LAPORAN KEGIATAN PPDH

LABORATORIUM DIAGNOSTIK

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ASAL SAMPEL

SWAB ULKUS PADA RONGGA MULUT KUCING DOMESTIK

Inayati Ilmi B9404231055

Kelompok C1 PPDH Periode 1 2023/2024
Stase Diagnostik

Dosen Pembimbing :
Dr. drh. Novericko Ginger Budiono, M.Si

BAGIAN LABORATORIUM DIAGNOSTIK

PROGRAM PENDIDIKAN PROFESI DOKTER HEWAN
SEKOLAH KEDOKTERAN HEWAN DAN BIOMEDIS
IPB UNIVERSITY
2023
 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Feline calicivirus (FCV) merupakan penyakit virus yang patogen dan sangat
menular dengan penularan yang sangat luas pada populasi kucing. Virus ini
merupakan virus single strain-RNA yang menyerang kucing domestik dan kucing
eksotis diseluruh dunia. Infeksi Feline calicivirus umumnya terkait dengan ulserasi
mulut dan air liur sindrom klinis lain yang dikaitkan dengan infeksi FCV termasuk
stomatitis kronis dan sindrom pincang (Berger et al. 2015). Beberapa kucing tetap
menjadi pembawa asimtomatik setelah infeksi akut FCV, menjadi sumber infeksi bagi
kucing lain yang rentan. FCV dikaitkan dengan gejala klinis yang berbeda termasuk
gejala pernapasan, ulcer pada mulut dan gingivitis atau stomatitis (Afonso et al 2017).
Proses identifikasi bakteri penyebab penyakit tertentu dimulai dari serangkaian
proses yang disebut isolasi bakteri. Pemisahan mikroorganisme diperlukan untuk
mengetahui jenis, mempelajari morfologi, fisiologi serta karakteristik mikroorganisme
tersebut. Isolasi merupakan serangkaian pemisahan mikroorganisme supaya
didapatkan kultur murni (isolat).

Tujuan
Makalah ini bertujuan mengetahui tahapan-tahapan isolasi dan identifiksasi
bakteri dari sampel swab ulkus pada rongga mulut kucing domestik.
 METODE

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan yaitu ose, inkubator, korek api, bunsen, cotton swab,
miikroskop, gelas objek, pipet. Bahan yang digunakan yaitu sampel, kapas, label,
media transport, Blood Agar (BA), MacConkey Agar (MCA), hasil kultur bakteri di
BA, MCA, dan Tryptic Soy Agar (TSA) media, hasil subkultur bakteri di TSA, aquades,
crystal violet, lugol, safranin, aceton alkohol, alkohol 70% .

Prosedur Penelitian
Anamnesa dan Sinyalemen kucing 1
Nama Hewan : Wawa
Jenis Hewan : Kucing
Ras : DSH
Jenis kelamin : Jantan
Umur : 5–6 tahun
Riwayat vaksinasi : belum vaksin

Gambar 1 Kucing Wawa Gambar 2 Lesio abses kucing Wawa

Luka abses kulit bagian leher sudah satu tahun belum kunjung sembuh, luka
sudah sempat dioperasi dengan skinflap dan dipasang drainase, bagian drainase tidak
kunjung sembuh dan tetap terlihat adanya abses. Ada beberapa bagian spot kulit yang
mengalami penebalan. Berdasarkan keterangan pemilik, pemeriksaan lesio kulit
dengan Woodlamp hasilnya negatif. Sampel yang diambil dari kucing Wawa yaitu
swab pada abses.
Anamnesa dan Sinyalemen kucing 2
Nama kucing : Pippin
Jenis hewan : Kucing/ DSH
Jenis kelamin : Jantan
Umur : 8 tahun
Warna : Hitam putih
Vaksinasi : Belum vaksin
 Gambar 3 Kucing Pippin hipersalivasi
Kucing ditemukan 12 Januari 2015. Kucing mengalami bersin-bersin,
hipersalivasi sejak Juli 2021. Kucing Pippin sudah diberikan berbagai antibiotik antara
lain : Amoxicillin, Gentamicin, Doxycyclin, Penicillin, Oxytetracycline, namun tidak
kunjung sembuh. Diagnosis klinis kucing Pippin adalah stomatitis. Sampel yang
diambil dari kucing Pippin yaitu swab rongga mulut.

