ANALISA CAIRAN SPERMA

A. PERSIAPAN DAN SAMPLING

1. Abstinensi untuk tidak mengeluarkan sperma sedikitnya 3 – 5 hari, paling lama
selama 7 hari.
2. Pengeluaran ejakulat sebaiknya dilakukan pagi hari sebelum melakukan aktifitas,
sedekat mungkin sebelum pemeriksaan laboratorium paling lama 2 jam
3. Wadah terbuat dari gelas atau plastik yang bermulut lebar dan yang lebih dahulu
dibersihkan dan dikeringkan.
4. Penulisan identitas termasuk jam pengambilan
5. Penyerahan sampel spermaSegera setelah sperma ditampung.
6. Sperma diperiksa secepatnya diperiksa. Sperma harus diletakkan di dalam suhu
kamar. Contoh sperma tidak boleh didinginkan dibawah 20°C atau dipanaskan
diatas 40°C, oleh karena kedua hal ini dapat mempengaruhi motilitas dan
viabilitas spermatozoa.
B. ALAT
1. Wadah sperma
2. Gelas ukur 5 ml dan 10 ml
3. Batang pengaduk
4. Mikroskop
5. Kaca objek
6. Kaca penutup
7. Pipet
8. Hemositometer atau kamar hitung
9. Pipet lekosit
10. Rak dan bak pewarnaan
11. Tabung reaksi
12. Botol
13. semprot
 Gambar 3 : Wadah Sperma

C. BAHAN
1. Sperma
2. pH strip
3. Larutan pengencer untuk hitung jumlah sperma, terdiri dari
a. Natrium bikarbonat 5g
b. Formalin 1 ml
c. Aqua steril sampai 100 ml
4. Zat warna Giemsa atau Wright (pemeriksaan morfologi)
5. Reagensia : Eosin-Nigrosin Supravital (pewarnaan vitalitas)
a. Eosin 5%
b. Negrosin 10 %
6. Reagensia untuk pemeriksaan fruktosa
a. Larutan Ba(OH)2 0,3 N dibuat dengan melarutkan 47,5 g
Ba(OH)2.8H2O dalam 1000 ml aqusdest.
b. Larutan ZnSO4 0,175 M dibuat dari 50 g ZnSO4.7H2O dalam 1000 ml
aquadest.
c. Larutan resorcinol 0,1% dalam 100 ml alkohol 95%, larutan ini bertahan
2 bulan bila disimpan dalan lemari es.
d. HCl 10 N dibuat dari 1 volume aquadest ditambah 6 volume HCl pekat.
e. Standard fruktosa stock 50 mg fruktosa larutkan dalam 100 ml larutan
asam benzoat 0,2%.
f. Standard fruktosa sebagai larutan kerja. 1 ml standard fruktosa stock
diencerkan dengan aquadest sampai 100 ml. Pada cara dicantumkan
dibawah, larutan kerja ini sesuai dengan 200 mg /dl fruktosa sperma
D. ANALISA SPERMA
1. PEMERIKSAAN MAKROSKOPIS
a. Warna
Amati dan catat warna yang terlihat
Normal: Putih keabu-abuan atau putih
Abnormal : putih kekuningan: karena leukosit, infeksi traktus genitalia.
Warna kemerahan karena perdarahan
b. Volume
Ukur dengan gelas ukur, catat volume sperma dalam ml
Normal: 1,5 – 5 ml
Abnormal : volume yg sedikit/terlalu banyak mempengaruhikesuburan

Gambar 4 : Pengamatan Warna dan Volume Sperma

c. Bau
Spesimen segar memberikan bau yang khas
Normal: Khas
d. pH
Celup pH meter strip ke dalam cairan sperma bandingkan warna yang
terdapat pada strip dengan warna pH standar
Normal: 7,2 - 8
 Gambar 5 : Pengukuran pH Sperma

e. Viskositas
Aspirasi sampel ke dalam pipet 5 ml dan kemudian biarkan menetes
karena gaya gravitasi dan ukur panjang benang tetesan tersebut (cm)
Normal: < 2 cm

Gambar 6 : Penentuan Viskositas Sperma

f. Liquifaksi
Liquifaksi sperma normal pada suhu ruangan terjadi dalam 30 menit.
Catat waktu sperma menjadi cair.
Normal : Terjadi dalam 10-20 menit dan lengkap dalam 30 menit
konsistensi berubah menjadi encer dan bening.
 Gambar 7 : Liquifaksi Sperma 1

2. PEMERIKSAAN MIKROSKOPIS
Tes dilakukan setelah liquifaksi lengkap dalam 1,5 – 2 jam. Suhu optimal 37 °C
a. Motilitas
Motilitas adalah presentasi sperma yang bergerak dalam sampel,
dilakukan minimal dua kali penilaian motilitas (replikat).

