Desain, Sintesis, dan Struktur Studi Hubungan Aktivitas

Inhibitor Fluorescent Siklooksigenase-2 sebagai Optik Bertarget

Agen Pencitraan

Md. Jashim Uddin, Brenda C. Crews, Kebreab Ghebreselasie, dan Lawrence J. Marnett*
A. B. Hancock, Jr., Laboratorium Memorial untuk Penelitian Kanker, Departemen Biokimia, Kimia dan
Farmakologi,Institut Biologi Kimia Vanderbilt, Pusat Toksikologi Molekuler dan Pusat Kanker
Vanderbilt-Ingram, Vanderbilt Fakultas Kedokteran Universitas, Nashville, Tennessee 37232-0146,
Amerika Serikat

ABSTRAK: Siklooksigenase-2 (COX-2) merupakan senyawa atraktif target untuk pencitraan molekuler
karena merupakan enzim yang dapat diinduksi yang diekspresikan sebagai respons terhadap inflamasi dan
proliferatif rangsangan. Baru-baru ini, kami melaporkan bahwa konjugasi indometasin dengan pewarna
karboksi-X-rhodamin menghasilkan pembentukan agen pencitraan optik yang efektif, bertarget, mampu
mendeteksi COX-2 pada jaringan inflamasi dan premalignant dan maligna tumor (Uddin et al. Cancer
Res. 2010, 70, 3618−3627). Makalah ini merangkum rincian struktur−studi hubungan aktivitas (SAR)
yang dilakukan untuk timbal optimasi pewarna ini. Berbagai macam fluorescent konjugat dirancang dan
disintesis, dan masing-masing dari mereka telah diuji kemampuannya untuk secara selektif menghambat
COX-2 sebagai protein murni dan dalam sel kanker manusia. Studi SAR mengungkapkan bahwa konjugat
indometasin adalah target COX-2 terbaik dibandingkan dengan obat antiinflamasi nonsteroid (NSAID)
lain yang mengandung asam karboksilat atau selektif COX-2 inhibitor (COXIB). Penghubung n-
butildiamida optimal untuk menambatkan fungsionalitas fluoresen yang besar ke NSAID atau inti
COXIB. Aktivitas konjugat juga tergantung pada ukuran, bentuk, dan sifat elektronik dari fluorofor
organik.Reagen-reagen ini diambil oleh sel-sel yang mengekspresikan COX-2 dalam kultur, dan
penyerapannya diblokir oleh perlakuan awal dengan COX. penghambat. Dalam pengaturan in vivo,
reagen ini menjadi sangat diperkaya dalam tumor yang mengekspresikan COX-2 dibandingkan dengan
sekitarnya jaringan normal, dan mereka terakumulasi secara selektif pada tumor yang mengekspresikan
COX-2 dibandingkan dengan tumor negatif COX-2 yang tumbuh di tikus. Dengan demikian, penghambat
fluoresen bertarget COX-2 berguna untuk deteksi praklinis dan klinis lesi yang mengandung peningkatan
kadar COX-2.
PENDAHULUAN
Deteksi dini adalah salah satu tantangan penting antibodi monoklonal yang secara khusus
untuk perawatan kanker klinis mengikat reseptor pada sel tumor,7,8 probe
kontemporer.Deteksi premalignant kecil lesi dan fluoresen dekat-inframerah yang diaktifkan oleh
tumor primer stadium awal sangat penting untuk protease untuk mendeteksi tumor,9 pencitraan
terapi kanker. Untuk alasan ini, minat pada tumor in vivo yang ditargetkan reseptor folat
teknik pencitraan yang sangat sensitif untuk menggunakan konjugat pewarna-folat
onkologi klinis telah meningkat pesat dalam nearinfrared (NIR),10 dan ditargetkan integrin
beberapa dekade terakhir. Banyak kelompok pencitraan metastasis paru-paru dan hati
telah mempelajari deteksi in vivo tumor menggunakan 64Cu-1,4,7,10
menggunakan agen kontras yang sesuai untuk tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid
berbagai modalitas pencitraan.1−3 Metode telah (DOTA) dimer arginylglycylaspartic acid
dikembangkan untuk penargetan untuk peptide radiotracer.11 Isozim siklooksigenase
memaksimalkan lokalisasi ligan di tumor dan (COX) mengkatalisis biotransformasi asam
untuk meminimalkan penyerapan di lingkungan arakidonat menjadi berbagai macam
normal jaringan untuk mencapai rasio signal-to- prostaglandin yang merupakan mediator biologis
noise yang tinggi.4−6 Pendekatan ini termasuk penting dari penyakit inflamasi COX-1 secara
pencitraan tumor yang ditargetkan menggunakan konstitutif diekspresikan di sebagian besar
jaringan normal, di mana ia memodulasi fungsi
rumah tangga, seperti hemostasis,tonus vaskular,
dan sitoproteksi mukosa lambung.13 COX-2
tidak ada atau diekspresikan pada tingkat yang
sangat rendah di sebagian besar sel epitel tetapi
ditemukan pada tingkat tinggi pada lesi
inflamasi dan banyak tumor ganas dan ganas.