Rancangan Percobaan

Koleksi dan Isolasi Sampel

Isolasi pada Blood Agar Isolasi padaMacConkey

Isolasi pada TSA

KOH 3 % dan
Pewarnaan Gram

Gram Negatif Gram Positif

Basil Kokus

Uji Katalase

Negatif Positif

Uji CAMP Uji Glukosa

Mikroaerofilik
k
Kultur Bakteri pada Media Blood Agar (BA) dan MacConkey (MCA)
Kultur bakteri dilakukan secara aseptis agar meminimalisir kontaminan.
Pertama semprotkan alkohol pada meja kerja kemudian bunsen dinyalakan. Ose
dibakar menggunakan bunsen untuk mensterilkan dan didiamkan sebentar agar tidak
terlalu panas. Sampel diambil menggunakan ose sebanyak satu loop, media transoprt
dibuka disekitar api bunsen. Sampel digoreskan pada plate BA dan MCA yang telah
diberi label dan tanda 3 kuadran dengan teknik T-Straight. Kultur yang telah dibuat
diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 37oC.

Subkultur Bakteri pada Media Tryptic Soy Agar (TSA)

Subkultur bakteri dilakukan secara aseptis agar meminimalisir kontaminan.
Pertama semprotkan alkohol pada meja kerja kemudian bunsen dinyalakan. Ose
dibakar menggunakan bunsen untuk mensterilkan dan didiamkan sebentar agar tidak
terlalu panas. Sampel diambil menggunakan ose, pastikan di membuka media transoprt
disekitar api bunsen. Sampel yang diambil adalah kultur bakteri pada kuadran III
karena di daerah tersebut terdapat koloni terpisah, ditorehkan pada media TSA yang
telah diberi label. Kultur yang telah dibuat diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 37oC.

Perwarnaan Gram
Bakteri yang telah disubkultur dikeluarkan dari inkubator. Pewarnaan gram
dilakukan secara aseptis. Pertama alkohol 70% disemprotkan ke meja kerja. Kemudian
bunsen dinyalakan apinya. Gelas objek yang telah dipersiapkan dicuci terlebih dahulu
oleh alkohol 70% lalu dikeringkan. Aquades diambil menggunakan pipet lalu
diteteskan diatas gelas objek. Ose yang telah dipanaskan ditunggu sampai tidak panas
sekitar 1–2 menit. Lalu hasil subkultur dapat diambil menggunakan ose secukupnya
dan dihomogenkan pada aquades yang ada di gelas objek. Kemudian dapat dikeringkan
dengan dipanaskan secara perlahan di atas bunsen sampai kering. Setelah itu dapat
ditetesi kristal violet ditunggu selama 1 menit, kemudian lugol ditunggu selama 1
menit, kemudian diberi larutan aceton sebegai pemucat, kemudian dikeringkan dan
ditetesi safranin ditunggu 15 detik, hasil dapat dibilas dengan akuades lalu dikeringkan
dan dapat diamati dibawah mikroskop.

Uji KOH 3%
Uji KOH 3% dilakukan beriringan saat dilakukan pewarnaan gram. Gelas objek
yang telah dibersihkan dengan alkohol 70%. Gelas objek yang telah bersih ditetesi
KOH 3%. Hasil subkultur dapat diambil menggunakan ose yang telah steril lalu
dihomogenkan dengan KOH 3% pada gelas objek. Hasil dapat diamati jika tampak
lendir dapat dikatakan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif. Jika
hasil tidak menunjukan lendir dapat dikatakan bahwa bakteri tersebut merupakan
bakteri gram positif.

Uji Katalase
Gelas objek yang telah dibersihkan dengan alkohol 70% diberi penanda
lingkaran dengan marker lalu diteteskan H2O2. Kemudian ose yang yang telah
disterilkan dengan api bunsen ditunggu 1–2 menit. Hasil subkultur bakteri dari TSA
diambil menggunakan ose secukupnya lalu dihomogenkan dengan H2O2 yang ada di
gelas objek. Kemudian hasil dapat diamati jika terbentuk gelembung maka uji ini
positif dengan arah bakteri Micrococcaceae. Jika hasil tidak terbentuk gelembung maka
gelembung maka uji ini positif dengan arah bakteri streptococcaceae.

