di tengah tabung
dengan lapisan yang sangat tipis/sedikit (Husna AA., 2015).
 3

Kegunaan dari buffy coat ini adalah:

1. Digunakan untuk extraksi DNA dari darah mamalia, karena seperti yang
kita ketahui bahwa sel darah merah (eritrosit) merupakan sel yang tidak
memiliki inti, sehingga tidak ditemukan DNA.
2. Quantitative Buffy Coat (QBC) merupakan suatu uji laboratorium untuk
mengetahui infeksi malaria atau infeksi-infeksi lain yang disebabkan oleh
parasit seperti lesmania donovani, trypanosoma, mikrofilaria, dan jamur
patogen seperti Histoplasma kapsulatum. Parasit dan jamur ini ditemukan
dalam sel mononuklear besar pada lapisan buffy coat (Husna AA., 2015).

Cara membuat buffy coat untuk pemeriksaan :

1. Sentrifuge darah EDTA yang akan diperiksa dengan kecepatan 3000 rpm
selama 5-10 menit.
2. Dengan menggunakan pipet, buanglah supernatan (plasma) sehingga yang
tersisa hanya buffy coat dan sel darah merah.
3. Kemudian ambil lapisan buffy coat dan sel darah merah (kedalaman 1cm)
dan teteskan pada kaca objek.
4. Buatlah sediaan, dan lakukan seperti langkah kerja dalam pembuatan
sediaan.
5. Lakukan pewarnaan.
6. Setelah semuanya selesai, priksa dibawah mikroskop perbesaran 100x
(Husna AA., 2015).

Buffy coat adalah lapisan tipis di bagian tengah darah yang

disentrifugasi. Lapisan ini berwarna putih abu-abu dan mengandung leukosit
dan trombosit yang diapit oleh lapisan plasma yang ringan dan lapisan
eritrosit yang lebih berat (Richmond et al., 2002).

Jadi buffy coat merupakan suspensi leukosit dan trombosit yang

besarnya <1% dari total darah. Jika dilihat secara visual, buffy coat ini
merupakan lapisan berwarna putih yang terletak di tengah tabung dengan
lapisan yang sangat tipis/sedikit (Husna AA., 2015).
 4

HASIL-HASIL PENELITIAN

1. PEWARNAAN GRAM Buffy coat TERHADAP BAKTEREMIA

Penelitian yang dilakukan dengan sampel darah sebanyak 27 dari 27 orang

pasien di RSUD Ratu Zalecha Martapura pada bulan Maret sampai Mei
2013. Dengan hasil mikroskopis pada pewarnaan Gram buffy coat yang
ditemukan batang Gram negatif sebanyak 7 dan Gram negatif sebanyak
20.

Penelitian hasil kultur didapatkan bakteri Gram negatif sebanyak 6 dan

tidak ditemukan pertumbuhan sebanyak 21. Jenis bakteri Gram negatif
yang tumbuh pada agar darah bifasik didapatkan hasil jumlah isolat positif
bakteri E.coli dan Pseudomonas. sp sebanyak 1 dan Serratia sp dan
Klebsiella. sp sebanyak 2.

Hasil mikroskopis pewarnaan Gram dari buffy coat dan hasil kultur agar
darah bifasik pasien tersangka demam ditemukan Gram (-) dengan
pertumbuhan bakteri sebanyak 4 dan tidak ada pertumbuhan sebanyak 3,
tidak ditemukan bakteri Gram (-) dengan pertumbuhan bakteri sebanyak 2
dan tidak terdapat pertumbuhan sebanyak 18 didapatkan keseluruhan
totalnya sebanyak 27. Uji diagnostik dari data tersebut dihasilkan nilai
sensitifitas sebesar 67%, spesifistas 86%, nilai duga positif 57%, dan nilai
duga negatif 90%.

2. Buffy coat DENGAN PEWARNAAN GRAM PADA SEPSIS

NEONATORUM

Selama waktu penelitian sebanyak 461 neonatus dirawat di Instalasi

Maternal RS Dr.Sardjito Yogyakarta. 238 neonatus memenuhi kriteria
klinis sepsis, akan tetapi hanya 127 neonatus dapat memenuhi kriteria
inklusi dan eksklusi untuk observasi selanjutnya.
Diantara 52 neonatus dengan biakan darah positif, hasil positif pada
apusan buffy coat dengan pewarnaan Gram terdapat 40, yang terdiri dari
 5

kuman Gram positif 26 dan kuman Gram negatif 14, dengan bentuk
bakteri kokus Gram positif dan batang Gram negatif.
Kesepakatan antara 2 pemeriksaan gambaran bakteri pada buffy coat
menunjukkan nilai kappa = 0,75, kesepakatan yang cukup baik.
Nilai diagnostik menunjukkan pemeriksaan apusan buffy coat dengan
pewarnaan Gram unuk sepsis neonatorum.