COX-2 mRNA terdeteksi pada tahap awal
tumorigenesis, seperti polip adenomatosa di usus
Diterima: 29 Desember 2012
Revisi: 9 Maret 2013
Diterbitkan: 15 Maret 2013
Artikel pubs.acs.org/bc © 2013 American Chemical Society 712 dx.doi.org/10.1021/bc300693w | Kimia
Biokonjugasi. 2013, 24, 712−7
adalah target ideal untuk pencitraan molekuler
dengan radiolabeled or penghambat COX-2
fluoresen.Untuk menguji hipotesis ini, kita dan
laboratorium lain telah mempelajari pencitraan
COX-2
ekspresi dalam peradangan dan kanker
menggunakan inhibitor selektif COX-2 berlabel
123I atau 18F. 22-26 Selain itu, kami baru-baru
ini menggambarkan konversi berbasis konjugasi
dari obat anti inflamasi nonsteroid (NSAID),
indometasin, menjadi konjugat fluorescent
carboxy-X-rhodamin (ROX) yang mampu
menghambat COX-2 secara selektif dan kuat
dalam protein murni dan sel utuh. Ini konjugat,
yang tidak secara signifikan menghambat COX-
1,memungkinkan pencitraan optik COX-2 pada
inflamasi
PROSEDUR EKSPERIMEN
Kimia. Metode standar digunakan untuk sintesis
turunan fluoresen dari NSAID dan
COXIB.Berbagai macam senyawa inti yang
mengandung asam karboksilat (misalnya,
indometasin, iodoindometasin, analog indolil
karboksamida dari indometasin (indometasin
terbalik),flurbiprofen, ketoprofen, atau turunan
asam karboksilat dari celecoxib) ditambatkan
melalui serangkaian alkil, aril piperazinyl, atau
penghubung polietilen glikol ke berbagai macam
dari gugus fluorofor organik yang besar.
Fluorofor
termasuk dansyl, dabsyl, kumarin, fluorescein,
rhodamin,pewarna alexa-fluor, nile blue, cy5,
cy7, near IR, dan IR, serta beberapa chelator
lantanida (Gambar 1). Prosedur sintetis, dalam
besar atau kerongkongan Barrett. 16−19 ekspresi
COX-2 mempromosikan pertumbuhan tumor,
angiogenesis, dan metastasis kanker cell.14,15
Karya terbaru menunjukkan bahwa penghambat
COX-2 selektif berguna dalam profilaksis
berbagai kanker manusia Tingkat COX-2 yang
tinggi pada premalignant dan maligna tumor
dibandingkan dengan jaringan normal di
sekitarnya menunjukkan bahwa
lesi dan tumor yang mengekspresikan COX-2 in
vivo.27 Saat ini makalah menjelaskan rincian
studi struktur-hubungan aktivitas (SAR) yang
dilakukan untuk optimasi timah ini senyawa dari
berbagai konjugat fluoresen NSAID atau COX-
2-selective inhibitor (COXIBs).Konjugat
dievaluasi sebagai pencitraan bertarget COX-2
agen, dan molekul aktif divalidasi in vitro dan in
vivo sebagai agen bertarget COX-2 dalam sel
dan tumor. Itu hasil memberikan latar belakang
kritis dan dukungan lebih lanjut untuk
laporan kami sebelumnya,27 yang
mengungkapkan yang pertama secara
fluoresensi agen pencitraan optik berlabel
divalidasi untuk target COX-2 pencitraan in vivo
peradangan dan kanker.
Selain karakterisasi analitis dan spektroskopi
semua senyawa, dijelaskan dalam Informasi
Pendukung.
Fluorometri. Eksitasi fluoresensi keadaan tunak
dan spektrum emisi ditentukan untuk setiap
senyawa dengan a Spex 1681 Fluorolog
spektrofluorometer, dilengkapi dengan a Lampu
busur xenon 450 W. Eksitasi dan emisi
lebar celah monokromator adalah 12 mm.
Pelarut yang digunakan adalah buffer pH 7.
Uji Inhibisi Menggunakan COX-1 dan COX-
2 yang Dimurnikan. Penghambatan COX-1
ovine atau COX-2 tikus yang dimurnikan
dengan pengujian senyawa diuji dengan metode
yang dijelaskan sebelumnya, 27 yang
mengkuantifikasi konversi [1-14C]asam
arakidonat menjadi
[1-14C] produk prostaglandin. Campuran reaksi
200 L terdiri dari protein hematin-rekonstitusi
dalam 100 mM TrisHCl, pH 8,0, 500 M fenol,
dan [1-14C]asam arakidonat (50 M, 55−57
mCi/mmol, Perkin-Elmer). Untuk uji
penghambatan yang bergantung pada waktu,
hematin yang dilarutkan COX-1 (44 nM) atau
COX-2 (66 nM) diprainkubasi pada suhu 25 °C
selama 17 menit dan 37 °C selama 3 menit
dengan berbagai inhibitor konsentrasi dalam
dimetilsulfoksida diikuti dengan penambahan
[1-14C]asam arakidonat (50 M) selama 30 detik
pada 37 °C. Reaksi diakhiri dengan ekstraksi
pelarut dalam dietil eter/ buffer methanol/1 M
sitrat, pH 4.0 (30:4:1). Fase-fase dipisahkan
dengan sentrifugasi pada 2000g selama 2 menit,
dan fase organik terlihat pada pelat kromatografi
lapis tipis (EMD Kieselgel 60, VWR). Pelat
dikembangkan dalam etil asetat/metilen
klorida/glasial AcOH (75:25:1) pada 4
°C.Produk berlabel radio diukur dengan
radioaktivitas pemindai (Bioscan, Inc.,
Washington, DC. Persentase dari total produk
yang diamati pada konsentrasi inhibitor yang
berbeda dibagi dengan persentase produk yang
diamati untuk protein sampel dipreinkubasi
untuk waktu yang sama dengan dimetil
sulfoksida.
Kultur Sel dan Metabolisme Sel Utuh In
Vitro Pengujian kadar logam.
