Isolasi & Identifikasi Flavonoid

Fitokimia

 Struktur Utama

Flavanon Flavanol Flavon

Isoflafon Flavonol Anthocyandine

 Sifat Berdasarkan Struktur

Dalam Tumbuhan:
- Bentuk aglikon dan glikosida

Glikosida Flanovoid:

- O- glikosida (lebih umum terdapat di alam)

 - Mudah dihidrolisis
- C-glikosida (jarang ditemukan di alam)
- Sulit dihidrolisis

Pada Umumnya Flavonoid:

- Larut dalam air dan etanol (polar)

- Tidak larut dalam eter minyak bumi (non polar)
- Memberikan serapan kuat pada daerah spektrum UV dan tampak (sistem aromatik
terkonjugasi / kromofor)
 Metode Isolasi

Figure 3. schematic of strategies for the determination of phenolic acid and flavonoids
in biological fluids, bevegerages, plants, and foof. Abbreviation: SFE, supercritical
fluid extraction; MSPD, matrix solid-phase dispersion; SPME, solid-phase
microextraction; CCC, counter-current chromatography; FL. Fluorestence; FID, flame
ionisation detection; ECD, electron capture detection.
 Penyiapan sampel
- Bisa berupa tumbuhan segar (bahan awal yang ideal untuk menganalisis
flavonoid)
- Bisa berupa tumbuhan yang dikeringkan (jika disimpan dalam kondisi baik)
Secara umum:
- Untuk sampel padatan: dilakukan perajangan, penyerbukan, homogenisasi yang
bisa dilakukan melalui proses pengeringan udara ataupun freeze-drying
- Untuk sampel cairan: dilakukan penyaringan kemudian sentrifugasi.
 Hidrolisis Glikosida Flavonoid
- Hidrolisis pada flavonoid bertujuan untuk memecah ikatan gula dari pesenyawaan
glikosida
- Hidrolisis Asam
Waktu yang diperlukan untuk hidrolisis:
 Tidak hanya ditentukan kekuatan asam tapi juga ditentukan oleh sifat gula
(misalnya: glukuronida>glukosida=galaktosida>ramnosida)
 Juga ditentukan oleh posisi substitusi gula (misalnya: 7-O-glikosida >4’-O-
glikosida > 3-O-glikosida)
 Contoh : Hidrolisis antosianin dilakukan secara refluks dalam pelarut meOH
dengan penambahan HCI 2N
 Hidrolisis & Analisis Glikosida
- Hidrolisis Enzim
 Berguna untuk menentukan sifat ikatan antara gula dan flavunoid (alfa atau
β)
 Secara teori dapat digunakan untuk memutuskan monosakarida khas dari
flavonoid O-glikosida
 Contoh enzim: β -glukosidae: menghidrolisis β -D-glikosida, kec.
Antosianin, β -galaktosidae, peniktinase.
- Hidrolisis Basa
 Jarang digunakan untuk menghidrolisis flavonoid glikosida
 Tapi efektif untuk memutus gula secara selektif dari posisi 7 atau 4’
 Ekstraksi
- Flavonoid (terutama dalam bentuk glikosida) dapat mengalami degradasi oleh
aktivitas enzimatik ketika bahan tanaman dalam keadaan segar.
 - Disarankan untuk menggunakan sampel beku / kering.
- Setelah kering, bahan yang digunakan biasanya dibuat serbuk.
- Untuk ekstraksi, pelarut yang dipilih tergantung pada jenis flavonoid yang
dibutuhkan.
Polaritas merupakan pertimbangan penting.
- Flavonoid yang kurang polar (misalnya, isoflavon, flavanones, flavon dan metil
flavonol) diekstraksi dengan kroloform, CH2CI2, dietil atau etil asetat.
- Glikosidal flavonoid dan aglikon yang lebih polar diekstraksi dengan alkohol atau
campuran alkohol-air. Ikatan glikosida meningkatkan kelarutan dalam air dan
larutan air-alkohol.
- Ekstraksi kandungan flavonoid masih menggunakan metode ekstraksi pelarut.
 Metode Ekstraksi Flavonoid