Uji Glukosa Mikroaerofilik

Sampel yang bernilai positif pada uji katalase akan dilanjutkan dengan uji
glukosa mikroaerofilik. Uji glukosa mikroae berofilik dilakukan dengan tabung reaksi
yang berisi glukosa. Isolat bakteri diambil 1–2 ose dan diinokulasikan ke dala tabung
dan dimasukkan dalam anaerobic jar bersama dengan lilin yang menyala sebagai
indikator keberadaan oksigen di dalam jar. Lilin akan padam ketika kadar oksigen di
dalam jar habis, sehingga tercipta suasana mikroaerofilik, dan diinkubasi dalam suhu
37oC selama 24 jam. Hasil negatif uji glukosa mikroaerofiliki tidak terjadi perubahan
warna merah ke kuning dan dapat disumpulkan bakteri dari genus Micrococcus sp.
Hasil positif fermentasi glukosa dapat dilihat dengan perubahan warna media menjadi
kuning. Sampel positif pada uji glukosa mikroaerofilik akan ditumbuhkan pada media
MSA yang mengandung garam NaCl 7,5% yang dapat menghambat pertumbuhan
bakteri selain Staphylococcus. Koloni Staphylococcus aureus yang tumbuh akan
berwarna kuning pada media, sedangkan jika warna agar tetap merah menunjukkan
bahwa sampel tersebut merupakan bakteri Staphylococcus epidermidis.
 HASIL DAN PEMBAHASAN

Gambar 4 Hasil isolasi kultur pada media MCA tampak atas

(gambar kiri) dan bawah (gambar kanan) tidak ada
pertumbuhan koloni.

Gambar 5 Hasil isolasi bakteri pada media BA tampak atas

(gambar kiri) dan bawah (gambar kanan) ada pertumbuhan
koloni berbentuk bulat, bening, dan beta-hemolisis (panah
biru) dan koloni berbentuk bulat kecil, putih opaque, gamma-
hemolisis (panah hijau).

Hasil inkubasi kultur bakteri pada BA terdapat pertumbuhan sedangkan pada

media MCA tidak terdapat pertumbuhan bakteri. Berikut ringkasan morfologi kultur
bakteri yang ditemukan pada media BA.

Parameter koloni Koloni 1 (panah biru) Koloni 2 (panah hijau

Ukuran besar kecil
Bentuk bulat bulat
Permukaan rata rata
Aspek mengkilat mengkilat
Tepi halus halus
Elevasi timbul timbul
Pigmentasi putih putih
Sifat hemolitik Beta hemolisis Gamma hemolisis
Sifat tembus cahaya Opaque Opaque
 Gambar 6 Hasil pewarnaan gram dilakukan sebanyak 2x pengulangan
memastikan kemurnian subkultur TSA, pewarnaan menunjukan hasil
warna yang tidak homogen yakni terdapat warna merah dan biru
(panah biru).
Hasil pengamatan pewarnaan gram dari bakteri ini konsisten dengan hasil
bentuk bulat, koloni bergerombol namun warna tidak homogen yakni terdapat warna
merah dan biru. Hal ini menunjukan bahwa hasil subkultur bakteri tidak murni. Hasil
pewarnaan gram tidak sejalan dengan hasil kultur bakteri pada media MCA yang tidak
terjadi pertumbuhan. Hipotesis awal kultur bakteri ini merupakan golongan bakteri
gram positif karena pada media MCA yang merupakan media selektif bagi kultur
bakteri gram negatif tidak ada pertumbuhan koloni, namun hal ini tidak sejalan dengan
pewarnaan gram yang menghasilkan warna bakteri yang merah. Hal ini dapat
dijelaskan dengan beberapa kondisi saat melakukan kultur pada media MCA, ose yang
digunakan masih panas sehingga bakteri yang diambil mati dan tidak tampak
pertumbuhan di media tersebut.
Sampel kucing kedua yaitu kucing Pippin dari swab oral telah dikultur pada
media BA dan MCA dengan hasil pertumbuhan hanya pada media BA. Isolat bakteri
sampel swab rongga mulut ditumbuhkan pada media BA, darah memiliki fungsi untuk
mempersubur pembenihan dan menumbuhkan bakteri yang sukar tumbuh pada
pembenihan biasa (Entjang 2003). Blood agar digunakan untuk membedakan bakteri
berdasarkan kemampuan hemolitiknya pada sel darah merah (Yeh et al. 2009). Koloni
yang tumbuh pada BA diidentifikasi bentuk morfologi (ukuran, bentuk, pinggiran dan
warna) serta jenis hemolisisnya.
Tiga jenis hemolisis yang dapat dilihat pada media BA yaitu alfa (α), beta (β),
dan gamma (γ). Hemolisis alfa merupakan hemolisis parsial yang akan menimbulkan
warna hijau di sekitar koloni bakteri yang berasal dari biliverdin dan merupakan produk
sampingan pemecahan hemoglobin (Madigan et al. 2006). Hemolisis beta adalah
proses lisis sempurna sehingga terbentuk zona jernih di sekitar koloni bakteri
(Mangindaan dan Losung 1991). Hemolisis gamma sel darah merah tidak mengalami
lisis dan tidak ada perubahan medium di sekitar koloni (Yeh et al. 2009).
 Subkultur dilakukan pada media TSA sebanyak 2 subkultur dengan koloni yang
berbeda. Koloni yang diamati dan dilanjutkan uji identifikasi pada makalah ini yaitu
koloni 2. Berikut ringkasan morfologi kultur bakteri yang ditemukan pada media BA :

