Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.

com

Biosci. Bioteknologi. Biokimia.,77 (2), 235–242, 2013

Induksi Apoptosis oleh Fucoidan dengan Berat Molekul Rendah melalui

Jalur Mitokondria yang Bergantung Kalsium dan Caspase pada Sel
Kanker Payudara MDA-MB-231

Zhongyuan ZMENGGANTUNG,1Kiichiro TERUYA,1;2;yHiroshi EKE,3dan Sanetaka SHIRAHATA1;2

1Sekolah Pascasarjana Ilmu Bioresource dan Bioenvironmental, Universitas Kyushu,

6-10-1 Hakozaki, Higashi-ku, Fukuoka 812-8581, Jepang

2Fakultas Pertanian, Universitas Kyushu, 6-10-1 Hakozaki, Higashi-ku, Fukuoka 812-8581, Jepang

3Daiichi Sangyo Co., Ltd., 6-7-2 Nishitenman, Kita-ku, Osaka 530-0037, Jepang

Diterima 13 Agustus 2012; Diterima 24 Oktober 2012; Publikasi Daring, 7 Februari 2013
[doi:10.1271/bbb.120631]

Fucoidan, polisakarida kaya fucose yang diekstraksi dari
rumput laut coklat, memiliki aktivitas antitumor,
antikoagulan, antivirus, antiinflamasi, dan antibakteri.
Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa pengobatan
fucoidan sel kanker menginduksi sitotoksisitas dan
apoptosis serta menghambat angiogenesis dan invasi. Kami
menyelidiki dalam penelitian ini efek fukoidan berat molekul
rendah (LMWF) pada apoptosis pada sel kanker payudara
manusia reseptor estrogen negatif MDA-MB-231.
Pengobatan LMWF sel MDA-MB-231 dikaitkan dengan
aktivasi caspases dan disfungsi mitokondria, termasuk
disipasi potensial membran mitokondria (--m), perubahan Ca
2thhomeostasis, sitokromcpelepasan, dan penurunan
ekspresi protein keluarga Bcl-2 antiapoptosis. Memahami
peristiwa molekuler yang memediasi kematian sel MDA-
MB-231 yang diinduksi LMWF akan berkontribusi pada
pendekatan yang lebih rasional untuk kemoterapi kanker.
Kata kunci:ekstrak fukoidan dengan berat molekul rendah;
apoptosis; kalsium; mitokondria; sel kanker
payudara
Senyawa alami telah menarik banyak perhatian
sebagai agen pencegahan dan terapi kanker dalam
beberapa tahun terakhir. Sejumlah senyawa alami
dengan mekanisme kerja yang unik telah diidentifikasi
dan diuji dalam uji klinis. Vincristine, irinotecan,
etoposide, dan paclitaxel adalah contoh klasik senyawa
turunan tanaman yang telah dikembangkan sebagai
agen antikanker yang aktif secara klinis. Actinomycin D,
mitomycin C, bleomycin, doxorubicin, danL-asparaginase
adalah obat yang berasal dari sumber mikroba, dan
salinosporamide A, saliniketal A dan B, marinomisin A
dan rekan monomernya, dan sitarabin semuanya berasal
dari sumber laut.1,2)Bawang putih, biji kunyit (curcumin),
dan dedak gandum adalah contoh makanan fungsional
yang dikonsumsi sebagai bagian dari makanan normal
dan telah ditemukan memiliki efek perlindungan
terhadap berbagai jenis kanker, di luar fungsi nutrisi
dasarnya. Itu menjadi semakin jelas
bahwa agen alami memperlambat atau mencegah proses
karsinogenesis melalui tiga mekanisme utama: mempromosikan
apoptosis secara selektif pada sel kanker, mengganggu siklus
sel, dan menghambat angiogenesis dan metastasis.3)
Fucoidan adalah polisakarida sulfat alami yang diisolasi
dari ganggang coklat dan sebagian besar terdiri dariL-fukosa
dan sulfat, dengan sejumlah kecil galaktosa, xilosa, asam
uronat, dan manosa. Fucoidans yang diisolasi dari spesies
alga yang berbeda telah dipelajari secara ekstensif karena
beragam aktivitas biologisnya yang meliputi sifat
antikoagulan, antivirus, antitumor, antiinflamasi, dan
antitrombotik.4–6)Fucoidans telah dipelajari selama beberapa
tahun sebagai agen untuk pengobatan pencegahan kanker.
Fucoidan telah menekan pertumbuhan sel tumor dan
metastasis dan menghambat angiogenesis pada model
hewan.7–10)Studi klinis telah menunjukkan bahwa pemberian
fucoidan oral kepada pasien kanker secara signifikan
meningkatkan kualitas hidup mereka dan menyebabkan
remisi sebagian atau seluruhnya dari kanker mereka.11)
Selain itu, fucoidan telah ditemukan untuk meningkatkan
respon imun bawaan dan adaptif inang dan untuk
meningkatkan produksi interferon-- dan interleukin-12.7,12,13)
Fucoidan tidak beracun pada tikus bila diberikan pada
300mg/kg berat badan per hari.14)Selain itu, tidak ada
toksisitas terhadap subyek manusia terlihat dari pemberian
oral fucoidan pada 3 g/hari selama 12 hari.12,15)
Fucoidans dapat diekstraksi dan dimurnikan dari rumput laut
dengan sejumlah proses multi langkah yang melibatkan
perawatan kimia, fisik, dan enzimatik. Spesies alga coklat
individu yang mengalami metode ekstraksi dan pemurnian yang
berbeda dapat menghasilkan fukoidan yang berbeda, masing-
masing dengan komposisi, struktur, dan berat molekul yang
berbeda. Efek farmakologis fukoidan bervariasi dengan berat
molekulnya, yang umumnya diklasifikasikan sebagai rendah
(<10 kDa), sedang (10–10.000 kDa), atau tinggi (>10.000 kDa).16)
Fukoidan dengan berat molekul rendah (LMWF) lebih larut
dalam air daripada yang lain; ini mempengaruhi penyerapan
merekain vivodan dengan demikian, bioavailabilitas mereka.17–
20)Telah dilaporkan bahwa polimer fukoidan dengan berat
molekul mulai dari sekitar 10 hingga 300 kDa memiliki
antikoagulan paling kuat.

