Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com
Diunduh darihttp://cshprotocols.cshlp.org/pada 19 Januari 2022 - Diterbitkan oleh
Pers Laboratorium Cold Spring Harbor

Protokol

Blotting Selatan
Michael R. Green dan Joseph Sambrook

Di Southern blotting, DNA dicerna dengan satu atau lebih enzim restriksi, dan fragmen yang dihasilkan
dipisahkan menurut ukuran dengan elektroforesis melalui gel agarosa standar. DNA kemudian didenaturasi
in situ dan dipindahkan dari gel ke pendukung padat (biasanya membran nilon atau nitroselulosa). Posisi
relatif fragmen DNA dipertahankan selama transfernya ke membran. DNA kemudian difiksasi ke membran
dan disiapkan untuk hibridisasi. Alternatifnya, DNA dapat ditransfer secara simultan dari permukaan atas dan
bawah gel agarosa tunggal ke dua membran. Prosedur ini berguna ketika muncul kebutuhan untuk
menganalisis kumpulan fragmen restriksi yang sama dengan dua probe yang berbeda. Transfer fragmen DNA
berlangsung cepat, tetapi efisiensinya rendah karena gel agarosa dengan cepat mengalami dehidrasi saat
cairan ditarik dari kedua sisi. Oleh karena itu, metode ini bekerja paling baik ketika sekuens target hadir dalam
konsentrasi tinggi (misalnya, ketika menganalisis DNA kloning [plasmid, bakteriofag, kosmid, PAC, atau BAC]
atau genom yang kurang kompleks [yangSaccharomyces cerevisiaeatauDrosophila]).Terlalu sedikit DNA
genom mamalia yang ditransfer untuk memungkinkan sinyal dari sekuens salinan tunggal dideteksi dengan
cara yang dapat direproduksi atau tepat waktu.

BAHAN

Anda harus berkonsultasi dengan Lembar Data Keselamatan Bahan yang sesuai dan Kantor Kesehatan dan Keselamatan Lingkungan
institusi Anda untuk penanganan yang tepat dari peralatan dan bahan berbahaya yang digunakan dalam protokol ini.

RESEP: Silakan lihat bagian akhir protokol ini untuk resep yang ditunjukkan oleh <R>. Resep tambahan dapat ditemukan secara online di
http://cshprotocols.cshlp.org/site/recipes.

Reagen
Gel agarosa (0,7%) dicor dalam buffer elektroforesis (0,5× TBE atau 1× TAE) tanpa adanya pewarna SYBR
Untuk analisis DNA genom mamalia, sebagian besar peneliti menggunakan gel besar (20×20×0,5 cm) berisi 20 slot standar
yang cukup besar untuk menampung-50–60 L. Kapasitas ini memungkinkan seluruh reaksi destruksi dimuat tanpa
tumpahan. Gel dapat dicetak dan dijalankan dengan cara biasa dalam buffer yang mengandung SYBR Gold, misalnya.
Namun, pengukuran yang lebih akurat dari ukuran fragmen DNA dapat diperoleh dengan pewarnaan gel setelah
elektroforesis dengan SYBR Gold. Dimasukkannya SYBR Gold dalam matriks gel dapat menyebabkan distorsi pita DNA dan
dapat menghambat migrasi fragmen DNA ke berbagai tingkat.

Buffer transfer alkali (untuk transfer alkali ke membran nilon) <R> atau larutan Denaturasi (untuk
transfer netral) <R>, Buffer transfer netral (baik 10× SSC <R> atau 10× SSPE <R>), dan SSC
(6×) <R>
Endonuklease restriksi yang sesuai
Deionisasi H2HAI
penanda ukuran DNA

Dari koleksi Kloning Molekuler, diedit oleh Michael R. Green dan Joseph Sambrook.
© 2021 Cold Spring Harbor Laboratory Press
Kutip protokol ini sebagaiProtoc Pelabuhan Mata Air Dingin;doi:10.1101/pdb.prot100487

269
 Diunduh darihttp://cshprotocols.cshlp.org/pada 19 Januari 2022 - Diterbitkan oleh
Pers Laboratorium Cold Spring Harbor

MR Green dan J. Sambrook

Set penanda ukuran tersedia dari banyak produsen komersial, atau mereka dapat dibuat dengan mencerna vektor
kloning dengan enzim restriksi yang sesuai. Kami merekomendasikan menggunakan tangga 1-kb (Life Technologies) di
jalur yang paling dekat dengan satu sisi gel dan intisari HindIII dari bakteriofag DNA di jalur di sisi berlawanan dari gel.

Spidol berlabel radio dengan35S atau33P tidak direkomendasikan karena biasanya memerlukan waktu pemaparan yang
berbeda dari yang optimal untuk pita target.