Gambar 8 Hasil kultur swab oral kucing Pippin pada media BA tampak atas
(gambar kiri) terdapat koloni berbentuk bulat kecil opaque putih (koloni 1)
dan koloni berbentuk bulat besar dan bening (gambar kanan).

Parameter koloni Koloni 1 Koloni 2

Ukuran besar besar
Bentuk bulat bulat
Permukaan rata rata
Aspek mengkilat mengkilat
Tepi halus halus
Elevasi timbul timbul
Pigmentasi putih putih
Sifat hemolitik Gamma-hemolisis Gamma-hemolisis
Sifat tembus cahaya opaque bening

Gambar 9 Hasil pewarnaan gram

subkultur kucing Pippin dari media
 Identifikasi dilanjutkan dengan pewarnaan Gram untuk melihat morfologi dan
kemurnian bakteri. Bakteri Gram positif akan berwarna ungu dan dapat berbentuk basil
(batang), kokus (bulat), maupun kokobasil (Dewi 2013). Hasil pengamatan pewarnaan
gram dari bakteri ini konsisten dengan hasil warna ungu, bentuk bulat, koloni
bergerombol. Hasil pewarnaan gram sejalan dengan hasil kultur bakteri pada media
MCA yang tidak menghasilkan pertumbuhan. Hipotesis awal bakteri ini merupakan
golongan bakteri positif karena MCA merupakan media selektif bagi kultur bakteri
negatif terbukti.
Pengujian KOH 3% akan menunjukan bahwa bakteri gram positif memiliki
dinding sel yang tebal dan lemak yang tipis, sedangkan Gram negatif memiliki lemak
yang lebih tebal dan dinding sel lebih tipis. KOH akan bereaksi pada bagian lemak
bilayer lipid dan membuat sel bakteri gram negatif pecah. Sel yang pecah akan
melepaskan materi genetik yang berbentuk sticky strings atau menyerupai lendir
(Hardiansyah et al. 2020). Isolat bakteri yang diambil dari TSA hasil uji KOH 3%
bernilai negatif tidak menghasilkan lendir dan menunjukan bahwa bakteri tersebut
merupakan bakteri Gram positif.
Sampel kemudian diuji oksidase dengan cara mengoleskan satu ose isolat
bakteri dan diteteskan dengan reagen oksidase. Hasil positif menunjukkan bahwa
bakteri tersebut memiliki enzim oksidase, kertas saring tempat isolat diinokulasikan
akan berwarna hitam keunguan.
Sampel bakteri yang berbentuk kokus akan dilanjutkan dengan uji katalase
yang bertujuan untuk membedakan bakteri Micrococcaceae (positif) dan
Streptococcaceae (negatif). Sampel pada gelas objek diteteskan dengan H2O2 3% dan
dicampurkan dengan menggunakan ose. Terbentuknya gelembung-gelembung udara
menandakan bahwa hasil bernilai positif (Hadioetomo 1990). Bakteri yang memiliki
enzim katalase akan menghasilkan gelembung yang disebabkan adanya gas oksigen
dari penguraian H2O2 (Panjaitan et al. 2020). Seluruh bakteri kokus yang diuji katalase
bernilai positif yang berarti merupakan bagian dari Micrococcaceae. Sampel yang
bernilai positif pada uji katalase akan dilanjutkan dengan uji glukosa mikroaerofilik.
Uji glukosa mikroaerofilik dilakukan menggunakan tabung reaksi yang berisi
glukosa. Isolat bakteri diambil 1-2 ose dan diinokulasikan ke dalam tabung dan
dimasukkan dalam anaerobic jar bersama dengan lilin yang menyala sebagai indikator
keberadaan oksigen di dalam jar. Lilin akan padam ketika kadar oksigen di dalam jar
habis, sehingga tercipta suasana mikroaerofilik, dan diinkubasi dalam suhu 37oC
selama 24 jam. Hasil positif fermentasi glukosa dapat dilihat dengan perubahan warna
media menjadi kuning.
 Uji lanjutan jika uji katalase positif yaitu uji glukosa mikroaerofilik, hasil uji
menunjukan hasil negatif ditunjukkan pada Gambar 10. Hasil negatif pada uji glukosa
microerofilik dapat disimpulkan genus bakteri dari swab oral salah satunya adalah
Microccus sp. Microccus sp. merupakan flora normal yang tidak patogen namun
adanya faktor penurunan dari sistem imun dapat mendukung terjadinya overgrowth
dari flora normal yang mempengaruhi kesehatan dari hewan.

