MAKALAH

PEMERIKSAAN LABORATORIUM INFEKSI JAMUR

ASPERGILLUS FUMIGATUS PADA SPUTUM PENDERITA BATUK

KRONIK MENGGUNAKAN METODE PCR DAN KULTUR

NAMA : FENNY RISNA SARI BR REGAR

NIM : 1711304102

KELAS/KELOMPOK : B/B2 TLM

INSTRUKTUR : Akta Fatikhah Handayani Ikawati, S. Tr. Kes

SARJANA TERAPAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ‘AISYIYAH YOGYAKARTA

YOGYAKARTA

1
 2019

KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum Warahmatullahi Wabarakatu

Alhamdulillahirobilalamin, Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT

atas limpahan rahmat dan hidayah-Nya kami dapat menyelesaikan makalah
tentang “Aspergillus Fumigatus pada Sputum Penderita Batuk Kronik
Menggunakan Metode PCR dan Kultur”. Makalah ini disusun untuk memenuhi
tugas mata kuliah Pemeriksaan Laboratorium Infeksi Jamur. Tujuan yang lebih
khusus dari pembuatan makalah ini ialah untuk menambah pengetahuan tenaga
medis laboran tentang bagaimana cara pemeriksaan infeksi jamur menggunakan
metode molekuler dan kultur yang kami sajikan berdasarkan berbagai sumber
informasi, referensi, dan berita.

Kami menyampaikan rasa terima kasih kepada Dosen yang telah

memberikan tugas untuk pembuatan makalah ini, serta kepada teman-teman
mahasiswa yang juga sudah memberi kontribusi baik langsung maupun tidak
langsung dalam pembuatan makalah ini.

Dalam penyusunan makalah ini, tidak sedikit hambatan yang kami hadapi.
Namun kami menyadari bahwa kelancaran dalam penyusunan makalah ini tidak
lain berkat bantuan, dorongan, dan bimbingan orang tua, serta orang-orang
terdekat, sehingga kendala-kendala yang kami hadapi teratasi.

Semoga makalah ini dapat memberikan wawasan yang lebih luas dan
menjadi sumbangan pemikiran kepada pembaca. Kami menyadari bahwa makalah
ini masih banyak kekurangan dan jauh dari kata sempurna. Untuk itu, saran dan
kritik yang bersifat membangun sangat kami harapkan.

Yogyakarta, 6 Juli 2019

Penyusun

2
 Fenny Risna Sari Br Regar

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR.......................................................................................................

DAFTAR ISI.....................................................................................................................

BAB I.................................................................................................................................

PENDAHULUAN.............................................................................................................

A. LATAR BELAKANG.............................................................................................

BAB II...............................................................................................................................

PEMBAHASAN................................................................................................................

A. INFEKSI JAMUR PADA MANUSIA....................................................................

B. SPESIES PENYEBAT INFEKSI............................................................................

C. MACAM PEMERIKSAAN……………………………………………........6

D. METODE PEMERIKSAAN…………………………………………...…....7

E. IDENTIFIKASI JAMUR INFEKSIUS……………………………………...9

BAB III..........................................................................................................................

PENUTUP.....................................................................................................................

A. KESIMPULAN....................................................................................................

DAFTAR PUSTAKA....................................................................................................