Penghambatan COX-2 dalam sel utuh oleh
senyawa uji diuji dengan metode yang
dijelaskan sebelumnya.27 Secara
singkat,RAW264.7, ATCC TIB-71 sel mirip
makrofag murine (nomor bagian 8−15,
mikoplasma negatif oleh polimerase metode
deteksi reaksi berantai) ditanam di Dulbecco's
Media Elang yang Dimodifikasi (DMEM) +
10% janin yang tidak diaktifkan panas serum
sapi hingga 40% pertemuan (piring 6-sumur,
Sarstedt). Itu sel diaktifkan selama 7jam dalam 2
mL DMEM bebas serum dengan 200 ng/mL
lipopolisakarida bakteri (Calbiochem) dan10
U/mL interferon gamma (Calbiochem) untuk
menginduksi COX-2 ekspresi. 1483 sel
skuamosa kepala dan leher manusia karsinoma
(HNSCC) sel (bagian 8-18, mikoplasma) negatif
dengan metode deteksi reaksi berantai
polimerase) dikultur dalam DMEM/F12 + 10%
serum janin sapi + antibiotik / antimikotik di
piring 6-sumur hingga 60% pertemuan.Medium
bebas serum (2 mL) ditambahkan, dan sel-sel
diobati dengan inhibitor yang dilarutkan dalam
DMSO (0−5 M, final konsentrasi) selama 30
menit pada 37 ° C diikuti dengan penambahan
[1-14C]-asam arakidonat [10 M, 55 mCi/mmol]
selama 20 menit pada 37 °C. Reaksi dihentikan
dan dianalisis dengan lapisan tipis kromatografi
seperti yang dijelaskan di atas.
Mikroskop Fluoresensi dari 1483 Sel
HNSCC.
Pencitraan fluoresensi 1483 sel HNSCC
manusia dengan senyawa 58 dilakukan dengan
metode yang dijelaskan sebelumnya.27 Secara
singkat,1483 sel HNSCC manusia ditumbuhkan
hingga 60% pertemuan. Itu sel diinkubasi dalam
2,0 mL larutan garam seimbang Hank
(HBSS)/Tyrode dengan senyawa 200 nM 58
selama 30 menit pada 37 °C. Sel-sel kemudian
dicuci sebentar tiga kali dan diinkubasi dalam
HBSS/Tyrode selama 30 menit pada suhu 37°C.
Mengikuti periode pencucian yang diperlukan,
sel-sel dicitrakan dalam 2,0 mL HBSS/Tyrode
baru pada Mikroskop Zeiss Axiovert 25 dengan
filter propidium iodida (paparan 0,5−1,0 detik,
perolehan 2). Semua perawatan dilakukan di
piring duplikat di setidaknya tiga eksperimen
terpisah. Untuk memblokir situs aktif COX-2,
sel-sel dipreinkubasi dengan 5 atau 10 M
indometasin selama 20 menit sebelum
penambahan senyawa uji.Pembentukan Tumor
Xenograft pada Tikus Telanjang.1483 sel
HNSCC manusia dan karsinoma kolorektal
HCT116 sel digunakan untuk menumbuhkan
xenograft tumor pada tikus telanjang
menggunakan metode yang dijelaskan
sebelumnya.27 Tikus telanjang betina, NU-
Fox1nu, dibeli pada usia 6−7 minggu dari
Charles Laboratorium Sungai. 1483 sel HNSCC
manusia dan HCT116 sel karsinoma kolorektal
di-tripsinisasi dan disuspensikan kembali dalam
PBS dingin yang mengandung 30% Matrigel
sedemikian rupa sehingga 1 × 106 sel di 100 L
disuntikkan secara subkutan di sisi kiri. Itu
Xenografts HCT116 dan 1483 hanya
membutuhkan 2−3 minggu pertumbuhan.Di
Vivo Pencitraan Tikus Telanjang dengan
Xenografts. Pencitraan fluoresensi tumor dengan
senyawa uji adalah dilakukan dengan metode
yang dijelaskan sebelumnya.27 Wanita telanjang
tikus yang membawa tumor xenograft 1483 atau
HCT116 berukuran sedang di sayap kiri diberi
dosis injeksi intraperitoneal dengan 2mg/kg
senyawa 58. Hewan dibius ringan dengan
isoflurane 2% untuk pencitraan fluoresensi di
Xenogen IVIS 200 dengan filter DSRed pada
kedalaman 1,5 cm dan 1 s paparan (f2).
HASIL
Sintesis Inhibitor Fluorescent COX-2. Sintesis
agen pencitraan NSAID- atau COXIB-diamide
ditargetkan untuk COX-2 pertama diperlukan
konjugasi karboksilat gugus fungsi nukleus
NSAID atau COXIB menjadi diamina
penghubung Ikatan diamida dipilih daripada
ikatan amidaester campuran untuk
meminimalkan potensi hidrolisis secara utuh sel
atau in vivo. Perpaduan selektif hanya satu dari
keduanya gugus amino yang tersedia hadir
dalam tambatan diamina memerlukan
perlindungan dari salah satu kelompok. Ini
dicapai dengan menggunakan mono tert-
butoxycarbonyl (BOC)-dilindungi alkildiamine.