Buffer elektroforesis (1× TAE <R> atau 0,5× TBE <R>) Etanol
(opsional; lihat Langkah 2)
Gel-loading buffer I <R> atau IV <R> (6×, dengan sukrosa)
DNA genom
HCl (0,2N), untuk depurinasi DNA (opsional; lihat catatan untuk Langkah 6)
Buffer netralisasi I (untuk transfer ke membran tidak bermuatan) <R> atau Buffer netralisasi II (untuk
transfer basa ke membran nilon) <R> SYBR
Pewarna emas
TE (pH 8,0) <R>

Peralatan
Perangkat penghubung silang (misalnya, Stratalinker, Agilent; GS Gene Linker, Bio-Rad), oven microwave, atau
oven vakum
Peralatan untuk elektroforesis gel agarosa (peralatan elektroforesis horizontal yang bersih dan kering dengan
ruang dan sisir)
Instrumen Fluorometer atau NanoDrop
Forceps
Piring pemanggang kaca, cukup besar untuk menampung piring
Gelas gel
Batang kaca atau pipet
Sistem pengambilan gambar (misalnya, kamera CCD dan iluminator UV) Ujung kuning
dengan lubang besar
Ujung kuning dengan lubang besar dapat dibeli atau dibuat dengan cepat dengan memotong ujung ujung kuning standar dengan
gunting, gunting kuku anjing, atau silet yang tajam. Ujung potong harus disterilkan sebelum digunakan, baik dengan autoklaf atau
perendaman dalam alkohol 70% selama 2 menit diikuti dengan pengeringan di udara.

Sumbat neoprene
Membran nilon atau nitroselulosa
Lihat bagian Membran yang Digunakan untuk Hibridisasi Selatan dan Utara di Pendahuluan:Analisis DNA dengan
Southern Blotting (Green dan Sambrook 2021a).

Kertas tisu
Pipet
Bungkus plastik (mis., Bungkus Saran) atau parafilm
Perangkat catu daya yang mampu hingga 500 V dan 200 mA
Pisau Cukur
Pengocok platform putar
Pisau bedah atau pemotong kertas

Kertas blotting tebal (misalnya, Whatman 3MM, Schleicher & Schuell GB004, atau Sigma-Aldrich
Menggambar cepat)

Penggaris transparan dengan tanda fluorescent

Penggaris digunakan untuk mengukur jarak yang ditempuh oleh DNA penanda. Penggaris yang ditempatkan di samping gel
selama fotografi memungkinkan jarak yang ditempuh dari sumur pemuatan oleh penanda DNA dengan ukuran yang diketahui
untuk diukur pada gambar fotografi dan diplot secara grafis. Ukuran pita radiolabel yang dideteksi oleh hibridisasi kemudian dapat
diperkirakan dengan interpolasi.

Berat (400 gram)

270 Kutip protokol ini sebagaiProtoc Pelabuhan Mata Air Dingin;doi:10.1101/pdb.prot100487

 Diunduh darihttp://cshprotocols.cshlp.org/pada 19 Januari 2022 - Diterbitkan oleh
Pers Laboratorium Cold Spring Harbor

Blotting Selatan

METODE

Pencernaan dan Elektroforesis DNA

1.Mencerna DNA genomik dalam jumlah yang tepat dengan satu atau lebih enzim restriksi (lihat
Diskusi).
Gunakan ujung pipet kuning dengan lubang besar untuk menangani DNA dengan berat molekul tinggi.

2.Jika perlu, konsentrasikan fragmen DNA pada akhir pencernaan dengan pengendapan etanol.
Larutkan DNA dalam -25 L TE (pH 8,0).
Pastikan bahwa etanol dihilangkan dari larutan DNA sebelum dimasukkan ke dalam gel; jika tidak, DNA akan
"merangkak" keluar dari slot (lihat Pemecahan Masalah).

3.Ukur konsentrasi DNA yang dicerna dengan fluorometri atau teknologi NanoDrop untuk mengukur
DNA (lihat bagian Mengukur DNA di Pendahuluan:Isolasi dan Kuantifikasi DNA [Green dan
Sambrook 2018]). Pindahkan jumlah yang sesuai dari masing-masing digest ke tabung
microcentrifuge segar. Tambahkan 0,15 volume 6x buffer pemuatan gel sukrosa, dan pisahkan
fragmen DNA dengan elektroforesis melalui gel agarosa (untuk sebagian besar DNA genom, 0,7%
gel cast dalam 0,5x TBE atau 1x TAE dapat digunakan). Pertahankan voltase rendah melalui gel
(sekitar <1 V/ cm) sehingga laju migrasi DNA lambat.
Jika DNA yang dicerna telah disimpan pada 4 C̊, DNA tersebut harus dipanaskan selama 2-3 menit hingga 56 C̊ sebelum
diterapkan pada gel. Pemanasan ini mengganggu setiap pasangan basa yang mungkin terjadi antara ujung kohesif yang
menonjol.

Lihat Pemecahan Masalah.

4.Setelah elektroforesis selesai, warnai gel dengan SYBR Gold, dan rekam gambar gel yang
diwarnai. Tempatkan penggaris di samping gel sehingga jarak migrasi pita DNA mana pun
dapat dibaca langsung dari gambar fotografi.
Jika diinginkan, gel dapat disimpan pada tahap ini sebelum DNA didenaturasi dan dipindahkan ke membran.
Bungkus gel dalam Saran Wrap, dan simpan di permukaan yang rata pada suhu 4 C̊. Karena pita DNA berdifusi
selama penyimpanan, gel tidak boleh disimpan lebih dari 1 hari sebelum DNA dipindahkan ke filter nitroselulosa
atau membran nilon.

5.Denaturasi DNA dan transfer dari gel agarosa ke filter nitroselulosa atau ke membran nilon netral atau
bermuatan menggunakan salah satu metode yang dijelaskan di bawah ini.