3. Buffy coat PADA SEPTIKEMIA NEONATAL

Dari 200 kasus dugaan septikemia, terdapat 95 kasus darah kultur positif.
Jadi prevalensi septicemia neonatal dipenelitian ini adalah 47,5%.
organisme gram negatif yang dominan dengan 67 isolat (70,53%),
Enterobacter cloacae 19, Klebsiella pneumoniae 16, Citrobacter freundii
11, Escherichia coli 9, Citrobacter koseri 5, Pseudomonas aeruginosa 5
dan Acinetobacter 2. 28 Gram positif organisme diisolasi dalam penelitian
ini. Staphylococcus aureus 11, dan Listeria monocytogenes 1.

Kultur darah positif pada 95 dari 200 yang diduga kasus dan buffy coat
smear positif dalam 63 kasus. darah dan buffy coat smear positif di 47
kasus. 38 kasus yang positif dan BTA buffy negatif, 16 kasus yang negatif
dan smear buffy positif, 99 kasus buffy coat BTA negatif.
sensitivitas keseluruhan dari BCS adalah 31,5%. Sensitivitas dari BCS di
kultur darah kasus terbukti adalah 55,3% dan spesifisitas adalah 86,1%.
Positif nilai prediksi 74,6% dan negatif prediksi nilai 72,3%.

Dari positif 95 darah, 67 Gram isolat negatif. Dari 67 isolat tersebut, tes
CRP positif di 60 kasus dan buffy coat smear positif dalam 34 kasus.
Dari 95 positif kultur darah, 28 Gram isolat positif. Dari 28 isolat tersebut
tes CRP adalah positif dalam 23 kasus dan buffy coat BTA positif dalam
13kasus.

4. Buffy coat 16S rRNA PCR PADA BAKTERIMIA.

Dalam waktu penelitian terdapat sebanyak 114 pasien yang dirawat di

Ospital ng Makati yang memenuhi kriteria untuk sepsis dan dapat
dilibatkan dalam penelitian, terdapat 52 laki-laki dan 62 perempuan,
 6

48 dari 114 sampel darah positif untuk pertumbuhan bakteri yang

terdeteksi diidentifikasi dengan menggunakan sistem VITEK. Setiap
sampel berhubungan dengan pasien yang berbeda dan hanya menghasilkan
satu spesies mikroba.

Perbandingan buffy coat PCR dengan kultur darah, buffy coat PCR
menunjukkan bahwa 47 dari 114 spesimen yang positif dibandingkan
dengan 48 positif yang diperoleh dengan kultur darah secara keseluruhan.

Bakteri Gram positif Peptostreptococcus magnus tidak terdeteksi.

Koefisien Kappa dari 0,9819 menunjukkan kesepakatan yang sangat baik
dan menunjukkan bahwa buffy coat PCR dapat digunakan sebagai metode
alternatif untuk kultur darah keseluruhan untuk diagnosis bakteremia.
Kekhususan (100%), sensitivitas (97,1%), PPV (100%) dan NPV (98,5%)
untuk metode ini sangat tinggi. Gambar menunjukkan amplikon dari
beberapa spesimen menggunakan primer universal, primer Gram-spesifik
dan manusia β-globin primer kontrol positif.

Perbandingan kultur buffy dengan kultur darah seluruh, kultur Buffy

menunjukkan bahwa 47 dari spesimen yang positif untuk pertumbuhan
bakteri. The obligat anaerob P. magnus, yang terdeteksi dalam sampel
darah utuh, tidak dapat dideteksi dalam mantel buffy karena kurangnya
spesimen untuk kultur anaerobik. Hasil budaya aerobik menggunakan
darah utuh dan buffy coat identik, mengidentifikasi bakteri Gram-positif
dan Gram-negatif yang sama. Koefisien Kappa 1.0 menunjukkan
perjanjian lengkap antara dua metode dan menegaskan bahwa kultur buffy
dapat digunakan sebagai metode alternatif untuk kultur darah seluruh rutin.
Dibandingkan dengan biakan darah keseluruhan, kekhususan, sensitivitas,
PPV dan NPV budaya mantel buffy 100%.
 7