Reaksi indometasin dengan serangkaian mono
BOC-alkildiamina dengan adanya etil-1-[3-
(dimetilamino)propil]-3-etilkarbodiamida diikuti
oleh perlakuan dengan HCl (gas) memberikan
garam hidroklorida indometasin-alkilamina yang
sesuai dalam hasil tinggi. Demikian pula,
indometasin-piperazin hidroklorida dan
indometasinfenilendiamin hidroklorida disintesis
dengan mengganti mono BOC-alkildiamine
dengan mono BOC-piperazin atau mono BOC-
phenylenediamine, masing-masing. Untuk
mensintesis indometasin-polietilen glikol (PEG)
karboksilat asam, t-butil-PEG4-amina digunakan
sebagai pengganti mono BOCalkyldiamine,
diikuti oleh deproteksi dengan asam
trifluoroasetat pada suhu kamar. Seperti
dijelaskan di atas, NSAID lainnya,COXIB, atau
analog yang sesuai ditautkan ke tether yang
dipilih (alkyldiamine, PEG, piperazine, atau
phenylene diamine) untuk membentuk konjugat
yang sesuai memiliki terminal primer atau amina
sekunder atau gugus asam karboksilat.
Isothiocyanate, sulfonilklorida, atau ester
suksinimidil yang diinginkan fluorofor
terkonjugasi dengan gugus amino dari
tether-linked-NSAID atau -COXIB
menggunakan trietilamina sebagai basa.Atau,
pembentukan karboksilamida dari reaksi asam
karboksilat dengan gugus amino membutuhkan
etil-1-[3-(dimetilamino)propil]-3-
etilkarbodiamida atau reaksi kopling
N,N,N,Ntetrametil-O-(N-suksinimidi)uronium
tetrafluoroborat. Menggunakan strategi umum
ini, 5-ROX-acid adalah diaktifkan menggunakan
N,N,N,N-tetramethyl-O-(N-succinimidyl)-
uronium tetrafluoroborat dengan adanya
trietilamina di suhu kamar dan ditambah dengan
gugus amino bebas dari NSAID atau COXIB
yang terkait tether untuk membeli target
konjugat fluoresen. Semua pewarna fluoresen
lainnya adalah terkonjugasi dengan masing-
masing perancah NSAID atau COXIB
menggunakan strategi kopling serupa dalam
hasil yang baik (60-70%). Itu struktur semua
senyawa ditentukan oleh NMR dan massa
spektrometri. Analisis HPLC dalam dua sistem
pelarut yang berbeda dari semua senyawa
fluoresen representatif menunjukkan a
kemurnian minimal 96,0%. Sebagian besar
senyawa berada di melebihi kemurnian 98,5%.
Prosedur dan senyawa sintetis karakterisasi
dijelaskan secara rinci dalam Mendukung
Informasi.Evaluasi Inhibitor Fluorescent COX-2
Menggunakan Enzim yang Dimurnikan.
Aktivitas penghambatan senyawa uji terhadap
COX-1 ovine atau COX-2 tikus dievaluasi
dengan uji kromatografi lapis,27 seperti yang
dijelaskan secara singkat dalam Prosedur
Eksperimental.Konjugat Indometasin dari
Fluorofor Biru dan Hijau. Nilai IC50 untuk
penghambatan enzim COX murni oleh senyawa
uji tercantum pada Tabel 1. Senyawa 1, a
konjugat indometasin dan kumarin ditambatkan
melalui penaut etilendiamida, menampilkan
penghambatan COX-2 selektif (Tabel 1).
Perpanjangan panjang rantai dari grup
penghubung 1 hingga homolog alkil yang lebih
tinggi atau penggantian kumarin dengan 7-
diethylaminocoumarin mengungkapkan
peningkatan potensi yang signifikan dan
selektivitas terhadap COX-2 (4−5). Misalnya,
n-butydiamide-conjugate 5 lebih poten dan
selektif sebagai a COX-2 inhibitor dari 1.
Konjugasi fungsi organik(yaitu, N,N-
dimethylamino cinnamic acid, sulfathiazole,
sulfadimethoxine, mycophenolic acid, atau
biotin) memberikan serangkaian senyawa
(6−12), di mana trans-cinnamyl (6) atau
konjugat sulfathiazolyl (7) ditampilkan kuat dan
selektif penghambatan COX-2. Dibandingkan
dengan senyawa 6 atau 7, dansyl (13−15) atau
dabsil (16−17) turunan lebih kuat dan selektif
untuk penghambatan COX-2 (13, ex = 355 nm,
em = 493 nm).Nitrobenzoxadiazole (NBD) yang
ditambatkan dengan n-butydiamide konjugat
(18) juga menunjukkan penghambatan COX-2
selektif.Namun, pemendekan rantai alkil atau
penggabungan perphenazine dengan senyawa 19
dan 20 menunjukkan lengkap hilangnya
aktivitas penghambatan COX (20, ex = 492 nm,
em = 505 nm).Meskipun hilangnya aktivitas
COX yang serupa diamati dengan fluorescein-
conjugates (misalnya, 21, 22, 24−26, 29−31),
senyawa 23, 27, dan 28 menunjukkan aktivitas
penghambatan COX-2 untuk sampai batas
tertentu. Hasil ini menunjukkan bahwa
transformasi indometasin menjadi konjugat
Penghambatan COX diamati dengan 38
memiliki penghubung n-pentilsulfonamido n-
butildiamida (36, ex = 571 nm, em = 593
nm).Penghambatan COX-2 selektif oleh turunan
5- atau 6-ROX adalah sangat sensitif terhadap
panjang dan sifat elektronik bagian penghubung.