Serbuk
Simplisia
Diklorometan

Ekstrak
RESIDU
CH2CI2

Alkohol

 Flavonoid  Flavonoid
Aglikon glikosa
 Senyawa2  Senyawa2
kurang polar polar
 - Menggunakan metode ekstraksi bertingkat
- Beberapa flavanon dan glikosa chalcone sulit larut dalam campuran metanol,
etanol atau alkohol-air
- Kelarutan flavaton tergantung pada pH larutan yang mengandung air
 Beberapa metode ekstraksi flavonoid
- Soxhlet
 Umum digunakan untuk mengektraksi flavonoid dari sampel
 Pelarut: metanol-air, asetonitril
 Waktu: bervariasi, hingga 12 jam
- SFE (supercritical Fluid Extraction)
 Menghasilkan ekstraks yang lebih murni, produk degradasi lebih minimal
 Terbebas dari klorofil dan senyawa non polar lain.
- Pressuried Fluid Extraction
- Microwave-assited Extraction
 Cara pemisahan Flavonoid
- KKt preparatif
 Kertas whatman No. 17 (kapasitas > whatman No. 3, resolusi <<)
- Kromatografi kolom
 FG: pelarut yang cocok diperoleh melalui pemantauan KLT umumnya
menggunakan elusi landaian.
 FD:
o Selulosa: memisahkan antar senyawa glikosida, memisahkan glikosida dari
aglikon. Kapasitas rendah
o Silika: memisahkan aglikon yang kurang polar, misalnya: isoflavon,
flavanon, flavonol
o Poliamida: cocok untuk memisahkan semua flavonoid
- KLT (untuk analisis cepat)
 FD: selulosa, poliamida, silica, FG: tergantung dari jenis FD
 KLT berfungsi juga untuk:
o Mencari pelarut untuk kromatografi kolom
o Menganalisis fraksi yang keluar dari krom. Kolom
o Melihat terjadi perubahan reaksi seperti hidrolisis atau metilasi
o Identifikasi flavonoid murni dalam skala kecil
 KCKT
o Menggunakan Kolom fase balik
 METODE IDENTIFIKASI
- Metode Identifikasi Flavonoid
 Salah satu fitur yang berperan besar dalam analisis flavonoid adalah
keberadaan gugus cincin fenil dalam strukturnya.
 Berfungsi sebagai chromophore, yang bersifat UV active dan mengakibatkan
flavonoid mudah untuk dideteksi.
 Spektrum UV flavonoid sangat informatif, memberikan informasi yang cukup
untuk dapat mengidentifikasi jenis flavonoid dan pola oksidasi fenel.
- Spektrofotometri UV-Sinar tampak
 Merupakan cara yg paling banyak digunakan u/ menganalisis struktur
flavonoid dalam hal mengidentifikasi jenis & menentukan pola oksigenasi
flavonoid.
 Secara umum, metode ini memanfaatkan sifat absorbsi cahaya pada
panjang gelombang tertentu oleh sampel atau senyawa yang diukur.
 Prinsip dasar: terjadinya transisi elektronik yang disebabkan penyerapan
sinar UV-Vis yang mampu mengeksitasi elektron ke orbital kosong atau ke
tingkat energi orbital yang lebih tinggi.
- Spektrofotometri UV-Sinar tampak u/flavonoid
 Spektrum flavonoid umum
o Biasanya ditentukan dalam larutan MeOH
o Spektrum khas terdapat 2 panjang gelombang maksimal: 240-285 (pita
II), 300-550 (pita I).
o Ciri khas:
Serapan pita yg rendah pd dihidroflavon, dihinroflavonol, isoflavon.
Serapan pita I yg kuat pd khalkone, auron, antosianin.
Posisi hidroksil fenol bebas pada inti flavonoid dapat ditentukan dgn
menambahkan pereaksi geser.
Secara tidak langsung dapat digunakan u/ menentukan posisi gula/
metil yg terikat pd salah satu ggs hidroksil fenol.
Kelebihan: jumlah flavonoid yg digunakan sedikit (0,1 mg).
- Spektrum serapan UV-Sinar Tampak Flavonoid

