TUGAS PENGEMBANGAN OBAT

“Skrining Afinitas Surface Plasmon Resonance (SPR) dan Scintillation

Proximity Assay (SPA)”

Oleh :

Desmana Mei Yuliyati

R212110314

PROGRAM STUDI PASCA SARJANA

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SETIA BUDI
SURAKARTA
2022
 Ultrasound-enhanced scintillation proximity assay for rapid diagnostics (SPA)

1.1 Pendahuluan
Alat tes cepat dan akurat sangat diinginkan untuk mendeteksi biomarker yang terkait dengan
pertumbuhan penyakit yang ganas. Immunoassays menggunakan antibodi yang sangat
spesifik untuk menargetkan biomarker dan mengukur konsentrasinya dalam sampel yang
kompleks. Secara tradisional immunoassay yang paling sensitif adalah radioimmunoassay
yang dapat mengukur konsentrasi nano dan pico molar dari antigen spesifik
dalam cairan biologis.
Scintillation proximity assay (SPA) menandai perkembangan yang signifikan dalam
radioimmunoassay. Dapat diuji tanpa langkah pemisahan dan tanpa menggunakan koktail
cair konvensional. Secara singkat, pembentukan radiolabeled antigen (Ag)-antibodi (Ab),
menghasilkan emisi foton. Ag bebas dalam fluida juga akan terikat secara kompetitif
dengan Ab pada bead tanpa menyebabkan eksitasi yang berarti. Secara umum, panjang jalur
pendek radioisotop (RI).
SPA dikembangkan untuk mendapatkan pengujian yang sederhana dan lebih cepat.
Pengaruh ultrasound pada kinetika interaksi Ag-Ab telah dibuktikan. Penjelasan yang paling
mungkin untuk pengaruh ultrasound adalah bahwa ia mempercepat perpindahan massa antara
fase cair dan padat dengan cara megurangi ketebalan lapisan pelarut yang tidak diaduk.
Namun, pengaruh USG pada pembentukan radiolabeled Ag-Ab di SPA belum dilakukan
penelitian
1.2 Alat dan bahan
Protein CD55, antibody CD55, manik SPA
1.3 Prosedur pengujian
1.3.1 Penyiapan SPA
Radiolabeled IgG (125I-IgG) disintesis oleh protokol iodogen. IgG tikus (50 g) dan
0,5 mCi ditambahkan ke tabung iodogen dan diinkubasi selama 30 menit pada
suhu kamar. Supernatan kemudian dipindahkan ke tabung reaksi baru dan dilakukan
kemurnian radiokimia125I-IgG diukur dengan kromatografi lapis tipis instan (iTLC). IgG
diencerkan ke dalam buffer uji yang mengandung PBS dengan 0,2% Bovine serum albumin
(BSA). Volume akhir 0,4 ml ditambahkan ke dalam botol kaca. Setelah 0, 6, dan setelah 16
jam botol uji dilakukan perhitungan.
1.3.2 Prosedur SPA dengan ultrasound (UE-SPA)
Sampel dari igG tikus ditambahka ke botol kaca lalu diletakka di bak pembersih
ultrasonik selama 5 menit kemudian dihitung pada LSC dengan berbagai macam waktu uji
coba

1.3.3 Isolasi protein

Karsinoma usus besar dan bagian jaringan normal yang tertanam dalam parafin,
dipasang pada slide kaca standar, dan disimpan pada suhu 4 ° C sampai digunakan. Untuk
menghilangkan parafin, masing-masing bagian dicelupkan ke dalam dua kali pergantian
xylene selama 5 menit, diikuti dengan dehidrasi dalam etanol gradien 100, 95, 70, 50, dan
0% etanol dalam, air masing-masing selama 3 menit. Bagian jaringan yang telah
dideparafinisasi dimasukkan ke dalam tabung sentrifus mikro 1,5 ml yang berisi 50 l 20 mM
buffer Tris-HCl (pH 8,0) dengan 2% natrium dodesil sulfat (SDS), dipanaskan dalam
penangas air 100 °C selama 20 menit, dan dimasukkan ke dalam oven 60 °C selama 2 jam.
Ekstrak protein dari setiap bagian jaringan dengan cepat dan mudah dihilangkan garamnya,
dan buffer ditukar dengan PBS oleh kolom penghilang. Protein total dalam ekstrak diukur
dengan absorbansi pada 280 nm. BSA digunakan sebagai protein standar.