Persiapan Gel untuk Transfer

6.Pindahkan gel ke loyang kaca. Gunakan silet untuk memotong bagian gel yang tidak terpakai,
termasuk bagian gel di atas lubang. Pastikan untuk meninggalkan cukup banyak sumur yang
menempel pada gel sehingga posisi jalur dapat ditandai pada membran setelah transfer DNA.
Potong sepotong segitiga kecil dari sudut kiri bawah gel untuk menyederhanakan orientasi selama
operasi berikutnya.
Yang terbaik adalah memotong jalur yang berisi penanda berat molekul karena probe mungkin berisi
urutan yang melengkapi beberapa pita penanda. Pola pita yang muncul pada autoradiogram
terkadang informatif, tetapi lebih sering membingungkan.

Jika fragmen DNA yang diinginkan lebih besar dari-15-20 kb, kemudian transfer dapat ditingkatkan dengan memotong DNA
dengan depurinasi singkat sebelum denaturasi (Wahl et al. 1979) (lihat Pemecahan Masalah).

7.Denaturasi DNA dengan perendaman dalam larutan denaturasi (basa) sebagai berikut:

Untuk Transfer ke Membran Tanpa Muatan

saya.Rendam gel selama 45 menit pada suhu kamar dalam 10 volume gel larutan denaturasi dengan
pengadukan lembut yang konstan (misalnya, pada platform putar).

Kutip protokol ini sebagaiProtoc Pelabuhan Mata Air Dingin;doi:10.1101/pdb.prot100487 271

 Diunduh darihttp://cshprotocols.cshlp.org/pada 19 Januari 2022 - Diterbitkan oleh
Pers Laboratorium Cold Spring Harbor

MR Green dan J. Sambrook

ii.Bilas gel sebentar dalam H . terdeionisasi2O, kemudian dinetralkan dengan merendamnya selama 30
menit pada suhu kamar dalam 10 volume gel buffer Netralisasi I dengan pengadukan lembut yang
konstan. Ganti buffer netralisasi dan lanjutkan perendaman gel selama 15 menit.

Untuk Transfer ke Membran Nilon Terisi

saya.Rendam gel selama 15 menit pada suhu kamar dalam beberapa volume buffer transfer basa dengan
pengadukan lembut yang konstan (misalnya, pada platform putar).

ii.Ganti larutan dan lanjutkan merendam gel selama 20 menit lagi dengan pengadukan lembut.
Jika gel mengapung ke permukaan cairan, timbang dengan beberapa pipet Pasteur.

Persiapan Membran untuk Transfer

8.Gunakan pisau bedah baru atau pemotong kertas untuk memotong sepotong nilon atau membran nitroselulosa
-1–2 mm lebih besar dari gel di setiap dimensi. Potong sudut dari membran agar sesuai dengan potongan sudut
dari gel. Selain itu, potong dua lembar kertas isap tebal dengan ukuran yang sama dengan membran.
Jika melakukan transfer simultan ke dua membran, potong dua lembar membran dan empat lembar
kertas blotting.
Gunakan sarung tangan yang sesuai dan forsep berujung tumpul (misalnya forsep Millipore) untuk menangani
membran. Selaput yang terkena tangan berminyak tidak akan basah!

Untuk mempertahankan fragmen kecil DNA (<300 nt), gunakan membran nitroselulosa dengan ukuran pori kecil (0,2 m) atau
membran nilon.

9.Apungkan membran pada permukaan cawan H . terdeionisasi2O sampai benar-benar basah dari
bawah, dan kemudian rendam membran dalam buffer transfer yang sesuai selama minimal 5 menit.
Untuk transfer simultan ke dua membran, rendam membran dalam 10× SSC dan lewati ke Langkah
21.
Tingkat di mana batch yang berbeda dari membran nitroselulosa basah sangat bervariasi. Jika membran tidak jenuh setelah
mengambang selama beberapa menit di H2O, lihat Pemecahan Masalah. Pembasahan yang tidak merata biasanya tidak menjadi
masalah dengan membran netral atau nilon bermuatan.

Perakitan Alat Pemindah dan Pemindahan DNA ke Membran Tunggal

Buffer transfer netral (10×SSC atau 10×SSPE) digunakan untuk mentransfer DNA ke membran yang tidak bermuatan. Buffer transfer
alkali digunakan untuk mentransfer DNA ke membran nilon bermuatan.

10.Saat DNA mengalami denaturasi, letakkan selembar kertas blotting tebal pada selembar Plexiglas atau pelat
kaca untuk membentuk penyangga yang lebih panjang dan lebih lebar dari gel. Ujung kertas blotting
harus menutupi tepi piring. Tempatkan dukungan di dalam loyang besar. Penyangga dapat ditempatkan
di atas empat sumbat neoprene untuk mengangkatnya dari dasar piringan.

11.Isi piring dengan buffer transfer yang sesuai sampai tingkat cairan mencapai hampir ke atas
penyangga. Ketika kertas blotting di bagian atas penyangga benar-benar basah, ratakan semua
gelembung udara dengan batang kaca atau pipet.
12.Keluarkan gel dari larutan pada Langkah 7, dan balikkan sehingga bagian bawahnya sekarang paling atas.
Tempatkan gel terbalik pada penyangga sehingga berada di tengah kertas blotting basah.
Pastikan tidak ada gelembung udara di antara kertas blotting dan gel.

13.Kelilingi, tapi jangan tutupi, gel dengan Saran Wrap atau Parafilm.
Masker pelindung ini berfungsi sebagai penghalang untuk mencegah cairan mengalir langsung dari reservoir ke handuk
kertas yang diletakkan di atas gel. Jika handuk ini tidak ditumpuk dengan tepat, handuk cenderung terkulai di tepi gel dan
dapat menyentuh sumbu. Jenis hubungan arus pendek ini adalah penyebab utama transfer DNA yang tidak efisien dari gel
ke membran.