yKepada siapa korespondensi harus ditujukan. Faks: +81-92-642-3047; E-mail: kteruya@grt.kyushu-u.ac.jp

Singkatan:AIF, faktor penginduksi apoptosis; BAPTA, 2,20-(etilenabisoksi)bis[N,N-bis(asetoksimetoksikarbonilmetil)anilin]; ER, reseptor estrogen;
HBSS, larutan garam buffer Hank; LMWF, fucoidan dengan berat molekul rendah; --m, potensi membran mitokondria; MTT, 3-(4,5- dimetil-2-
tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolium bromida; PARP, poli(ADP-ribosa)polimerase; PBS, salin buffer fosfat; PI, propidium iodida; Rh123, rhodamin 123;
STS, staurosporin
236
aktivitas.21)Selanjutnya, Laguet al.22)telah melaporkan
bahwa LMWF (5 kDa) dari sporofilUndaria pinnatifida
tidak menunjukkan bukti genotoksisitas dalam mutasi
terbalik, penyimpangan kromosom, dan uji
mikronukleus tikus. Sepengetahuan kami, efek LMWF
pada pertumbuhan sel kanker dan mekanisme aksi
yang mendasarinya belum diteliti. Kami telah
memperluas studi kami sebelumnya di sini untuk
menguji efek LMWF yang dicerna abalon glikosidase
pada pertumbuhan sel kanker, dan mengevaluasi
potensi mekanisme aksi molekuler.
Kanker payudara menyumbang sekitar 23% (1,38 juta) dari
semua kasus kanker wanita baru dan 14% (458.400) dari total
kematian terkait kanker wanita, menjadikannya keganasan yang
paling sering didiagnosis dan penyebab utama kematian akibat
kanker pada wanita di seluruh dunia. .23–26)Kanker payudara saat
ini dikendalikan dengan menggunakan operasi dan radioterapi,
sering didukung oleh terapi hormon tambahan atau kemoterapi.
Agen kemoterapi seperti tamoxifen, toremifene, dan fulvestrant
secara rutin digunakan dalam pengobatan kanker payudara.
Salah satu tantangan pengobatan kanker payudara adalah
ketahanannya terhadap radiasi dan kemoterapi, yang dikaitkan
dengan prognosis yang buruk, terutama pada kanker yang tidak
tergantung hormon.27–29)Selain itu, banyak agen pencegah
kanker dan kemoterapi menyebabkan efek samping yang tidak
diinginkan. Oleh karena itu ada kebutuhan mendesak untuk
pengembangan agen yang aman dan efektif untuk mencegah
dan mengobati kanker payudara.
Studi kami sebelumnya telah menunjukkan efek
penghambatan pertumbuhan LMWF pada garis sel
karsinoma manusia, MCF-7 (reseptor estrogen [ER]-positif),
MDA-MB-231 (ER-negatif), HeLa, dan HT1080.30)Kami telah
menyajikan bukti bahwa LMWF menginduksi jalur apoptosis
yang dimediasi caspaseindependent, mitokondria dalam sel
MCF-7 ER-positif. Apoptosis yang diinduksi LMWF dalam sel-
sel ini terjadimelaluipeningkatan depolarisasi mitokondria,
regulasi protein Bcl-2, dan pelepasan sitokromcdan faktor
penginduksi apoptosis (AIF). Tujuan utama dari pekerjaan ini
adalah untuk menentukan mekanisme penghambatan
pertumbuhan yang diinduksi LMWF dalam sel MDA-MB-231
ER-negatif. Kami menunjukkan bahwa LMWF menghambat
pertumbuhan sel dan menginduksi apoptosis pada sel-sel
ini, sebagaimana dinilai dari morfologi sel, fragmentasi
nuklir, Ca2thdisfungsi mitokondria yang tergantung, dan
aktivasi beberapa caspases.
Bahan dan metode
Budaya sel.Sel MDA-MB-231 diperoleh dari American Type Culture
Collection (Manassas, VA, USA). Sel-sel dipertahankan dalam medium
Eagle's Dulbecco yang dimodifikasi yang dilengkapi dengan 10%