 Campur sampel semen hingga homogen

 Ambil sedikit sampel segera setelah homogen dan teteskan 10 μl
semen ke atas gelas objek
 Tutup dengan gelas penutup 22 x 22 mm (tinggi chamber ± 20
μm)
 Hindarkan gelembung udara
 Periksa sediaan setelah tidak ada lagi aliran (60 detik)
 Baca sediaan di bawah mikroskop dengan perbesaran
 Hitung setidaknya 200 spermatozoa per replikat
 Bila hasil antara replikat sesuai lanjutkan kalkulasi hasil. Bila
tidak buat laporkan hasil rata-rata persentase tiap tingkatan
motilitas
  Hitung rata-rata sperma yang motil dan yang tidak motil paling
sedikit lima lapangan pandang.

Gambar 8 : Penilaian Motilitas Sperma

Kategori pergerakan sperma yaitu:

- Motilitas Progresif (PR) : Spermatozoa bergerak aktif, baik

linear ataupun dalam lingkaran besar tanpa melihat
kecepatannya.
- Motilitas Non progresif (NP) : semua pola gerakan lain tanpa
progresi, seperti berenang dalam lingkaran kecil atau hanya
terlihat gerakan ekor.
- Immotil (IM) : tidak ada pergerakan

Nilai normal :

- PR + NP : > 40%
- PR : > 32%
 Gambar 9 : Pemeriksaan Motilitas Sperma

Contoh penilaian motilitas sperma :

Hasil perhitungan motilitas 200 spermatozoa secara replikat (sampel yang
sama) yaitu : PR 37% dan 28%; NP 3% dan 6%; IM 60% dan 66%. Kategori
yang paling banyak adalah immotil dengan rata-rata 63%. Dari tabel 1 diatas
terlihat bahwa untuk rata-rata 63%, perbedaan yang dapat diterima adalah
sampai 10% (66% - 60% = 6%). Karena perbedaannya kurang dari 10%
maka hasil dapat diterima dan nilai rata-rata dilaporkan PR 32%, NP 4%, IM
63%.

b. Hitung jumlah sperma

 Cara pipet thoma
 Spesimen diisap ke dalam pipet leukosit sampai tanda 0,5 dan
larutan pengencer sampai tanda 11 (Pengenceran 1:20)
 Dikocok bolak balik dengan menggunakan tangan
 Buang 3 – 4 tetes pertama
 Campuran di atas dimasukan ke dalam kamar hitung Improved
Neubauer dan dibuat dua replikat.
 Dibiarkan selama 4 menit pada suhu ruang dan lembab
 Masing-masing replikat dihitung sekurang-kurangnya 200 sperma
per replikat.
 Waktu menghitung pastikan yang dihitung adalah spermatozoa
yang lengkap yaitu yang mempunyai kepala dan ekor.
  Bila hasil antara replikat sesuai lanjutkan kalkulasi hasil. Bila tidak
buat sampel baru.
 Nilai normal : : > 20 juta/ml
 Perhitungan :
Jumlah sperma /nl = (N/n) x (1/100) x faktor pengenceran
N: Jumlah spermatozoa
n: Jumlah grid
 Contoh hitung jumlah sperma Pengenceran 1:20
Pada replikat pertama ditemukan 210 spermatozoa pada tiga grid
dan pada replikat kedua ditemukan 200 spermatozoa pada tiga
grid. Jumlah total (210 + 200) = 410 dalam enam grid dengan
perbedaan (210-200) = 10. Berdasarkan tabel 2 jumlah 410 dapat
diterima dengan perbedaan 10.
Konsentrasi sperma pada sampel spema yaitu
Jumlah sperma /nl = (N/n) x (1/100) x faktor pengenceran
= (410/6) x (1/100) x 20
= 13,6 spermatozoa /nl
= 13,6 x 106 spermatozoa /ml
Jumlah sperma total :
Jumlah sperma total yaitu jumlah sperma hasil perhitungan
dikalikan volume sperma
 Nilai normal Jumlah total sperma : > 40 juta/ejakulat

 Cara Tabung dengan Clinipette :