Misalnya, konjugat 5-ROX 39, mengandung
penghubung etilendiamida, adalah inhibitor
lemah dari COX-2. Ketika panjang rantai alkil
meningkat, penghambatan COX-2 potensi dan
selektivitas meningkat secara substansial,
dengan turunan nbutildiamida 41 (Fluorocoxib
A, ex = 580 nm, em = 605 nm) menunjukkan
kombinasi terbaik penghambatan COX-2 potensi
dan selektivitas dan diidentifikasi sebagai salah
satu yang paling potensial
turunan dalam seri.27 Peningkatan lebih lanjut
dalam rantai alkil panjang menghasilkan
pengurangan dramatis dalam penghambatan
aktivitas yang ditampilkan sebanding dengan
konjugat 5- dan 6-ROX.Singkatnya, penaut n-
alkil empat karbon dengan 5- atau 6-ROX
memberikan keseimbangan terbaik untuk
aktivitas penghambatan COX-2 dan selektivitas
konjugat indometasin fluoresen.Konjugat
Indometasin dari Fluorofor NIR. Konjugasi
pewarna biru nil dengan bagian asam karboksilat
dari indometasin yang ditambatkan melalui
tautan PEG4 yang diberikan senyawa 65 (λex =
fluoresen dapat menyebabkan selektif
penghambatan COX-2; namun, panjang dan sifat
tambatan
dan struktur fluorofor memiliki dampak yang
signifikan
pada potensi penghambatan COX dari konjugat.
Konjugat Indometasin dari Fluorofor Merah. Itu
turunan fluoresen indometasin dengan alexa
fluor,
tetramethylrhodamine, atau bis-
iodobenzylcarboxyrhodamine
(senyawa 32−35) tidak menunjukkan aktivitas
penghambatan COX,
bahkan pada konsentrasi yang lebih tinggi
(Tabel 2). Namun, COX-2
aktivitas penghambatan dicapai dengan PEG
yang mengandung
konjugat tetraetil 5- atau 6-sulforhodamin 36
dan 37. Buruk
COX-2 potensi (misalnya, 42 dan 43).
Menariknya, fenilena turunan 44 dan 45
menunjukkan potensi yang mirip dengan
41.Penggantian n-butyldiamide linker dari
senyawa 41
dengan piperazine linker menghasilkan inhibitor
yang sangat lemah (46) dari COX-2. Demikian
juga, konjugat indometasin-6-ROX
(47−56),dihubungkan melalui ikatan alkil,
piperazin, atau fenilena, menunjukkan potensi
yang mirip dengan yang sesuai dengan 5-ROX
konjugasi. Khususnya, regioisomer 49
(Fluorocoxib B,ex = 581 nm, em = 603 nm)
menunjukkan penghambatan COX-2 selektif.27
Namun, konjugat fluoresen 57−64, mengandung
bulkier pewarna rhodamin, menunjukkan potensi
yang jauh lebih rendah atau hilangnya aktivitas
penghambatan COX-2 dengan pengecualian
senyawa 58 (λex = 572 nm, em = 595 nm), yang
618 nm, em = 670 nm), sebuah perklorat
garam,yang diidentifikasi sebagai inhibitor
COX-2 yang buruk (Tabel 3).Hilangnya total
aktivitas penghambatan COX diamati dengan
konjugat Cy5 66. Menariknya, konjugat Cy7 67
menghambat COX-2 dengan potensi yang
buruk, sementara aktivitas penghambatan tetapi
kurangnya selektivitas diamati dengan konjugat
NIR641(68), garam klorida. Tidak ada
penghambatan COX-2 yang signifikan terlihat
dengan konjugat indometasin terkait etil atau
propildiamida dari NIR664, seperti senyawa 69
dan 70,masing-masing. Penghambatan COX
nonselektif diamati dengan konjugat terkait
piperazin 71, garam bagian dalam (zwitterion).
Namun, hilangnya aktivitas COX telah
didokumentasikan dengan homolog alkil yang
lebih tinggi (72, 73). Kerugian serupa adalah
diamati dengan konjugat NIR667 74−78 (garam
klorida).Konjugasi indometasin dengan NIR700,
garam dalam,diberikan inhibitor COX-2 selektif
79 (λex = 710 nm, em = 731 nm), yang
mengandung penghubung n-butildiamida.
Ketika panjang penghubung ditingkatkan,
konjugat 80−81 menunjukkan a hilangnya
aktivitas penghambatan COX-2 secara dramatis.
Menariknya, orang miskin potensi tercapai
ketika n-butyl linker diganti oleh penaut hibrid
fenilena-alkil dalam senyawa 82, dan no
Penghambatan COX-2 diamati dengan NIR782
atau IRDye800 turunan, senyawa 83 dan 84,
masing-masing. Kekurangan serupa aktivitas
diamati dengan DOTA-, Eu-Quinoline(F)-
DOTA-,Eu-Quinoline(CH3)-DOTA-, atau Gd-
DOTA-derivatives (senyawa 85−106), bahkan
pada konsentrasi yang sangat tinggi (Tabel 4).
Jadi, konjugasi indometasin dengan fluorofor
zwitterionic yang ditambatkan melalui penaut n-
butildiamida paling cocok untuk mencapai
aktivitas penghambatan COX-2. Fungsi organik
yang sangat polar kelompok, seperti DOTA,
atau ketoprofen (senyawa 124−139). Namun,
konjugasi analog celecoxib dengan biru nil atau
sulforhodamin (misalnya, 124 dan 125)
menghasilkan penghambatan COX-2 selektif
dengan potensi sedang hingga lemah. Aktivitas
penghambatan COX-2 dari blok bangunan mirip
indometasin atau celecoxib (140−152) adalah
digambarkan pada Tabel 6. Meskipun turunan
dari indometasin dan celecoxib, seperti
iodoindomethacin dan carboxypropionyl
celecoxib, mempertahankan aktivitas
penghambatan COX-2 dari induknya senyawa,
turunan fluoresennya tidak selalu COX-2
inhibitor. Jadi, tidak seperti indometasin induk,
konversi molekul mirip indometasin atau
celecoxib menjadi fluoresen
turunan amida tidak mudah menghasilkan
keluarga yang sangat penghambat COX-2
selektif.