serum janin sapi pada 37-C dalam 5% CO yang dilembabkan2
suasana.
Bahan.LMWF yang digunakan dalam penelitian ini disajikan dengan murah
hati oleh Daiichi Sangyo Corporation (Osaka, Jepang) dan disiapkan seperti yang
dijelaskan sebelumnya.31)Secara singkat, ekstrak fucoidan dengan berat molekul
tinggi dimurnikan hingga 85% dari rumput lautCladosiphon navae-caledoniae
Kylin, lalu dicerna dengan glikosidase untuk mendapatkan LMWF. LMWF terdiri
dari fraksi berat molekul rendah yang dicerna (72%, <500 MW) dan fraksi yang
tidak dicerna (kurang dari 28%, 800 kDa puncak MW). LMWF sebagian besar
terdiri dari fucose (73%), xylose (12%) dan mannose (7%). Rasio sulfasi adalah
14,5%. 3-(4,5-Dimetil-2-tiazolil)- 2,5-difenil-2H-tetrazolium bromida (MTT),
propidium iodida (PI),
Z.ZMENGGANTUNGet al.
2-bis(2-aminofenoksi)etana-N, N, N0,N0-tetraacetic acid tetrakis
(acetoxymethyl ester) (BAPTA-AM) dan E-64d dibeli dari Wako
Pure Chemical Industries (Osaka, Jepang). Rhodamine 123
(Rh123) dan Pewarnaan Sel--Hoechst 33342 diperoleh dari
Dojindo Laboratories (Kumamoto, Jepang), dan kit apoptosis
annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) diperoleh dari
Medical and Biological Laboratories Co. (Nagoya, Jepang). Fluo-4
AM diperoleh dari Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), dan ionomycin
dibeli dari Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Inhibitor
caspase non-spesifik Z-VAD-fmk dibeli dari Promega (Madison,
WI, USA), dan inhibitor Z-LEHD-fmk caspase-9 dibeli dari BD
Biosciences (San Diego, CA, USA). Semua antibodi yang
digunakan dalam penelitian ini dibeli dari Cell Signaling
Technology (Danvers, MA, USA).
Uji viabilitas sel.Sel diunggulkan di1 - 103sel/sumur pada pelat 96-
sumur dan dikultur pada 37-C selama 24 jam. Sel-sel kemudian
diperlakukan dengan konsentrasi LMWF yang ditunjukkan untuk berbagai
waktu. Pada akhir inkubasi, 10mL MTT (5mg/mL) ditambahkan ke masing-
masing sumur selama 4 jam, dan produk formazan yang tidak larut dibuat
larut dengan menambahkan dimetil sulfoksida. Intensitas warna larutan
formazan diukur pada 595 nm dengan menggunakan pembaca pelat
mikro (Grup Tecan, Männedorf, Swiss).
pewarnaan Hoechst.Sel diperlakukan dengan LMWF selama 48 jam,
dicuci dengan phosphate-buffered saline (PBS), dan diwarnai dengan 2mg/
mL Hoechst 33342 selama 15 menit. Sel-sel dicuci lagi dengan PBS, dan
morfologi sel divisualisasikan dengan menggunakan IN Cell Analyzer 1000
(GE Healthcare UK, Buckinghamshire, UK) dengan filter eksitasi/emisi
360/485 nm. Setiap gambar yang ditampilkan mewakili 20 bidang acak
yang diamati.
Uji pengikatan Annexin V.Apoptosis sel diukur dengan menggunakan
uji pengikat annexin V berlabel FITC. Sel-sel diunggulkan dalam piring 96-
sumur dan diperlakukan dengan 82, 410, atau 820mg/mL LMWF untuk
waktu yang ditunjukkan. Sel-sel kemudian dicuci dengan PBS dan diwarnai
selama 15 menit dalam gelap dengan larutan annexin V-FITC dalam buffer
yang mengandung PI dan Hoechst 33342. Gambar sel-sel apoptosis
diperoleh dengan menggunakan IN Cell Analyzer 1000. Sel-sel dengan inti
apoptosis morfologi (kondensasi/fragmentasi) dan sel annexin V-positif