 Masukkan 400 ul cairan pengencer sperma kedalam tabung reaksi
dengan clinipette.
 Buang 20 ul dengan clinipette cairan tadi.
 Pipet 20 ul sperma yang telah dihomogenkan dan campur dengan
larutan pengencer.
 Kocok beberapa kali tabung atau letakkan diatas pengocok khusus
(vibrator).
 Masukkan dalam kamar hitung improved Neubauer dengan
menempelkan ujung clinipette ditepi kaca penutup.
 Hitung sel sperma yang terdapat dalam 4 kotak sedang
Hasilnya dinyatakan dalam juta/ml
Perhitungan :
 Misal jumlah didapat : 200 spermatozoa200 x 50 = 10.000/mm3=
10.000 x 1000 = 10 juta/ml
 Nilai Normal : 20 – 70 juta / ml
 Gambar 10 ; Pemeriksaan Jumlah Sperma

c. Morfologi
 1 tetes sperma diteteskan di atas kaca objek
 Dibuat sediaan apus
 Diwarnai dengan zat warna Giemsa atau Wright dan dibuat dua
replikat, lalu diperiksa dibawah mikroskop (pembesaran 100x)
 Morfologi sperma dievaluasi dengan cara membandingkan jumlah
spermatozoa yang morfologinya normal dan abnormal (ukuran dan
bentuk)
 Sperma yang abnormal adalah yang tidak lengkap atau yang
mempunyai struktur abnormal
 Dilihat pada 200 spermatozoa per replikat dan tentukan morfologi
dalam persen.
  Nilai normal Morfologi : > 4% normal (WHO 2010)

Gambar 11 : Pembuatan Slide Sperma

Gambar 12 : Morfologi Sperma

d. Pemeriksaan Vitalitas Spermatozoa

Spermatozoa yang tidak bergerak, belum tentu mati. Adakalanya
lingkungannya tidak cocok, spermatozoa tidak bergerak. Tetapi kalau
keadaan lingkungannya suatu ketika baik, ada kemungkinan spermatozoa
bergerak lagi. Maka dari itu perlu dibedakan lagi antara spermatozoa yang
hidup dengan spermatozoa yang mati. Pemeriksaan ini adalah
pemeriksaan vitalitas spermatozoa.
Untuk memeriksa vitalitas spermatozoa, dilakukan pengecatan vital atau
vital staining. Cara ini digunakan untuk memastikan diagnosa
nekrozoospermia.
Metode : Eosin-Nigrosin Supravital Stainning Sperma Viability
Tujuan : Untuk membedakan dan mengetahui sperma yang hidup dan
yang mati.
Prinsip : Sampel sperma dibuat hapusan, diwarnai, dikeringkan dan
diperiksa sperma yang mati dan yang hidup dibawah mikroskop
perbesaran 10 x 100.
Prosedur :
 Sampel sperma diteteskan kedalam tabung reaksi kecil
 Ditambahkan 1 tetes eosin 5 % dan 1 tetes negrosin 10 %, di aduk
 Diambil 1 tetes, dibuat hapusan diatas objek glass, dikeringkan.
 Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 10x100 pada 100
lapang pandang dan hasil dinyatakan dalam persen ( % ).

Penilaian :

 Spermatozoa yang mati akan berwarna merah

 Spermatozoa yang hidup akan terlihat tidak berwarna
Nilai Normal : 75 % atau lebih spermatozoa yang hidup.
Catatan :
- Spermatozoa yang mati berwarna kemerahan karena
dinding spermatozoa rusak, zat warna masuk ke dalam sel.
- Spermatozoa yang hidup tetap tidak berwarna karena
dinding sel masih utuh, tak dapat ditembus zat warna.
- Untuk membuat pengecatan vitalitas yang baik, zat warna
harus baru, jangan terlalu kental dan jangan banyak
endapan.
e. Aglutinasi
Aglutinasi dilihat dibawah mikroskop dan dicatat persentase rata-rata
spermatozoa yang berlengketa. Adanya aglutinasi menunjukkan adanya
penyebab imunologik pada infertilitas.

Gambar 13 : Tingkat Aglutinasi Sperma

f. Hitung Leukosit
Hitung leukosit dilakukan bersamaan dengan perhitungan jumlah sperma
Hitung leukosit dilakukan bersamaan dengan perhitungan jumlah sperma
 Gambar 14 : Monosit dan Segmen