atau pengkelat lantanida analognya, adalah tidak
cocok untuk aktivitas penghambatan COX-2 dari
konjugat.Konjugat Fluoresens dari Aneka
NSAID dan COXIB. Kurangnya selektivitas
isoform atau hilangnya COX-2 aktivitas
penghambatan sering diamati dengan fluorescent
konjugat NSAID dan COXIB selain indometasin
(Tabel 5). Misalnya, iodoindomethacin-5-ROX
konjugat 107 dan 109 tidak menunjukkan
selektivitas COX-2. SEBUAH hilangnya total
aktivitas penghambatan COX diamati dengan
konjugat 5-ROX atau NIR664 108, 110, dan
111. Kami disintesis O-des-metil- atau 2-des-
metil-indometasin-5-ROX konjugasi 112 dan
113, yang selektif COX-2 inhibitor. Namun, 2-
des-metil-, N-des-4-klorobenzoil-,atau N-4-
chlorobenzyl-indomethacin dan konjugat 5- atau
6-ROX 114-117, yang mengandung penghubung
n-butildiamida,tidak menunjukkan
penghambatan COX-2. Hilangnya aktivitas
penghambatan COX-2 juga diamati dengan
turunan fluoresen dari reverse-indomethacin,
118−122. Pengecualian diidentifikasi dengan
konjugat reverseindomethacin-NIR700 (123),
yang menunjukkan penghambatan COX-2
selektif dengan potensi sedang. SEBUAH
hilangnya aktivitas penghambatan COX-2
sepenuhnya diamati dengan mayoritas turunan
fluoresen dari celecoxib, flurbiprofen,
Evaluasi Inhibitor Fluorescent COX-2 dalam
Sel Budaya.Kemampuan turunan fluoresen
untuk menghambat COX-2 dalam sel utuh diuji
dalam makrofag RAW264.7 yang diaktifkan
atau 1483 sel HNSCC menggunakan metode
yang dilaporkan sebelumnya,27 as dijelaskan
secara singkat dalam Prosedur Eksperimental.
Dalam pengujian ini, banyak senyawa fluoresen
yang beragam secara struktural menghambat
COX-2 dalam sel RAW264.7 yang diaktifkan
LPS dengan IC50 nilai dalam kisaran nanomolar
(Tabel 7). Misalnya, IC50 nilai penghambatan
sintesis prostaglandin sebesar 41 dan 58, adalah
0,31 dan 0,34, M, masing-masing. Pada 1483 sel
HNSCC, yang secara konstitutif
mengekspresikan COX-2, senyawa 41 dan 58
mempertahankan aktivitas penghambatan COX-
2 mereka dengan nilai IC50 0,09
dan 0,38 M, masing-masing. Jadi, konjugasi
NSAID,indometasin, dengan fluorofor
zwitterionic, ditambatkan melalui sebuah n-
butydiamide linker memberikan konjugat
fluoresen yang mampu melewati membran sel
untuk menghambatCOX-2 secara efektif.
Pencitraan Sel Optik In Vitro. Kepala manusia
dan garis sel kanker leher, 1483, yang
mengekspresikan tingkat tinggiCOX-2,28
diperlakukan dengan senyawa 58. Setelah
pencucian, sel-sel dicitrakan oleh mikroskop
fluoresensi dan dipamerkan kuat fluoresensi
merah karena akumulasi rhodamin turunan
(Gambar 2A). Preinkubasi sel dengan COX
inhibitor indometasin memblokir penyerapan
dan pelabelan 1483 sel oleh senyawa 58
(Gambar 2B). Hasil ini sesuai dengan yang
dilaporkan sebelumnya untuk senyawa 41.27
Di Vivo Pencitraan Optik Tumor Xenografts.
Kami mengevaluasi kemampuan senyawa 58
untuk menargetkan COX-2 dalam xenograft
tumor manusia. Tikus telanjang bantalan 1483
atau HCT116
tumor xenograft di sayap kiri diberi dosis
intraperitoneal injeksi dengan senyawa 58 (2
mg/kg). Pada 60 menit pasca injeksi, tidak ada
fluoresensi yang diamati pada tumor. Sinyal
terdeteksi di COX-2 yang mengekspresikan
Jadi, ekspresi COX-2 pada tumor 1483
tampaknya diperlukan untuk penyerapan selektif
ini, meskipun faktor lain selain level protein
COX-2 dapat berkontribusi pada pengayaan
relatif atas jaringan kontrol. Hasil ini
mendukung hipotesis bahwa perbedaan dalam
pelabelan 1483 dan xenograft HCT116 adalah
karena perbedaan mereka dalam ekspresi COX-
2, dan menegaskan yang dilaporkan sebelumnya
untuk senyawa 41.27
DISKUSI
Laporan ini menjelaskan studi SAR kami
tentang fluorescent turunan dari NSAID atau
COXIB sebagai COX-2-selektif inhibitor.
Senyawa disiapkan menggunakan strategi
berbasis konjugasi.27 Beberapa, tetapi tidak
semua, turunan fluoresen dari NSAID atau
COXIB, seperti indometasin atau celecoxib,
1483 tumor mulai dari 3 jam (Gambar 3A).