(kedua sel annexin V-positif/PI-negatif dan annexin V-positif/PI-positif)
dianalisis dengan menggunakan perangkat lunak Developer Toolbox (GE
Healthcare). Gambar 3.000 sel direkam untuk setiap analisis.
Pengukuran konsentrasi kalsium intraseluler.Sel MDA-MB-231
dicuci dua kali dalam larutan garam buffer Hank (HBSS; 140mM
NaCl, 5mMKCl, 2,5mMMgCl2, 2mMCaCl2, 10mM
HEPES, 10mMglukosa, pH 7,4), kemudian diinkubasi pada suhu 37-C
selama 30 menit dalam HBSS yang mengandung 2mMFluo-4AM. Sel-sel
dicuci dua kali dengan HBSS dan diobati dengan ionomycin atau LMWF
untuk waktu yang ditentukan. Perubahan fluoresensi Fluo-4AM terdeteksi
oleh mikroskop confocal (Olympus, Tokyo, Jepang) dan flow cytometry
(Beckman Coulter, Brea, CA, USA).
analisis noda barat.Setelah perawatan dengan reagen yang
ditunjukkan, sel dikumpulkan dan disuspensikan kembali dalam buffer lisis
(50mMTris–HCl, 150mMNaCl, 2mMEDTA, 1% Nonidet P-40, 50mMNaF, 1mM
Na3VO4, dan koktail penghambat protease). Fraksi mitokondria dan sitosol
dipisahkan dengan menggunakan kit fraksinasi mitokondria/sitosol sesuai
dengan protokol pabrik (BioVision). Konsentrasi protein dari fraksi yang
dihasilkan ditentukan dengan menggunakan reagen uji protein Bradford.
Sampel yang mengandung jumlah protein yang sama diselesaikan dengan
elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida. Protein
dipindahkan ke membran PVDF (GE Healthcare), dan membran diblokir
selama 1 jam pada suhu kamar dalam salin buffer Tris yang mengandung
0,1% Tween-20 dan 5% susu kering tanpa lemak. Membran kemudian
diinkubasi pada 4-C semalam dengan antibodi primer yang sesuai.
Membran kemudian dicuci tiga kali dan diinkubasi dengan antibodi
sekunder terkonjugasi peroksidase horseradish pada suhu kamar selama
1 jam. Pita protein divisualisasikan dengan menggunakan
chemiluminescence yang disempurnakan seperti yang dijelaskan oleh
pemasok (GE Healthcare).
 Induksi Fucoidan dari Apoptosis dalam Sel MDA-MB-231
SEBUAH
C
Pengukuran potensial membran mitokondria.Efek LMWF pada potensi
membran mitokondria (-m) sel MDA-MB-231 ditentukan dengan
pewarnaan dengan Rh123, PI, dan Hoechst 33342. Gangguan --m
dikaitkan dengan penurunan retensi Rh123 dan penurunan bersamaan
dalam fluoresensi. Sel MDA-MB-231 diobati dengan LMWF untuk waktu
yang ditentukan, dicuci dua kali dengan PBS, dan diinkubasi dengan 1mM
dari Rh123 dan 2mg/mL Hoechst 33342 pada 37-C selama 30 menit.
Setelah dibilas dua kali dengan PBS, sel diinkubasi dengan 10mg/mL PI
selama 5 menit. Sel-sel dianalisis, dan gambar diperoleh dengan IN Cell
Analyzer 1000. Sel-sel yang menunjukkan fluoresensi Rh123 lebih rendah
daripada sel kontrol yang tidak diobati dianggap telah berkurang --m.
Analisis gambar dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak IN Cell
Investigator dengan Developer Toolbox atau Multi-Target Analysis Module
(GE Healthcare). Gambar 3.000 sel direkam untuk setiap analisis.
Transfeksi sel.Sel MDA-MB-231 diunggulkan2 - 105sel/sumur dalam
pelat 6-sumur dan dibiarkan tumbuh selama 24 jam hingga pertemuan
50%. Transfeksi dilakukan dengan menggunakan HilyMax (Dojindo) sesuai
dengan protokol pabrikan. Secara singkat, sel-sel tersebut ditransfusikan
dengan plasmid ekspresi pCMV-bcl-2 yang mengkode Bcl-2 manusia dan