14.Basahi bagian atas gel dengan buffer transfer yang sesuai. Tempatkan membran basah di atas gel sehingga
sudut potong sejajar. Untuk menghindari gelembung, sentuh salah satu sudut membran ke

272 Kutip protokol ini sebagaiProtoc Pelabuhan Mata Air Dingin;doi:10.1101/pdb.prot100487

 Diunduh darihttp://cshprotocols.cshlp.org/pada 19 Januari 2022 - Diterbitkan oleh
Pers Laboratorium Cold Spring Harbor

Blotting Selatan

gel, dan dengan lembut turunkan membran ke gel. Salah satu tepi membran harus
memanjang tepat di atas tepi garis slot di bagian atas gel.
Jangan pindahkan membran setelah dioleskan ke permukaan gel. Pastikan tidak ada gelembung
udara antara membran dan gel.

15.Basahi dua lembar kertas isap tebal dalam buffer transfer yang sesuai, dan letakkan di atas
membran basah. Gulung pipet di permukaan membran untuk menghilangkan gelembung
udara.
16.Potong atau lipat setumpuk kertas tisu (tinggi 5–8 cm) lebih kecil dari kertas isap. Letakkan handuk di atas
kertas minyak. Letakkan piring kaca di atas tumpukan, dan timbang dengan berat 400 gram.
Tujuannya adalah untuk mengatur aliran cairan dari reservoir melalui gel dan membran sehingga
fragmen DNA terdenaturasi dielusi dari gel dan disimpan pada membran. Berat di bagian atas gel
harus cukup berat untuk memastikan kontak yang baik antara berbagai komponen noda tetapi cukup
ringan untuk mencegah pengompresan gel. Kompresi akan memeras cairan dari celah gel,
meninggalkan matriks dehidrasi yang sangat menghambat pergerakan DNA dan secara drastis
mengurangi efisiensi transfer dari gel ke membran.

Utuh, daripada dipotong atau dilipat, handuk kertas juga dapat digunakan dalam pengaturan ini, tetapi hanya jika masker pelindung
Saran Wrap atau Parafilm secara efisien mencegah rembesan buffer.

Untuk mencegah penguapan, beberapa peneliti membungkus seluruh pengaturan transfer di Saran Wrap. Ini tidak
perlu.

17.Biarkan transfer DNA berlangsung selama 8-24 jam. Ganti handuk kertas saat menjadi basah. Cobalah untuk
mencegah seluruh tumpukan handuk menjadi basah dengan penyangga.

18.Lepaskan handuk kertas dan kertas blotting di atas gel. Balikkan gel dan membran yang menempel dan
letakkan, sisi gel menghadap ke atas, di atas selembar kertas blotting yang kering. Tandai posisi slot gel
pada membran dengan pensil timah yang sangat lembut atau bolpoin.

19.Kupas gel dari membran dan buang gelnya.

Alih-alih membuang gel, gel dapat diwarnai (45 menit) dengan SYBR Gold dan divisualisasikan untuk mengukur
keberhasilan transfer DNA. Perhatikan bahwa intensitas fluoresensi akan cukup rendah karena DNA yang tersisa
dalam gel akan mengalami denaturasi.

20.Lanjutkan ke Langkah 25.

Transfer Simultan DNA ke Dua Membran

Transfer ini dianggap sebagai transfer netral karena 10×SSC digunakan untuk membasahi membran.

21.Gulung pipet yang dibasahi di atas setiap lapisan saat dipasang untuk memastikan tidak ada
gelembung udara yang terperangkap, terutama di antara membran dan sisi gel. Tempatkan salah
satu membran pada dua lembar kertas isap yang dibasahi. Letakkan gel di atas membran,
sejajarkan sudut potong gel dengan sudut potong membran. Tanpa penundaan, letakkan membran
kedua di sisi lain gel, diikuti dengan dua lembar kertas blotting yang dibasahi.
22.Pindahkan seluruh sandwich kertas blotting, membran, dan gel ke dalam 2–4-in. tumpukan handuk
kertas. Tutupi sandwich dengan setumpuk handuk kertas kedua. Letakkan piring kaca di atas
seluruh tumpukan, dan timbang dengan berat 400 gram.
23.Setelah 2–4 jam, lepaskan handuk kertas dan kertas blotting. Pindahkan sandwich gel dan
membran ke selembar kertas blotting kering, dan tandai perkiraan posisi slot gel dengan
pensil timah yang sangat lembut atau bolpoin.
24.Lanjutkan ke Langkah 25.