Berbeda dengan penyerapan selektif 58 menjadi
1483 xenografts, serapan minimal diamati pada
3 jam di HCT116 xenografts, tumor usus besar
manusia yang tidak mengekspresikan COX-2,29
Pencitraan ex vivo dilakukan untuk
mengkonfirmasi in vivo hasil pencitraan dan
untuk memverifikasi sinyal tumor 1483 adalah
karena serapan tumor 58, dan bukan dari
jaringan normal di dekatnya atau kulit. Sinyal
fluoresensi cerah terdeteksi di ex vivo 1483
tumor dibandingkan dengan tumor HCT116
(Gambar 3C, D).Pengayaan sinyal 58 di 1483
tumor dibandingkan untuk HCT116 atau otot
kaki kontralateral didirikan menjadi >10:1
(Gambar 3E). Selanjutnya, kami melakukan
COX-2 percobaan pemblokiran menggunakan
indometasin, di mana nude
tikus dengan 1483 xenografts telah diobati
dengan baik DMSO atau indometasin dalam
DMSO (2 mg/kg, intraperitoneal) sebelum dosis
senyawa 58 (2 mg/kg, intraperitoneal). Pada jam
3 setelah injeksi, tikus yang diberi perlakuan
sebelumnya DMSO menunjukkan yang kuat
fluoresensi pada tumor mereka, dibandingkan
dengan sinyal lemah di tumor tikus pra-
perawatan indometasin (SI Gambar S1).
menunjukkan kemampuan untuk menghambat
COX-2 secara selektif. Hal ini sesuai dengan
pengamatan kami bahwa asam karboksilat
nonselektif yang mengandung NSAID dapat
diubah menjadi COXIB dengan mengubahnya
menjadi turunan amida atau ester.30 Fluorofor
yang relatif besar bagian yang mengandung
alkil, aril, aralkil, polietilen glikol, atau ester
heterosiklik atau amida dari indometasin atau
celecoxib menunjukkan aktivitas penghambatan
COX-2. Patut dicatat bahwa, di antara konjugat
fluoresen dari NSAID atau COXIB yang
dievaluasi dalam penelitian ini, hanya turunan
indometasin yang mengikat erat dengan COX-2
tanpa mengikat COX-1. Karena itu,
menambatkan tag fluoresen di situs asam
karboksilat dari indometasin menghasilkan
probe optik yang kuat dan penghambat COX-2
selektif.Situs aktif COX terletak di bagian atas
saluran yang dalam yang berjalan dari domain
pengikatan membran ke katalitik domain.31
Bagian awal saluran memiliki volume yang
besar,disebut lobi, yang menyempit di bagian
atas menjadi penyempitan terdiri dari residu
Arg-120, Tyr-355, dan Glu-524.32 Ini residu
harus membuka dan menutup agar substrat dan
inhibitor untuk masuk atau keluar dari situs aktif
COX, yaitu: terletak di atasnya. Penggunaan
alkil panjang, aril, fenilena,polietilen glikol, atau
rantai heterosiklik memungkinkan fungsi
indometasin untuk sepenuhnya dimasukkan ke
dalam pengikatan kantong COX-2, sedangkan
amida sekunder fluoresen yang besar proyek
kelompok fungsional melalui penyempitan di
pangkalan dari situs aktif dan ke lobi lebar
dalam domain pengikatan membran. Model ini,
yang konsisten dengan struktur kristal kompleks
COX-2 dengan karboksil analog rantai panjang
dari zomepirac,33 membantu menjelaskan
caranya bagian besar seperti 5- dan 6-ROX
dapat dikonjugasikan ke indometasin dengan
retensi aktivitas penghambatan.Evaluasi
sistematis dari sejumlah besar konjugat
dihasilkan dari berbagai macam inti yang
mengandung asam karboksilat molekul,
tambatan, dan fluorofor memberikan beberapa
wawasan utama ke dalam persyaratan struktural
untuk penghambatan selektif COX-2.Misalnya,
hasil menunjukkan bahwa sebagai jumlah gugus
metilen dalam penaut alkil meningkat dari 2
menjadi 4,aktivitas penghambatan konjugat
meningkat secara berurutan mode. Peningkatan
lebih lanjut (n = 5 menjadi n = 14) dalam
metilen kelompok atau penggabungan kelompok
amida tambahan dalam tether membalikkan tren
aktivitas penghambatan, menunjukkan bahwa
penghubung n-butil optimal untuk
penghambatan COX-2 selektif oleh konjugat ini.
Selain itu, aktivitasnya bervariasi tergantung
pada jumlah ikatan amida dalam rantai. Namun,
hibrida penghubung (yaitu, alkil dan PEG atau
alkil dan piperazin) adalah ditoleransi sampai
batas tertentu. Aktivitas konjugat juga
tergantung pada ukuran dan sifat elektronik dari
fluorofor. Fluorofor memiliki berat molekul
<650 tanpa atom bermuatan memberikan
penghambatan COX-2 yang efektif potensi.
Misalnya, kumarin atau dansil fluorofor adalah
tidak bermuatan dan memiliki berat molekul
<650. Indomethacincoumarinylamide (5) adalah
COX-2 . yang sangat kuat dan selektif inhibitor,
dan sebagai fluorofor kumarin digantikan oleh
dansyl fluorofor yang tidak bermuatan, tingkat
selektivitas COX-2 dan potensi konjugat (15)
tetap tidak berubah.Dikontras, fluorofor dengan
berat molekul yang menguntungkan tetapi
mengandung atom bermuatan yang ion-
berpasangan dengan eksternal Ion bermuatan
berlawanan memberikan konjugat indometasin
(misalnya,74-78) yang tidak menghambat
isozim COX. Lebih-lebih lagi,konjugasi garam
trisodium IRDye800 polar atau pengkelat
lantanida polikarboksilat dengan indometasin
menghasilkan inaktif senyawa (85−106).