3
 BAB I

PENDAHULUAN

A. LATAR BELAKANG
Infeksi jamur merupakan penyakit yang disebabkan oleh jamur.
Penyakit ini dapat dialami oleh siapa saja. Namun demikian, individu dengan
sistem kekebalan tubuh yang lemah lebih berisiko terserang infeksi jamur.
Misalnya, penderita HIV atau AIDS, pasien kemoterapi, serta pasien pasca
transplantasi organ. Jamur adalah organisme yang dapat hidup secara alami di
tanah maupun tumbuhan. Bahkan jamur bisa hidup di kulit dan tubuh
manusia. Meskipun normalnya tidak berbahaya, namun beberapa jamur dapat
mengakibatkan pada gangguan kesehatan yang serius. (Djojodibroto DR.
2009)
Penyebab infeksi jamur tergantung kepada jenis infeksi itu sendiri.
Contohnya jamur Aspergillus, jamur ini disebabkan oleh perpaduan antara
sistem kekebalan tubuh yang lemah dan paparan jamur Aspergillus. Jamur ini
dapat ditemukan di tumpukan kompos, tumpukan gandum, dan sayuran yang
membusuk. Selain pada individu dengan sistem kekebalan tubuh yang lemah
(misalnya kondisi sel darah putih rendah atau sedang mengonsumsi obat
kortikosteroid), risiko aspergillosis lebih tinggi pada penderita asma atau
cystic fibrosis.
Kecepatan tumbuh jamur yang bertambah pada manusia dapat terjadi
akibat berbagai penggunaan obat-obatan, alat-alat kesehatan invasif, juga
terdapat faktor predisposisi berupa penyakit kronik yang berat termasuk
penyakit keganasan. Aspergillus fumigatus merupakan salah satu spesies
jamur sistemik yang dapat menginfeksi manusia. Penggunaan pemeriksaan
polymerase chain reaction (PCR) untuk mendeteksi jamur merupakan
diagnostik yang optimal. Tujuan penelitian ini adalah menganalisis
Aspergillus fumigatus menggunakan PCR dan kultur pada sputum pasien
penderita batuk kronik. (Sukamto. 2004)

4
 Pemeriksaan PCR dapat dipergunakan sebagai salah satu pmeriksaan
jamur yang cepat dan tepat, dan diperkuat dengan pemeriksaan kulturnya.

BAB II

PEMBAHASAN

A. INFEKSI JAMUR PADA MANUSIA

Batuk merupakan suatu mekanisme refleks yang sangat penting untuk

menjaga jalan napas agar tetap terbuka dengan cara menyingkirkan hasil
refleksi lendir yang menumpuk, gumpalan darah dan benda asing pada jalan
napas. Batuk karena iritasi pada mukosa bronkus disebabkan oleh
peradangan, baik oleh bakteri, virus, dan jamur disertai dengan mucus yang
banyak.

Diketahui ada beberapa spesies jamur yang dapat menginfeksi manusia,

namun penyebab infeksi pada paru-paru 90% adalah Aspergillus Fumigatus.
Namun jamur oportunistik yang paling sering menyebabkan infeksi jamur
invasif adalah Candida Albicans, Candida spp, dan Aspergillus spp. (Shahid
M, Malik A. 2001)

Menurut penelitian yang dilakukan di India pada tahun 2002 hingga

2003 yang menggunakan metode kultur dengan sampel sputum dari pasien
yang positif tuberkulosis paru kronik, dan hasil pemeriksaan terbanyak adalah
jenis jamur Aspergillus Fumigatus, Aspergillus Niger, Histoplasma
Capsulatum, dan Cryptococcus Neoformans.

Pemeriksaan menggunakan metode molekuler PCR manjadi standar dan

juga valid dalam pemeriksaan laboratorium untuk menegakkan diagnosis
Aspergillosis invasif secara cepat. Penggunaan PCR untuk mendeteksi asam
nukleat jamur mungkin merupakan diagnostik yang optimal karena memiliki
potensial lebih sensitif dari pada metode kultur pada berbagai spesimen.
Deteksi Aspergillus Fumigatus menggunakan PCR dari hasil kultur murni

5
 lebih cepat dari waktu kurang dari satu hari dibanding dengan analisis kultur
yang memakan waktu berhari-hari. (WHO. 2009)

Aspergillus Fumigatus dan kelompok Mucor paling sering mencapai

susunan saraf pusat melewati paru sekitar 50%.