Fiksasi DNA ke Membran

Urutan langkah dari imobilisasi DNA ke membran untuk hibridisasi berikutnya tergantung pada jenis
membran, metode transfer, dan metode fiksasi (lihat Tabel 1). Karena transfer alkali menghasilkan

Kutip protokol ini sebagaiProtoc Pelabuhan Mata Air Dingin;doi:10.1101/pdb.prot100487 273

 Diunduh darihttp://cshprotocols.cshlp.org/pada 19 Januari 2022 - Diterbitkan oleh
Pers Laboratorium Cold Spring Harbor

MR Green dan J. Sambrook

TABEL 1.Memperbaiki DNA ke membran untuk hibridisasi

Jenis membran Jenis transfer Metode fiksasi Urutan langkah

Nilon bermuatan positif
Nilon tidak bermuatan atau positif
nilon bermuatan
Nilon tidak bermuatan atau positif
nilon bermuatan
Transfer alkali Transfer alkali 1. Rendam membran dalam Neutralization buffer II.
2. Lanjutkan ke prahibridisasi.
transfer netral Iradiasi UV (silakan lihat Langkah 26 untuk detailnya) 1. Rendam membran dalam 6× SSC.
2. Memperbaiki DNA dengan penyinaran UV.
3. Lanjutkan ke prahibridisasi.
transfer netral Memanggang dalam oven vakum atau oven microwave 1. Rendam membran dalam 6× SSC.
(silakan lihat Langkah 26 untuk detailnya) 2. Panggang membran.
3. Lanjutkan ke prahibridisasi.

perlekatan kovalen DNA ke membran nilon bermuatan positif, tidak perlu mengikat DNA ke membran sebelum hibridisasi. DNA
yang ditransfer ke membran nilon yang tidak bermuatan dalam buffer transfer netral harus difiksasi ke membran dengan
dipanggang di bawah vakum atau dipanaskan dalam oven microwave, atau diikat silang ke membran dengan penyinaran UV.

25.Rendam membran dalam salah satu larutan berikut yang sesuai:

Untuk Transfer Netral

6×SSC selama 5 menit pada suhu kamar

Untuk Transfer Alkali

Buffer netralisasi II selama 15 menit pada suhu kamar

Bilas ini menghilangkan potongan agarosa yang menempel pada membran dan, dalam kasus terakhir, juga menetralkan
membran.

26.Imobilisasi DNA yang telah dipindahkan ke membran yang tidak bermuatan.

Karena transfer basa menghasilkan perlekatan kovalen DNA ke membran nilon yang bermuatan positif,
tidak diperlukan langkah tambahan untuk mengikat DNA ke membran.

Untuk Memperbaiki dengan Memanggang dalam Oven Vakum

saya.Lepaskan membran dari 6× SSC, dan biarkan kelebihan cairan mengalir keluar. Tempatkan membran rata
di atas handuk kertas hingga kering setidaknya selama 30 menit pada suhu kamar.

ii.Jepit membran di antara dua lembar kertas isap kering. Panggang selama 30 menit hingga 2 jam pada suhu
80̊ C dalam oven vakum.

Overbaking dapat menyebabkan membran nitroselulosa menjadi rapuh. Jika gel tidak sepenuhnya dinetralkan sebelum DNA
dipindahkan, membran nitroselulosa akan berubah menjadi kuning atau coklat selama pemanggangan dan sangat mudah
pecah. Latar belakang hibridisasi nonspesifik juga meningkat secara dramatis.

Untuk Memperbaiki dengan Memanggang dalam Oven Microwave

saya.Tempatkan membran basah pada selembar kertas blotting kering.

ii.Panaskan membran selama 2-3 menit dengan kekuatan penuh dalam oven microwave (750-900 W).

Memanggang membran nitroselulosa dalam oven microwave melemahkan sinyal dalam hibridisasi Selatan dan
tidak direkomendasikan (Angeletti et al. 1995).

Untuk Cross-Link dengan Iradiasi UV

saya.Tempatkan membran basah pada selembar kertas blotting kering.

ii.Iradiasi pada 254 nm untuk menghubungkan DNA ke membran.

274 Kutip protokol ini sebagaiProtoc Pelabuhan Mata Air Dingin;doi:10.1101/pdb.prot100487

 Diunduh darihttp://cshprotocols.cshlp.org/pada 19 Januari 2022 - Diterbitkan oleh
Pers Laboratorium Cold Spring Harbor

Blotting Selatan

Imobilisasi asam nukleat dengan penyinaran UV dapat sangat meningkatkan sinyal hibridisasi yang diperoleh
dengan beberapa merek membran nilon bermuatan positif. Namun, untuk efek maksimal, penting untuk
memastikan bahwa membran tidak disinari berlebihan. Tujuannya adalah untuk membentuk ikatan silang antara
fraksi kecil residu timin dalam DNA dan gugus amina bermuatan positif pada permukaan membran (Church dan
Gilbert 1984). Hasil iradiasi berlebihan dalam perlekatan kovalen dari sebagian besar timin, dengan konsekuensi
penurunan sinyal hibridisasi. Pastikan sisi membran yang membawa DNA menghadap sumber sinar UV. Sebagian
besar produsen menyarankan agar membran lembab terkena total 1,5 J/cm2dan bahwa membran kering terkena
0,15 J/cm2. Namun, kami merekomendasikan melakukan serangkaian percobaan pendahuluan untuk menentukan
secara empiris jumlah penyinaran yang diperlukan untuk menghasilkan sinyal hibridisasi maksimum.

27.Lanjutkan langsung ke hibridisasi DNA amobil ke probe (Protokol:Hibridisasi Selatan dari

Radiolabeled Probe menjadi Asam Nukleat yang Diimobilisasi pada Membran [Green dan
Sambrook 2021b]).
Setiap membran yang tidak segera digunakan dalam reaksi hibridisasi harus dikeringkan secara menyeluruh, dibungkus dengan
longgar dalam aluminium foil atau kertas blotting, dan disimpan pada suhu kamar, lebih disukai di bawah vakum.