Menariknya, fluorofor zwitterionic,seperti 5-
atau 6-ROX, terkonjugasi dengan indometasin
melalui n-butyl linker memberikan inhibitor
COX-2 yang selektif dan kuat(misalnya, 41 dan
49). Fluorofor ROX terbukti optimal gugus
fungsi untuk pengikatan COX-2 yang efektif
konjugasi. Meskipun konjugat indometasin dari
dansyl, dabsyl,kumarin, atau fluorofor terkait
menunjukkan COX-2 . yang menjanjikan
penghambatan dalam protein murni dan dalam
sel utuh, mereka tidak memiliki sifat fluoresensi
yang cocok untuk pencitraan in vivo.Di antara
senyawa yang muncul dari pengembangan kami
jalur, hanya konjugat berbasis 5-ROX- dan 6-
ROX (linker= n-Butil) menunjukkan kombinasi
yang diperlukan dari sifat fotofisik dan
penghambatan COX-2 yang efektif potensi.
Seperti yang kami laporkan sebelumnya,27 5-
ROX dan Konjugat 6-ROX (senyawa 41 dan 49)
terlihat bagus menjanjikan sebagai agen
pencitraan in vivo untuk peradangan dan kanker.
Di sini, kami telah memperluas temuan tersebut,
melalui demonstrasi bahwa senyawa 58 juga
menampilkan nilai yang sangat tinggi tingkat
selektivitas penyerapan oleh sel-sel utuh dalam
kultur jaringan dan tumor pada hewan hidup.
Pengiriman selektif senyawa 58 membutuhkan
ekspresi COX-2 di situs target dan adalah tidak
terlihat ketika COX-2 tidak diekspresikan. Jadi,
ini fluorocoxibs mampu menargetkan COX-2
dalam sel utuh dan tumor yang mengekspresikan
COX-2 baik secara in vitro maupun in vivo
pengaturan. Dengan demikian, konversi NSAID
atau COXIB menjadi turunan fluoresen
menyediakan strategi yang mudah untuk
menghasilkan agen pencitraan yang efektif
untuk mendeteksi COX-2 pada tumor prakanker
dan ganas. Juga, strategi yang mudah ini
menyediakan bukti prinsip untuk pengembangan
spesifik COX-2 NSAID atau COXIB−toxin
conjugates (Chemocoxib) memungkinkan
pengiriman selektif agen sitotoksik ke dalam sel
neoplastik untuk pengobatan tumor ganas dan
ganas.
KESIMPULAN
Kami menggambarkan SAR dari serangkaian
agen pencitraan optik terdiri dari kelompok
fungsional fluoresen besar yang ditambatkan ke
NSAID atau COXIB untuk membuat fungsi
ganda fluorescent COX-2 inhibitor. Berbagai
macam konjugat fluoresen adalah disintesis dan
dievaluasi sebagai inhibitor selektif COX-2
terhadap protein murni dan sel kanker manusia
yang mengekspresikan COX-2.Studi SAR
mengungkapkan bahwa konjugat indometasin
mampu inhibitor COX-2 terbaik dibandingkan
dengan konjugat lainnya NSAID atau COXIB
yang mengandung asam karboksilat. Sebuah
empat-karbonn-alkyl linker optimal untuk
konjugasi zwitterionic yang besar fungsi
fluoresen, seperti ROX, untuk memberikan yang
terbaik keseimbangan antara selektivitas dan
potensi pengikatan COX-2.Fluorofor yang
merupakan garam logam atau halida, seperti
IRDye800 atau NIR667, atau fungsional yang
mengandung asam polikarboksilat organik
kelompok yang sangat polar, seperti chelator
lantanida, tidak cocok untuk mengembangkan
agen pencitraan bertarget COX-2.
telah dilisensikan dan senyawa sedang
dipasarkan untuk digunakan dalam percobaan
praklinis.
UCAPAN TERIMA KASIH
Pekerjaan ini didukung oleh hibah penelitian
dari National Institut Kesehatan (CA136465,
CA128323, CA89450). Kami berterima kasih
kepada H. Charles Manning atas bantuannya
dengan sintesis chelator lantanida dan Carol
Rouzer untuk kritis membaca dan mengedit
naskah ini.
SINGKATAN
COX, siklooksigenase; SAR, hubungan struktur-
aktivitas;NSAID, obat antiinflamasi nonsteroid;
COXIB, COX-2-penghambat selektif; DMEM,
Elang Modifikasi Dulbecco Sedang; HNSCC,
karsinoma sel skuamosa kepala dan leher;Dewan
Komisaris, tert-butoksikarbonil; PEG, polietilen
glikol; NIR,dekat inframerah; DOTA, 1,4,7,10-
tetraazacyclododecane-1,4,7,10-asam tetraasetat;
ROX, karboksi-X-rhodamin

KONTEN TERKAIT
*S Informasi Pendukung
Prosedur sintetik lengkap dan data karakterisasi
analitis dan spektral senyawa yang disintesis.
bahan ini adalahtersedia gratis melalui Internet
di http://pubs.acs.org.

INFORMASI PENULIS
Penulis yang sesuai
*Telepon: 615-343-7329. Faks: 615-343-7534.
Email: larry.marnett@vanderbilt.edu.

Catatan
Para penulis menyatakan keuangan bersaing
berikut: minat: Drs. Uddin, Crews, dan Marnett
adalah penemu di paten yang menjelaskan
sintesis pencitraan bertarget COX-2 agen. Paten