B. SPESIES PENYEBAB INFEKSI

Aspergillosis merupakan penyakit yang disebabkan oleh jamur
Aspergillus, dimana merupakan infeksi terutama yang menyerang paru-paru.
Aspergillosis terjadi bila organisme Aspergillus menyusup ke dalam jaringan
yang lebih dalam, seperti saluran telinga atau paru-paru, terutama pada
penderita tuberkulosis atau bronchitis. Di paru-paru bisa tumbuh aspergilloma
(bola-bola jamur Aspergillus). Bola-bola ini terdiri dari serabut jamur, serabut
bekuan darah dan sel-sel darah putih yang tidak beraturan. Bola-bola ini
secara bertahap akan membesar dan merusak jaringan paru-paru. Pada
penderita gangguan sistem kekebalan (penerima cangkok jantung atau hati),
Aspergilosis bisa menyebar melalui aliran darah menuju ke otak dan ginjal.
Merupakan infeksi yang jarang ditemukan pada penderita AIDS.
Diagnosis yang dilakukan ditegakkan berdasarkan gejala-gejalanya.
Jika memungkinkan, bisa diambil jaringan terinfeksi untuk dibuat biakan
jamur di Laboratorium. Memerlukan waktu beberapa hari untuk tumbuhnya
jamur sehingga bisa diidentifikasikan, tetapi pengobatan harus segera
diberikan karena penyakit ini bisa berakibat fatal. (Hanazawa R. 2000)

C. MACAM PEMERIKSAAN
Pada pemeriksaan infeksi jamur pada batuk kronik yang disebabkan
oleh jamur Aspergillus Fumigatus ini dilakukan dengan dua macam metode
pemeriksaan, yaitu molekuler polymerase chain reaction (PCR) dan kultur
jamur.
PCR (polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode
untuk memperbanyak (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan
organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar
dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang
menggunakan DNA. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia

6
 dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah
sampel yang kecil. Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu
proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara in-vitro.
(Japardi I. 2002)
Metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan
jutaan kali dari jumlah yang semula. Setiap urutan basa nukleotida yang
diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Kunci utama pengembangan
PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA
target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.
PCR juga didasarkan pada amplifikasi enzimatik fragmen DNA dengan
menggunakan dua oligonukleotida primer yaitu komplementer dengan ujung
dari dua untaian skuen target. Oligonukleotida ini digunakan sebagai primer
(primer PCR) untuk memungkikan DNA template dikopi oleh DNA
polimerase. Untuk mendukung terjadinya annealing primer ini pada template
pertama kali diperlukan untuk memisahkan untaian DNA substrat melalui
pemanasan.
Metode kultur yaitu melakukan penanaman atau isolasi mikrobia pada
media di cawan atau tabung yang dilakukan guna untuk mendapatkan biakan
murni yang steril dan kemudian hasilnya diteliti secara mikroskopis maupun
makroskopis. Dalam kegiatan isolasi mikrobia perlu dilakukanya sterilisasi
yaitu bertujuan untuk menghindari dari terkontaminasi oleh mikrobia-
mikrobia yang tidak ingin ditumbuhkan dalam media agar tersebut.
Perkembangbiakan jamur dan bakteri akan dipengaruhi oleh beberapa unsur
nutrisi yang dibutuhkannya baik itu dalam jumlah makro maupun mikro.
(Unus, S. 1999)

D. METODE PEMERIKSAAN
Sampel yang digunakan pada pemeriksaan PCR ini menggunakan
sampel sputum. Kriteria ekslusi adalah penderita yang telah terdiagnosis
menderita penyakit jamur, dan lokal maupun sistemik. Sampel sputum yang
didapat dari pasien dibagi menjadi dua, yaitu untuk pemeriksaan PCR dan
pemeriksaan kultur.