Gambar 10 uji Glukosa microaerofilik dengan hasil negatif (warna merah).

SIMPULAN
Isolasi bakteri sampel swab ulcer rongga mulut kucing Pippin teridentifikasi
salah satu bakteri dengan jenis Micrococcus sp. Micrococcus sp. tidak termasuk bakteri
patogen namun pada keadaan tertentu bakteri ini dapat mengalami overgrowth yang
mengganggu kesehatan hewan.

DAFTAR PUSTAKA
Afonso MM, Pinchbeck GL, Smith SI, Daly JM, Gaskell RM, Dawson S, Radford
AD. 2017. A Multi National European Cross Sectional Study of Feline
Calicivirus Epidemiology, Diversity and Vaccine Cross Reactivity.
Berger A, Barbara W, Marina LM, Felicitas SB, Sonja H, Anou D, Hans L, Regina
HL. 2015. Feline calicivirus and other repiratory pathogens in cats with
feline calicivirus related symptoms and in clinically healthy cats in switzerland.
BMC Veterinary Research . 11(282): 1-12.
Dewi AK. 2013. Isolasi, identifikasi dan uji sensitivotas Staphylococcus aureus
terhadap amoxicillon dari sampel susu kambing peranakan etawa (PE)
penderita mastitis di wilayah Girimulyo, Kulonproogo, Yogyakarta. JSV. 32(2):
138-150.
Entjang I. 2003. Mikrobiologi & Parasitologi.Bandung : PT Citra Aditya Bakti
Hadioetomo RS. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek Teknik dan Prosedur
Dasar Laboratorium. Jakarta: PT Gramedia.Hardiansyah et al. 2020
Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP. 2006. Brock Biology of
Microorganisms 12th ed. San Francisco (US): Pearson Education.
Mangindaan REP, Losung F. 1991. Aktivitas hemolitik teripang (Bohadschia graeffei)
dari pantai Malalayang, Sulawesi Utara pada beberapa suhu dan pH. Jurnal
Ilmiah Sains. 13 (1): 27–33.
Panjaitan FJ, Bachtiar T, Arsyad I, Lele OK, Indriyani W. 2020. Karakterisasi
mikroskopis dan uji biokimia bakteri pelarut fosfat (BPF) dari rhizosfer
tanaman jagung fase vegetatif. CIWAL. 1(1): 9-17.
Yeh E, Pinsky BA, Banaei N, Baron EJ. 2009. Hair sheep blood, citrated and
defibrinated, fulfills all requirements of blood agar for diagnostic microbiology
laboratory test. Plos One. 4(7): 1-7.