PENYELESAIAN MASALAH

Masalah (Langkah 2):DNA "merangkak" keluar dari slot gel.

Larutan:Jumlah etanol yang signifikan kemungkinan tetap ada dalam sampel DNA. Pemanasan larutan
DNA terlarut dalam tabung terbuka selama 10 menit sampai 70 C̊ biasanya cukup untuk mengusir sebagian besar
etanol.

Masalah (Langkah 3):Solusi DNA tidak akan tenggelam ke dasar sumur.

Larutan:Pengambangan ini terjadi ketika DNA dengan berat molekul sangat tinggi hadir di ujung
mencerna (misalnya, ketika mencerna tidak lengkap atau ketika DNA mamalia telah dicerna dengan enzim
seperti NotI yang menghasilkan fragmen DNA yang sangat besar). Untuk meminimalkan masalah,
pastikan bahwa DNA terdispersi secara homogen, dan masukkan sampel dengan sangat lambat ke dalam
lubang gel. Setelah memuat, biarkan gel selama beberapa menit agar DNA dapat menyebar secara merata
ke seluruh sumur.

Masalah (Langkah 6):Ada transfer fragmen DNA besar (-15–20 kb) yang buruk.
Larutan:Jika fragmen DNA yang diinginkan lebih besar dari -15–20 kb, maka transfer dapat ditingkatkan
dengan memotong DNA dengan depurinasi singkat sebelum denaturasi (Wahl et al. 1979).
Depurinasi membuka tulang punggung gula fosfat DNA untuk pembelahan berikutnya oleh ion
hidroksil. Setelah Langkah 6, rendam gel dalam beberapa volume 0,2NHCl sampai warna biru
bromofenol menjadi kuning dan xilena sianol menjadi kuning/hijau. Segera pasang 0.2NHCl dalam
wadah limbah berbahaya, lalu bilas gel beberapa kali dengan H . terdeionisasi2O. Karena depurinasi
bergantung pada difusi H+ion ke dalam gel, molekul DNA pada tingkat yang berbeda dalam agarosa
yang depurinated pada tingkat yang berbeda dan untuk tingkat yang berbeda. Oleh karena itu
reaksi sulit untuk dikendalikan dan direproduksi dan, jika dilakukan terlalu antusias, dapat
mengakibatkan fragmentasi DNA yang berlebihan dan pengurangan kekuatan sinyal hibridisasi.
Depurinasi sebaiknya dihindari ketika ukuran fragmen target <15 kb. Namun, depurinasi / nicking
disarankan, jika tidak penting untuk analisis Selatan DNA dengan berat molekul lebih tinggi.

Masalah (Langkah 9):Membran nitroselulosa tidak basah secara merata.

Larutan:Jika membran tidak jenuh setelah mengambang selama beberapa menit di H2Oh, seharusnya
diganti dengan membran baru karena transfer DNA ke membran basah yang tidak merata
tidak dapat diandalkan. Membran asli harus dibuang atau diautoklaf selama 5 menit antara

Kutip protokol ini sebagaiProtoc Pelabuhan Mata Air Dingin;doi:10.1101/pdb.prot100487 275

 Diunduh darihttp://cshprotocols.cshlp.org/pada 19 Januari 2022 - Diterbitkan oleh
Pers Laboratorium Cold Spring Harbor

MR Green dan J. Sambrook

potongan kertas 3MM yang dijenuhi dengan 2x SSC. Perawatan ini biasanya menghasilkan pembasahan
total. Membran yang diautoklaf, diapit di antara kertas 3MM yang diautoklaf jenuh dengan 2x SSC, dapat
disimpan pada suhu 4̊ C dalam kantong plastik tertutup sampai dibutuhkan.

DISKUSI

Poin-poin penting yang perlu diingat ketika mengatur intisari restriksi DNA genomik untuk analisis Selatan
standar adalah sebagai berikut.

• Jumlah DNA yang dicerna harus cukup untuk menghasilkan sinyal. Untuk analisis Selatan DNA genomik
mamalia, -10 g DNA harus dimasukkan ke dalam setiap slot gel ketika probe dengan panjang standar (>500
bp) dan aktivitas spesifik yang tinggi (>109cpm/µg) digunakan untuk mendeteksi urutan salinan tunggal.
Jumlah DNA yang lebih rendah secara proporsional dapat digunakan bila preparasi DNA mengandung
konsentrasi molar yang lebih tinggi dari sekuens yang diinginkan.

• Enzim restriksi yang digunakan cenderung informatif. Misalnya, tidak ada gunanya mencerna DNA
yang ukuran mediannya 50 kb dengan enzim restriksi yang membelah rata-rata setiap 100 kb.
Sebagai aturan umum, ukuran rata-rata DNA sebelum pencernaan harus setidaknya tiga kali lebih
besar dari ukuran rata-rata fragmen yang dihasilkan selama pencernaan.

• Jumlah DNA yang dimuat ke setiap jalur gel diketahui dengan akurat. Ini tidak berarti
bahwa restriksi digest harus mengandung jumlah DNA yang sama. Mengukur volume
kecil dari preparat yang sangat kental dari DNA genomik dengan berat molekul tinggi
itu sulit, dan ketidakakuratan menyebabkan kelebihan atau kekurangan jalur dalam
gel. Jika penting untuk menganalisis jumlah DNA yang sama dari beberapa sampel
(misalnya, ketika membandingkan DNA genom yang diisolasi dari individu normal dan
mereka yang terkena penyakit genetik, atau ketika mencoba menentukan jumlah
salinan gen), maka yang terbaik adalah untuk mencerna kecukupan masing-masing
DNA tanpa terlalu mengkhawatirkan apakah setiap intisari mengandung jumlah DNA
yang sama.Isolasi dan Kuantifikasi DNA [Green dan Sambrook 2018]).