- Gambaran Spektrum UV-Sinar Tampak Flavonoid secara umum

 Perubahan di cincin A tercermin pada serapan pita II, perubahan di cincin B
dan C tercermin pada pita l.
 Oksigenasi tambahan (terutama OH) umumnya mengakibatkan pergeseran pita
yg sesuai pada panjang gelombang yg lebih tinggi.
 Metilasi atau glikosilasi (terutama pd posisi 3,5,7, 4'-OH) mengakibatkan
pergeseran pita ke pjg gelombang lebih rendah.
 Pada flavon dan flavonol, adanya 3', 4'-di OH, dapat dibuktikan dgn adanya
puncak kedua di pita II (kadang2 berupa bahu)
- Spektofometri UV-Sinar tampak u/flavonoid
 Pereaksi geser yang biasa digunakan:
o Natrium metoksida (NaOMe) untuk mendeteksi:
OH bebas pada C3 atau OH grup pada C4’;
Dihidroksil C-3,4’
o Natrium asetat (NaOAc) untuk mendeteksi:
OH C-7 pada flavon dan flavonol
OH C-4’ pada flavon dan flavonol
o Alumunium Klorida ( AIC I 3) dan AICI3/HCI untuk mendeteksi:
Ggs orto-dihidroksi
Ggs hidroksil di C3 atau C5
o Asam borat ( NaOAc / H 3 B O3 ), untuk mendeteksi:
Ggs dihidroksil pada cincin A dan B
 Tahapan kerja menggunakan pereaksi geser:
o Ukur spektrum cuplikan dalam pelarut MeOH (spektrum MeOH),
kemudian tambahkan 3 tetes prx NaOMe u/memeriksa apakah terjadi
penguraian. Inkubasi selama 5 menit, ukur kembali spektrum NaOMe,
cuplikan dibuang. Diisi lagi dengan larutan persediaan flavonoid.
o Tambahkan 6 tetes prx AIC I 3, ke dalam larutan flavonoid, ukur spektrum
AIC I 3,kemudian tambahkan 3 tetes HCI, campur, ukur spektrum AIC I 3
,/HCI. Buang cuplikan.
o Tambahkan NaOAc ke dalam larutan flavonoid, ukur spektrum NaOAc,
tambahkan H 3 B O 3, ukur spektrum NaOAc/ H 3 B O 3
 Penafsiran Spektrum
o Spektrum NaOMe:
Merupakan spektrum batas ttt ionisasi flavonoid (posisi 3, 4, 7 & 4'
hidroksil)
Merupakan petunjuk sidik jari pola hidroksilasi flavonoid.
o Spektrum NaOAc
Mendeteksi adanya gugus 7-hidroksil bebas
o Spektrum NaOAc/H3BO3
Menjembatani kedua gugus hidroksil pada gugus o-hidroksil.

 Penafsiran Spektrum
o Spektrum AICI3/HCI
Adanya gugus OH bebas pada C5 flavon diketahui berdasarkan:
1. Penambahan AIC I 3+ HCI pada larutan metanol, memberikan
pergeseran bathokromik 35-55 nm Pita I.
2. Bentuk spektrum dalam metanol setelah penambahan AIC I 3+ HCI
terdiri dari empat puncak (pita la dan lb serta lla dan llb)

o Spektrum AICI3-HCI
o Spektrum IR Flavonoid

Hasil Analisis:
1. Adanya serapan melebar pada daerah bilangan gelombang 3397,45
cm O-H.
2. Gugus fungsi C=0 ditunjukkan pada bilangan gelombang 1701,84
cm-1.
3. Serapan uluran C-C aromatik muncul pada bilangan gelombang
1638,87 cm-1 didukung adanya serapan C-H pada 1361, 15 cm-1.
4. Gugus C-OH ditunjukkan dengan adanya serapan yang lemah pada
bilangan gelombang 1254,93 cm-1.
5. Pada spektrum inframerah di atas serapan tajam pada daerah
bilangan gelombang 1020,47 cm-1 dengan pita Temah
menunjukkan gugus C-O.
6. Pada isolat flavonoid ini menunjukkan adanya gugus fungsi O-H,
C=O, C-C, CH, C-OH, dan C-O menandakan bahwa isolat ini
positif mengandung senyawa flavonoid.