7
 Metode kultur yang digunakan adalah untuk melihat koloni jamur yang
diperhatikan pertumbuhannya pada media miring Sabouraud Dextrose Agar.
Dengan mengambil 10 µl sputum menggunakan sengkelit. Goreskan pada
permukaan media miring Sabouraud Dextrose Agar, kemudian inkubasi pada
suhu ruang 26°C-28°C selama 10 hari. Rendam inokulum (mounting) dalam
larutan Lactophenol Cotton Blue (LPCB), lalu tutup dengan deck glass.
Periksa dibawah mikroskop perbesaran 10x. (Sastrahidayat. 1990)
Untuk isolasi DNA dilakukan dengan cara, 900 µl cell lysis solution
dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml dan tambahkan 300 µl sampel sputum.
Bolak balikkan tabung agar larutan tercampur. Kemudian inkubasi selama 10
menit pada suhu ruang, lalu sentrifugasi pada kecepatan 13.000-16.000 rpm
selama 20 detik pada suhu ruangan. Buang supernatannya, vortexs selama 10-
15 detik, kemudian tabung itu ditambahkan 100 µl protein precipitation
solution, dan vortexs lagi 10-20 detik. Pindahkan supernatannya ke tabung
1,5 ml steril baru yang berisi dengan isopropanol 300 µl.
Sentrifugasi tabung dengan kecepatan 13.000-16.000 rpm selama 3
menit dengan suhu ruang. Larutan di aduk hingga terlihat benang-benang
putih halus DNA. Tabung di sentrifugasi lagi hingga dapat terlihat pellet pada
dasar tabung. Supernatan dibuang kemudian ditambahkan 300 µl etanol 70%.
Balikkan tabung agar larutan tercampur dan sentrifugasi lagi. Tabung
dibalikkan di atas kertas absorben dan pellet dikeringkan selama 10-15 menit.
Terakhir tambahkan 50 µl DNA rehydration solution ke dalam tabung.
Kemudian simpan DNA semalaman.
Untuk metode PCR digunakan dua tahap dengan mempergunakan dua
pasang primer yang berbeda. Tahap PCR pertama bertujuan untuk
meningkatkan jumlah DNA cetakan pada PCR tahap kedua. PCR dengan
menggunakan metode thermal cycler dengan urutan PCR pertama prosesnya
2 menit pada suhu 94°C, kemudian lakukan sebanyak 35 siklus selama 40
detik pada suhu 94°C, 1 menit pada suhu 60°C, 1 menit pada suhu 72°C, dan
terakhir 5 menit pada suhu 72°C, dan simpan pada suhu 4°C. PCR kedua
menggunakan hasil dari PCR pertama sebanyak 10 µl. Prosesnya 2 menit
pada suhu 94°C sebanyak 45 siklus selama 40 detik pada suhu 94°C, 1 menit

8
 pada suhu 72°C, dan terakhir 5 menit pada suhu 72°C, dan simpan pada suhu
4°C.
Hasil PCR dipisahkan memakai 2% agarose gel electrophoresis dan
warnai dengan etidium bromid. Gel dimasak dan didinginkan dengan suhu
50-60°C, biarkan gel mengeras, letakkan pada tank electrophoresis,
dijalankan pada tengangan 70v selama 1 jam. DNA hasil amplifikasi tersebut
yang telah di elektroforesis divisualisasi menggunakan gel documentation.
Pita DNA akan terlihat dan dapat diketahui ukurannya berdasarkan atas
penanda ukuran molekul yang dinyatakan dengan base pair. Hasil negatif jika
tidak terbentuk band atau pita berukuran di atas atau di bawah 236 bp dan
positif jika terbentuk pita berukuran 236 bp.