Dalam banyak kasus, volume cerna restriksi ditentukan oleh konsentrasi DNA dalam
preparat yang sedang dianalisis. Konsentrasi DNA dalam preparat DNA genom mamalia
berbobot molekul tinggi terkadang sangat rendah sehingga perlu dilakukan restriksi digest
dalam volume besar. Tidak ada alasan mengapa restriksi digest dari serangkaian komparatif
DNA genomik perlu dilakukan dalam volume yang sama. Selama semua digest lengkap, volume
setiap digest restriksi tidak penting. Setelah pencernaan, fragmen DNA dapat dipekatkan
dengan pengendapan dengan etanol, diukur dengan fluorometri, dan kemudian diterapkan ke
gel dalam volume kecil buffer pemuatan gel.

• Intisari sudah lengkap. Masalah utama yang dihadapi selama pencernaan DNA berbobot molekul
tinggi adalah ketidakrataan pencernaan yang disebabkan oleh variasi konsentrasi lokal DNA.
Gumpalan DNA relatif tidak dapat diakses oleh enzim restriksi dan hanya dapat dicerna dari bagian
luar agregat. Untuk memastikan dispersi DNA yang homogen, lakukan hal berikut.

1. Jika memungkinkan, atur reaksi dalam volume total minimal 45 L. Sebelum menambahkan enzim restriksi,
simpan reaksi selama beberapa jam pada suhu 4̊C setelah pengenceran DNA dan penambahan buffer
enzim restriksi 10x.

2. Aduk perlahan larutan DNA dari waktu ke waktu menggunakan kaca kapiler tertutup.

3. Setelah penambahan enzim restriksi (5 unit/µg DNA), aduk perlahan larutan selama 2-3 menit pada
suhu 4̊ C sebelum memanaskan reaksi pada suhu yang sesuai.
4. Setelah pencernaan selama 15–30 menit, tambahkan alikuot kedua enzim restriksi (5 unit/µg DNA), dan
aduk reaksi seperti dijelaskan di atas.

276 Kutip protokol ini sebagaiProtoc Pelabuhan Mata Air Dingin;doi:10.1101/pdb.prot100487

 Diunduh darihttp://cshprotocols.cshlp.org/pada 19 Januari 2022 - Diterbitkan oleh
Pers Laboratorium Cold Spring Harbor

Blotting Selatan

5. Inkubasi reaksi pada suhu yang sesuai selama 8-12 jam.

Penting untuk memasukkan kontrol untuk menunjukkan apakah pencernaan dengan enzim restriksi selesai
dan apakah transfer dan hibridisasi DNA telah bekerja secara efisien. Tujuan ini dapat dicapai dengan
menyiapkan serangkaian intisari yang mengandung DNA genom berbobot molekul tinggi dan sejumlah kecil
plasmid yang membawa sekuens komplementer ke probe (misalnya, 10 g DNA mamalia dan 10 g DNA mamalia
dan 10 g DNA mamalia).5, 106, dan 107g plasmid). Selama pencernaan, plasmid akan dibelah menjadi
serangkaian pita yang mungkin tidak terlihat ketika gel diperiksa dengan pewarnaan dengan SYBR Gold.
Namun, fragmen dengan ukuran yang benar harus dideteksi dengan hibridisasi selanjutnya ke probe. Untuk
mengurangi kemungkinan kontaminasi yang tidak disengaja dan untuk meminimalkan kemungkinan bahwa
sinyal hibridisasi dari kontrol akan mengaburkan bahwa dari sampel uji, kontrol harus dimuat ke dalam sumur
yang terletak di satu sisi gel, jauh dari sampel uji. DNA mamalia.

Untuk informasi lebih lanjut tentang Southern blotting, lihat Pendahuluan:Analisis DNA dengan Southern
Blotting (Green dan Sambrook 2021a).

RESEP

6×Buffer Pemuatan Gel I

0,25% (b/v) xilena cyanol FF 40%

(b/v) sukrosa dalam H2O 0,25%
(b/v) bromofenol biru
Simpan di 4 C̊.

6×Buffer Pemuatan Gel IV

0,25% (b/v) bromofenol biru 40%

(b/v) sukrosa dalam H2HAI
Simpan di 4 C̊.

Buffer Transfer Alkali

0.4NNaOH
1MNaCl
Untuk transfer DNA akaline ke membran nilon.

Solusi Denaturasi

0,5MNaOH
1.5MNaCl
Untuk transfer netral, target DNA untai ganda saja.

Buffer Netralisasi I

1MTris (pH 7,4)

1,5MNaCl

Kutip protokol ini sebagaiProtoc Pelabuhan Mata Air Dingin;doi:10.1101/pdb.prot100487 277

 Diunduh darihttp://cshprotocols.cshlp.org/pada 19 Januari 2022 - Diterbitkan oleh
Pers Laboratorium Cold Spring Harbor

MR Green dan J. Sambrook

Buffer Netralisasi II

0,5MTris-Cl (pH 7,2) 1

MNaCl

Untuk transfer basa DNA ke membran nilon.