PEMBAHASAN

Pada penelitian Leka Lutpiatina., (2015), hasil mikroskopis pewarnaan

Gram buffy coat dibanding hasil kultur darah agar bifasik mempunyai nilai
sensitifitas, spesifisitas, nilai duga positif, nilai duga negatif, secara berturut-
turut adalah 67%, 86%, 57%, 90%. Dihasilkan hasil mikroskopis pewarnaan
Gram buffy coat dibandingkan hasil kultur darah agar bifasik mempunyai
nilai sensitivitas 67% dan spesifisitas 86%. Hal ini tidak berbeda jauh dengan
penelitian yang dilakukan oleh Richmond et al. (2002), yang mempunyai
sensitifitas 75% dan spesifisitas 79%, nilai duga positif 43% dan nilai duga
negatif 94%.
Mikroskopis pewarnaan Gram buffy coat dengan hasil negatif terdapat
pada dua sampel dengan hasil kultur positif, konsentrasi yang besar dari
bakteri dalam sampel diperlukan untuk dapat terlihat dalam pemeriksaan
mikroskopis. Konsentrasi bakteri dalam darah yang dapat divisualisasikan
harus mencapai > 4x10³ cfu/ml (Richmond et al. 2002). Hasil positif dengan
terlihatnya batang Gram negatif pada pewarnaan Gram tetapi tidak diiringi
dengan pertumbuhan koloni pada kultur dapat menandakan ditemukannya
bakteri yang tidak viable (hidup) didalam preparat Gram.
Kegunaan pewarnaan Gram dari buffy coat sebagai alat yang cepat
dalam mende-teksi bakteremia pada pasien dewasa yang mengalami tanda
dan gejala klinis sepsis telah dibuktikan (Richmond et al. 2002). Metode
pewarnaan Gram dari buffy coat dan kultur dengan menggunakan darah
perifer yang ditampung pada tabung hematokrit kapiler, juga telah
menghasilkan prosedur diagnosis dini bayi bakteremia dan septikemia
(Joubori S, 2006).

Keterbatasan dalam penelitian Nugraha et al adalah bahwa populasi

hanya pada neonatus dengan gejala sepsis klinis. Seperti diketahui, agar suatu
uji diagnostik dapat diterapkan pada populasi (neonatus) secara umum,
seharusnya subjek penelitian meliputi semua spektrum pasien dengan
berbagai gejala, mulai dari tanpa gejala, gejala ringan, hingga gejala berat.
Untuk menerapkan hasil penelitian ini pada populasi yang lebih luas,
diperlukan penelitian lanjutan dengan populasi semua spektrum neonatus.

Dalam prevalensi penelitian Rajendra Prasad et.al., (2012), yang

dominan gram negatif organisme adalah spesies Klebsiella dengan tingkat
 8

isolasi 24,6% untuk 42,2%. Klebsiella adalah untuk kedua Enterobacter

cloacae. Mahapatra et al, Antony B dan Rajendra Prasad BPM melaporkan
Enterobacter cloacae sebagai patogen dominan dalam studi mereka.
Prevalensi Enterobacter cloacae dalam penelitian Rajendra Prasad et.al
adalah 28,35%.

Buffy coat smear (BCS) studi dianggap sebagai salah satu tes cepat
yang tersedia untuk diagnosis septikemia neonatal, meskipun ada hasil
variabel. Chandna A et al melaporkan sensitivitas 50% positif untuk smear
kultur buffy dalam studi mereka. Sedangkan Parikh M dan Singh N
melaporkan akridin oranye buffy berwarna coat smear sensitivitas 68,5% dan
spesifisitas 91,9%.

Adapun dalam penelitian Demetrio L Valle Jr et al, (2010),

menggunakan hanya 5 mL darah untuk kultur buffy coat, yang kontras
dengan 10 mL darah digunakan untuk kedua budaya seluruh darah aerob dan
anaerob. Volume yang lebih kecil digunakan untuk menentukan kelayakan
untuk kasus alternatif, seperti pasien anak dengan geriatri, dimana volume
darah tidak cukup untuk botol kultur rutin digunakan. Semua mikroorganisme
diisolasi dan diidentifikasi dengan menggunakan metode kultur buffy coat
sependapat dengan hasil kultur darah keseluruhan, yang membuat volume
lebih kecil alternatif yang menjanjikan untuk kultur darah. Sensitivitas tinggi
(100%), PPV (100%) dan NPV (100%) mendukung pemanfaatannya sebagai
metode alternatif budaya.