E. IDENTIFIKASI JAMUR INFEKSIUS

Semua yang diperiksa menggunakan teknik two step PCR untuk
mendeteksi DNA jamur Aspergillus Fumigatus. Hasil produk PCR di analisis
menggunakan elektroforesis gel agarosa 2%. Setiap gel diberikan marker,
kontrol positif, dan kontrol negatif. Pemeriksaan ini juga dilakukan kultur
pada semua sampel sebagai gold standar untuk pemeriksaan jamur
menggunakan media Sabouraud Dextrose Agar selama lebih kurang 2
minggu.
Identifikasi infeksi jamur ini setelah dilakukan pemeriksaan pada
metode kultur, didapatkan hasil pada pengamatan kultur secara makroskopis
ditemukan adanya koloni Aspergillus Fumigatus jika pada permukaan media
didapatkan pertumbuhan filament putih, kemudian memproduksikan spora
seperti beludru dengan warna putih keabu-abuan. Sedangkan pada
pengamatan mikroskopis didapati hifa bersepta (konidiospora) dan
membentuk konidia (spora).
Hasil pemeriksaan sputum positif mengandung Aspergillus Fumigatus
lebih banyak menggunakan metode PCR dibanding dengan kultur jamur.
Dengan teknik PCR didapat 35 sampel 69% positif, dengan kultur didapat 29
sampel 57% positif. Perbedaan hasil antara PCR dan kultur disebabkan oleh
sensitivitas PCR lebih tinggi. Dengan PCR, satu organisme jamur sudah dapat

9
 terdeteksi.hasil negatif pada kultur disebabkan karena jamur yang mati atau
tidak berhasil tumbuh dengan baik pada media.

BAB III

PENUTUP

A. KESIMPULAN

Dari penelitian yang dilakukan untuk pemeriksaan jamur di Indonesia

masih memakai sistem kultur sebagai gold standar untuk pemeriksaan jamur.
Namun metode ini memerlukan waktu yang lama untuk membiakkan jamur
selama lebih kurang 10 hari, sedangkan dengan PCR hasilnya memerlukan
waktu 1-2 hari. Pada beberapa penyakit diperlukan diagnosis yang cepat
seperti pada penyakit meningitis, HIV/AIDS, dan imunokompromaised
lainnya sehingga lebih efektif bila menggunakan PCR walaupun biayanya
lebih mahal daripada kultur.

Pada pemeriksaan ini didapatkan banyak kolonisasi jamur Aspergillus

Fumigatus pada sputum penderita batuk kronik baik pada metode PCR
maupun kultur. Penyakit akibat jamur tidak bisa dianggap remeh dan harus
menjadi perhatian para klinisi dan pasien diharapkan mendapat pengobatan
yang cepat dan tepat untuk penyakitnya.

Teknik PCR mempunyai keunggulan karena mendeteksi lebih cepat dan

tepat dibanding metode kultur. Apabila biaya dapat ditekan maka dapat
dipertimbangkan penggunaan teknik PCR dalam membantu hasil skrining
yang cepat.

10
 DAFTAR PUSTAKA

Djojodibroto DR. 2009. Respirologi (respiratory medicine). Jakarta : Penerbit

EGC

Sukamto. 2004. Pemeriksaan Jamur Bilasan Bronkus pada Penderita Bekas

Tuberkulosis Paru. Medan: Bagian Ilmu Penyakit Paru Fakultas Kedokteran
Universitas Sumatera Utara, USU Digital Library.

Shahid M, Malik A. 2001. Prevalence of Aspergillosis in Chronic Lung Disease.

Indian Med Microbiol.

WHO. 2009. Laboratory Manual for Diagnosis of Fungal Opportunistic Infections

in HIV/AIDS Patients. India: Regional Office for South-East Asia.

Hanazawa R. 2000. In-situ Detection of Aspergillus Fumigatus. J Med Microbiol.

Japardi I. 2002. Infeksi Jamur Pada Susunan Saraf Pusat. Medan: Bagian Bedah
Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara. USU Press.

Unus, S. 1999. Mikrobiologi. Cetakan ketiga. Jakarta : Univesitas Terbuka.

Sastrahidayat. 1990. Isolasi Pada Bakteri. Bandung : ITB

11