SSC

Untuk larutan 20x: Larutkan 175,3 g NaCl dan 88,2 g natrium sitrat dalam 800 mL H2O.
Sesuaikan pH menjadi 7,0 dengan beberapa tetes 14Nlarutan HCl. Sesuaikan volume
menjadi 1 L dengan H2O. Dispense ke dalam aliquot. Sterilkan dengan autoklaf.
Konsentrasi akhir bahan adalah 3,0MNaCl dan 0,3Mnatrium sitrat.

SSPE

Untuk larutan 20×: Larutkan 175,3 g NaCl, 27,6 g NaH2PO4•H2O, dan 7,4 g EDTA dalam 800
mL H2O. Sesuaikan pH menjadi 7,4 dengan NaOH (-6,5 mL dari 10Nlarutan). Sesuaikan
volume menjadi 1 L dengan H2O. Dispense ke dalam aliquot. Sterilkan dengan autoklaf.
Konsentrasi akhir bahan adalah 3,0MNaCl, 0,2MNaH2PO4, dan 0,02MEDTA.

TAE
Siapkan larutan stok 50× dalam 1 L H2HAI:
242 g basa Tris
57,1 mL asam asetat (glasial)
100 mL 0,5MEDTA (pH 8,0)
Solusi kerja 1× adalah 40 mMTris-asetat/1 mMEDTA.

Penyangga TBE

Siapkan larutan stok 5× dalam 1 L H2HAI:

54 g basa Tris 27,5
g asam borat
20 mL 0,5MEDTA (pH 8,0)
Solusi kerja 0,5× adalah 45 mMTris-borat/1 mMEDTA.
TBE biasanya dibuat dan disimpan sebagai larutan stok 5× atau 10×. PH buffer stok pekat
harus -8,3. Encerkan buffer stok pekat sebelum digunakan dan buat larutan gel dan buffer
elektroforesis dari larutan stok pekat yang sama. Beberapa peneliti lebih suka menggunakan
larutan stok TBE yang lebih pekat (10× dibandingkan 5×). Namun, larutan stok 5x lebih stabil
karena zat terlarut tidak mengendap selama penyimpanan. Melewatkan stok buffer 5x atau
10x melalui filter 0,22 m dapat mencegah atau menunda pembentukan endapan.

Penyangga TE

Reagen Jumlah (untuk 100 mL) Konsentrasi akhir

EDTA (0,5M, pH 8,0) 0,2 mL 1 mM

Tris-Cl (1M, pH 8,0) H2 1 mL 10 mM
HAI hingga 100 mL

278 Kutip protokol ini sebagaiProtoc Pelabuhan Mata Air Dingin;doi:10.1101/pdb.prot100487

 Diunduh darihttp://cshprotocols.cshlp.org/pada 19 Januari 2022 - Diterbitkan oleh
Pers Laboratorium Cold Spring Harbor

Blotting Selatan

REFERENSI

Angeletti B, Battiloro E, Pascale E, D'Ambrosio E. 1995. Selatan dan
fiksasi blot utara dengan oven microwave.Asam Nukleat Res23:879–880.
GM Gereja, Gilbert W. 1984. Urutan genomik.Proc Natl Acad Sci81:
1991–1995.
Green MR, Sambrook J. 2018. Isolasi dan kuantifikasi DNA.Dingin
Protektor Pelabuhan Musim Semidoi:10.1101/pdb.top093336.
Green MR, Sambrook J. 2021a. Analisis DNA dengan Southern blotting.Dingin
Protektor Pelabuhan Musim Semidoi:10.1101/pdb.top100396.
Green MR, Sambrook J. 2021b. Hibridisasi selatan dari radiolabeled
probe untuk asam nukleat bergerak pada membran.Protokol Pelabuhan Mata
Air Dingindoi:10.1101/pdb.prot100495.
Wahl GM, Stern M, Stark GR. 1979. Transfer fragmen DNA besar yang efisien
dari gel agarosa ke kertas diazobenziloksimetil dan hibridisasi cepat
dengan menggunakan dekstran sulfat.Proc Natl Acad Sci76:3683–3687.

Kutip protokol ini sebagaiProtoc Pelabuhan Mata Air Dingin;doi:10.1101/pdb.prot100487 279

 Diunduh darihttp://cshprotocols.cshlp.org/pada 19 Januari 2022 - Diterbitkan oleh
Pers Laboratorium Cold Spring Harbor

Blotting Selatan
Michael R. Green dan Joseph Sambrook

Protoc Pelabuhan Mata Air Dingin;doi: 10.1101/pdb.prot100487

Peringatan Email Terima email peringatan gratis saat artikel baru mengutip artikel ini -klik disini.
Melayani

Subjek Jelajahi artikel tentang topik serupa dariProtokol Pelabuhan Mata Air Dingin.
Kategori
Bioinformatika/Genomik, umum(188 artikel)
noda(62 artikel)
Elektroforesis(55 artikel) Elektroforesis DNA(47
artikel) Elektroforesis Asam Nukleat(60 artikel)
Elektroforesis Asam Nukleat, umum(47 artikel)
Elektroforesis, umum(129 artikel) Analisis Genom(186
artikel) DNA genom(132 artikel) Biologi Molekuler,
umum(1281 artikel)

Untuk berlanggananProtokol Pelabuhan Mata Air Dinginpergi ke:

http://cshprotocols.cshlp.org/subscriptions

© 2021 Cold Spring Harbor Laboratory Press