1.4 Hasil dan diskusi

SPA digunakan untuk mendeteksi efek ultrasound. Energi tersebut mengurangi
ketebalan lapisan pelarut yang tidak diaduk sehingga membatasi difusi dan transportasi
massa melintasi antarmuka cair/padat . Iradiasi ultrasonik pada berbagai rentang daya telah
digunakan untuk meningkatkan tingkat pengikatan antigen (Ag)-antibodi (Ab) dalam banyak
immunoassay fase padat. Misalnya, pada penelitian Chen dkk menjelaskan bahwa efek USG
pada kinetika interaksi Ag-Ab dalam immunoassay enzim choriogonadotropin, dan Zhao
dkk. Mempelajari penggunaan ultrasound untuk meningkatkan produksi mAb dalam sel
CHO. Namun, pengaruh USG pada SPA umum belum pernah dipelajari sebelumnya dan
menjadi subjek penelitian ini.
SPA dilengkapi dengan ultrasound dengan menggunakan sampel SPA selama 5 menit
dalam penangas air ultrasound untuk inkubasi. Pada SPA yang umum, diperlukan inkubasi
lebih dari 4 jam. Teknik UE-SPA yang dijelaskan diberikan untuk referensi saja dan mungkin
memerlukan pengoptimalan bila diterapkan dalam pengujian yang berbeda. Dalam kurva
standar, kemiringan yang lebih besar menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi. Akibatnya,
SPA yang ditingkatkan dengan ultrasound menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi
daripada SPA umum pada berbagai konsentrasi. Selanjutnya, sampel dapat diuji dan
dianalisis secara langsung dalam 5 menit tanpa tambahan waktu inkubasi dan langkah
pemisahan.
General SPA memiliki keunggulan yang jelas di bidang persiapan dan pemisahan
sampel, dan UE-SPA pada akhirnya meningkatkan bidang ini dengan meminimalkan total
waktu pemrosesan. Untuk lebih menunjukkan kemampuan UE-SPA yang dikembangkan,
korelasi antara ekspresi CD55 dan diferensiasi tumor dinilai dengan slide jaringan manusia.
CD55, faktor pembusukan-mempercepat (DAF), adalah protein berlabuh
glikosilfosfatidilinositol yang memainkan peran penting dalam sistem komplemen, tetapi
juga secara luas diekspresikan pada tumor ganas.
Sistem komplemen merupakan bagian dari mekanisme imun bawaan untuk melindungi
pejamu dari patogen termasuk kanker. komplemen, beberapa sel kanker diketahui
mengekspresikan CD55, seperti kanker kolorektal, metastasis karsinoma kolorektal, kanker
lambung, kanker tiroid, kanker ginjal, kanker payudara, glioma ganas, kanker paru-paru
nonsel kecil, kanker ovarium dan kanker serviks dan garis sel yang berasal dari tumor
tersebut. Berdasarkan ekspresi CD55 yang sering pada tumor ganas manusia, tampaknya
menjadi penanda yang menarik untuk diagnostik kanker. Durrant et al., melaporkan bahwa
CD55 adalah penanda agresi untuk memprediksi Dalam penelitian ini, kami mengukur
konsentrasi CD55 di berbagai tingkat usus besar, kanker dubur dan metastasis jaringan
karsinoma kolorektal menggunakan UE-SPA.
Diferensiasi tumor menentukan tingkat kanker, yang didasarkan pada seberapa
abnormal jaringan/sel terlihat di bawah mikroskop. Sampel yang berdiferensiasi baik,
sedang, dan buruk masing-masing menunjukkan tingkat kanker yang rendah, sedang dan
tinggi. Lebih jauh lagi, kanker yang berdiferensiasi buruk atau lebih tinggi cenderung lebih
agresif, tumbuh dan menyebar lebih cepat. Kanker usus besar biasanya diklasifikasikan juga,
berdiferensiasi sedang atau buruk. Namun, terkadang kanker usus besar dibagi menjadi 2
derajat rendah dan tinggi (berdiferensiasi baik dan sedang). Untuk pengujian ini, kami
menyiapkan ekstrak protein dari slide jaringan formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE).
Fiksasi formalin denganpenyisipan parafin adalah metode universal untuk pengawetan
jaringan. Kami melakukan ekstraksi protein dari bagian jaringan FFPE mengikuti
protokol yang dioptimalkan berdasarkan teknik pengambilan antigen yang diinduksi panas.
Penelitian ini menunjukkan bahwa konsentrasi CD55 meningkat secara signifikan
pada tingkat yang lebih tinggi dari tumor usus besar dan rectum termasuk metastasis
karsinoma kolorektal. Dengan demikian, kami menunjukkan korelasi yang signifikan antara
ekspresi CD55 dan tumorigenesis kanker usus besar dan rektum menggunakan UE-SPA.
Sebagai kesimpulan, kami mengembangkan uji kedekatan kilau yang ditingkatkan ultrasound
(UE-SPA) dan menunjukkan efek yang ditingkatkan dari teknik ini pada pengikatan antigen
radiolabeled ke antibodi manikmanik yang gemilang. Untuk mendemonstrasikan penerapan
UE-SPA, deteksi CD55 di berbagai tingkat jaringan tumor dilakukan.
Teknik ini adalah metode yang dapat digunakan untuk menentukan korelasi yang
signifikan antara ekspresi CD55 dan tumorigenesis kanker usus besar dan rektum. Di UE-
SPA, sensitivitas tinggi dan jangkauan luas yang dapat dideteksi dapat berhasil dicapai.
Teknik UE-SPA yang dikembangkan tidak memerlukan waktu inkubasi untuk mencapai
keseimbangan pengikatan Ag-Ab, dan cocok untuk sistem imunodiagnos di bidang RIA dan
SPA otomatis klinis. Pekerjaan di masa depan harus difokuskan pada pemanfaatan UE-SPA
sehingga menunjukkan manfaat SE-SPA.