Meskipun seluruh darah dan kultur buffy menyajikan banyak

keuntungan dan akurasi yang tinggi, untuk sepsis atau kasus yang
mengancam jiwa lainnya menular tidak ada pertanyaan bahwa metode
diagnostik yang lebih cepat adalah lebih baik. Kultur membutuhkan waktu
minimal tiga hari untuk menyelesaikan, tergantung pada seberapa cepat
mikroorganisme tumbuh. meskipun demikian, metode ini hadir berbagai
tingkat sensitivitas, yang dianggap cukup dapat diterima tetapi tidak unggul.
Dibandingkan dengan seluruh darah dan buffy coat PCR dievalusi alam
penelitian ini, metode tersebut tampaknya kurang sensitif dan kurang spesifik.

Hasil penelitian Demetrio L Valle Jr et al, (2010), menunjukkan buffy

coat PCR dapat diandalkan untuk mendeteksi bakterimia dan menentukan
Gram reaktivitas bakteri. Pasien kemudian dapat segera diobati dengan
antibiotik empiris setelah mikroorganisme ditentukan sebagai Gram-positif
 9

atau Gram-negatif. Namun, buffy coat PCR tidak bisa, pada saat ini, semata-
mata diminta karena tidak bisa paralel nilai kultur darah rutin dalam hal
isolasi spesies, identifikasi dan uji kerentanan antimikroba, terutama dalam
kasus-kasus bakteri resisten multi-obat, dimana terapi antibiotok empiris tidak
layak.

Jadi dapat disimpulkan bahwa penelitian Demetrio L Valle Jr et al,

(2010), buffy coat PCR, kultur buffy coat dan seluruh darah PCR dapat
digunakan sebagai metode alternatif untuk kultur darah keseluruhan dalam
mendeteksi bakterimia, dengan kultur buffy coat menunjukkan kesepakatan
100% dengan kultur darah utuh dan buffy coat PCR meunjukkan sensitivitas
yang lebih tinggi dan NPV dari PCR darah utuh. Selain, ada kolerasi
langsung dari WBC >12000/ mm3 untuk terjadinya bakterimia.
 10

DAFTAR PUSTAKA

Christina, K.N., Achmad Surjono, Tony Sadjimin, (2015), Uji diagnostik apusan
buffy coat dengan pewarnaan gram pada sepsis neonatorium, Berkala
Ilmu Kedokteran, Vol.37, No.1. Yogyakarta.

Dementrio, L.V.Jr., Jeannie, I.A., Esperanza, C.C., Windell, L.R., (2010)

Evaluation of buffy coat 165 rRNA PCR, buffy coat culture and whole
blood PCR for detection of bacteraemia, Mern Inst. Oswaldo Cruz, Rio
de Janelro, Vol 105, No.2, pp, 117-122. Manila, Philippines.

El-Garnal, A.H., Al-Otaibi, S.R., Alshamali, A., Abdulrazzaq, A., Najem, N., and
Fouzan, A.A. (2009); Polymerase chain reaction is no better than
Gram stain for diagnosis of gonococcal urethritis. Indian Journal of
Dermatology, Venereology, and Leprology, 75, 101.

Husna, A.A., (2012), Buffy coat : definisi dan kegunaannya.

http://laboratoryinfo.blogspot.co.id/2015/07/buffy-coat-definisi-dan-
kegunaannya.html - diakses tanggal 1 Februari 2017.

John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath; James T. Staley; Stanley T.
Williams (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th
ed.). Lippincott Williams & Wilkins. p. 11. ISBN 0-683-00603-7.

Leka Lutpiatina,. (2005). Pewarnaan Gram Buffy coat untuk deteksi awal pasien
Bakterimia. Medical Laboratory Technology Journal., Vol 1 (1) 38-46,
ISSN 2461-0878. Banjarbaru.

Rajendra Prasad, B.P.M, Basavaraj, K.N., Becna Antony, (2012), Rapid diagnosis
of neonatal septicemia by buffy coat smear examination and C-reactive
protein test in correlation with blood culture, International Journal of
Biological & Medical Research, Vol 3, No.2, pp.1658-1661. Karnataka,
India.

Richmond, C., Reyes., M.D., Emmanuel Edwin, R., Dy, M.D., and Shirley
Cresswell, HCLD. (2002). ‘The utility of buffy coat Gram stain for the
detection of bacteremia in patients with sepsis’, Phil J Microbiol Infect
Dis, Vol. 31, No. 2, pp. 70-73.