g. Benda-benda mati
 Sel epitel : epitel pipih, yang berasal dari lepasan sel pada saluran
urogenitalis. Sel pada traktus urogenitalis memang mudah lepas,
apalagi kalau terjadi proses keradangan, sehingga tambahan
diagnostik untuk sesuatu keradangan.
 Kristal-kristal : berasal dari kelenjar-kelenjar asesoria.kristal yang
banyak dijumpai pada sperma : fosfat, urat dan sitrat.
 Lemak : berasal dari kelenjar prostat, berbentuk bundar jernih.
Benda ini tak banyak artinya dalam klinis.
 Benda prostat : berbentuk bundar tepinya tidak rata, serta tidak
berinti.
h. Benda-benda hidup
 Bakteri : berasal dari infeksi traktus urogenitalis, benruknya tak
nampak jelas.
 Protozoa : Infeksi traktus urogenitalis oleh protozoa sering terjadi,
misal Trichomonas, amoeba dan Clamydia trachomatis.
 Jamur : Dapat dijumpai pada pasien yang dermatitis didaerah
genitalia atau perineum.
3. TES KIMIA
Karbohidrat yang ada dalam mani ialah fruktosa dan kadar fruktosa itu
mempunyai korelasi positif dengan kadar testosteron dalam tubuh. Penetapan
kadar fruktosa memakai reaksi Selivanoff sebagai dasar, pada reaksi itu fruktosa
bereaksi dengan resorcinol dengan menyusun warna merah.
a. Penetapan Fruktos
Tujuan : Untuk mengetahui dan menentukan kadar fruktosa dalam semen
yang bertalian dengan kadar testosteron.
Prinsip : Fruktosa akan berubah menjadi furfural oleh pengaruh HCl dan
pemanasan, furfural yang terjadi akan berkondensasi dengan resorsinol
menyusun senyawa yang berwarna merah..
Prosedur Kerja :
 Lakukan deproteinisasi mani yang akan diperiksa dengan terlebih
dahulu mengencerkan 0,1 ml mani dengan 2,9 ml air. Kemudian
tambah 0,5 ml larutan Ba(OH)2, campur, tambahkan 0,5 ml larutan
ZnSO4, campur lagi dan pusinglah kuat-kuat (sampel)

Blanko (B) Standar (S) Sampel (T)

Aquades 2 ml - -
Standar - 2 ml -
Sampel - - 2 ml
Resolsinol 2 ml 2 ml 2 ml
HCL 6 ml 6ml 6 ml
Campur isi tabung masing-masing, panasilah dalam bejana
air 90°C selama 10 menit.
Bacalah absorbansi T dan S terhadap B pada 490 nm.
Hitunglah kadar fruktosa dengan rumus AT/AS x 200 =
mg / dl fruktosa sperma
Catatan :
Kadar fruktosa dalam mani normal berkisar antara 120-450 mg/dl dan
fruktosa itu berasal dari vesiculae seminales. Selain dipengaruhi oleh
kadar testosteron dalam tubuh, banyaknya fruktosa dalam sperma juga
mengalami perubahan oleh proses-proses dalam vesiculae seminales
 dan ductuli ejaculatorii, pada hipoplasia dan radang vesiculae
seminales dan pada penyumbatan partial ductuli ejaculatorii kadar
fruktosa menurun. Penyumbatan ductuli ejaculatorii yang total
berakibat kadar fruktosa dalam mani menjadi nol
Istilah yang dipakai dalam pelaporan analisa semen.

Istilah Jumlah Motilitas Morfologi

spermatozoa (%) (%)
(juta/ml)
Normospermia ≥ 20 ≥40 ≥4

Oligospermia < 20 ≥40 ≥4

Ekstrim oligospermia <5 ≥40 ≥4
Stenospermia ≥ 20 < 40 ≥4
Teratozoospermia ≥ 20 ≥40 <4
Oligoastenospermia ≥ 20 < 40 ≥4
Oligoastenoteratozoospermia < 20 < 40 <4
Oligoteratozoospermia < 20 ≥40 <4
Astenoteratozoospermia > 20 < 40 <4
Polizoospermia ≥ 250 ≥40 ≥4
Azoospermia Bila spermatozoa tidak ada
dalam semen
Nekrozoospermia Bila semua sperma tidak ada
yang hidup
Aspermia Bila tidak ada cairan semen
yang keluar saat ejakulasi
E. NILAI NORMAL
1. Pemeriksaan Makroskopis
a. Warna : putih keabu-abuan atau putih
b. Volume : 1,5 - 5 ml/ejakulat
c. Bau : Khas
d. pH : 7,2 – 8
e. Viskositas : < 2 cm
f. Liquifaksi : Terjadi dalam 10 – 20 menit dan lengkap dalam 30
menit. Konsistensi berubah menjadi encer dan bening

2. Pemeriksaan mikroskopis
a. Konsentrasi sperma : > 20 juta / ml
b. Jumlah sperma total : > 40 juta / ejakulat
c. Motilitas : PR + NP > 40 % , PR > 32% (rata-rata)
d. Morfologi normal : > 4 % normal
e. Aglutinasi :-
f. Lekosit : < 1 x 106/ml
g. Eritrosit :-
3. Pemeriksaan Kimia
Fruktosa normal berkisar antara 120-450 mg/dl