gen resistensi neomisin. Setelah transfeksi, G418 (1mg/mL) ditambahkan
ke media kultur untuk memilih transfectants produktif. Media yang
mengandung 1 mg/mL G418 diganti setiap 3 atau 4 hari selama 2 minggu.
Sel-sel yang tahan G418 dikumpulkan untuk percobaan selanjutnya. Sel
MDA-MB-231 yang ditransfeksi dengan vektor pRc/CMV kosong (MDA-
MB-231/Vec) digunakan sebagai kontrol.
Analisis statistik.Eksperimen dilakukan setidaknya dalam rangkap
tiga, dan hasilnya dinyatakan sebagairata-rata - standar deviasi (SD).
Perbedaan antara dua kelompok dianalisis oleh Student's 2-tailedt-
tes, dan antara 3 atau lebih kelompok dianalisis dengan analisis
varians satu arah dengan beberapa perbandingan.
Hasil
LMWF menginduksi penghambatan pertumbuhan dan apoptosis
pada sel MDA-MB-231
Efek konsentrasi LMWF yang berbeda pada
viabilitas sel MDA-MB-231 diperiksa dengan uji MTT
selama 72 jam (Gbr. 1A). Kami mengamati penurunan
viabilitas sel pada konsentrasi antara 82 dan 1640mg/
mL LMWF. Analisis pewarnaan Hoechst
237
B
Gambar 1.Pengaruh Low-Molecular-Weight Fucoidan (LMWF) pada
Pertumbuhan dan Viabilitas Sel MDA-MB-231.
A, Proliferasi sel dianalisis dengan menggunakan uji MTT
setelah diobati dengan dosis LMWF yang berbeda untuk waktu
yang ditunjukkan (n¼6).Hasilnya adalahberarti - SDdari 3
percobaan independen. B, inti Apoptosis terdeteksi dalam sel
bernoda Hoechst (perbesaran 100-asli) setelah perawatan
dengan 820mg/mL LMWF selama 48 jam. C, Analisis sel-sel
apoptosis dengan pewarnaan ganda annexin V/propidium iodide.
Sel MDA-MB-231 dirawat untuk waktu yang ditunjukkan dengan
dosis LMWF yang berbeda.p <0:05;p <0:01.
sel menunjukkan bahwa pengobatan LMWF telah
menyebabkan penyusutan dan fragmentasi nuklir,
menunjukkan bahwa efek sitotoksik LMWF pada sel MDA-
MB-231 dimediasi melalui induksi apoptosis (Gbr. 1B).
Temuan ini dikonfirmasi dengan uji apoptosis annexin / PI
(Gbr. 1C) yang menunjukkan bahwa LMWF menginduksi
peningkatan waktu dan dosis yang bergantung pada
persentase sel apoptosis.
LMWF menginduksi disfungsi mitokondria dalam sel
MDA-MB-231
Mitokondria adalah titik kontrol pusat apoptosis.
Untuk menentukan apakah LMWF akan menginduksi
apoptosis melalui jalur mitokondria dalam sel MDA-
MB-231, pertama-tama kami memeriksa sitokromc
dilepaskan oleh Western blotting dari ekstrak sel yang
difraksionasi. Gambar 2A menunjukkan sitokrom ituc
dilepaskan dari mitokondria dan terakumulasi dalam
sitosol sel yang diobati dengan LMWF secara tergantung
waktu. Sejak sitokromcrilis telah dikaitkan dengan
hilangnya --m, kami selanjutnya menyelidiki efek LMWF
pada --m dengan mengukur hilangnya fluoresensi dalam
sel berlabel Rh123. Gambar 2B menunjukkan bahwa
LMWF menyebabkan penurunan --m dalam sel MDA-
MB-231, sebagaimana terbukti dari penurunan
persentase sel dengan intensitas fluoresensi tinggi.
Kami selanjutnya mengukur ekspresi beberapa protein
keluarga Bcl-2 antiapoptosis dengan Western blotting
setelah pengobatan LMWF sel MDA-MB-231 dan
menemukan penurunan waktu tergantung pada ekspresi
Bcl-2, Mcl-1, dan Bcl-xl (Gbr. 3A). Untuk menentukan apakah
apoptosis yang diinduksi LMWF dapat diblokir oleh ekspresi
berlebih dari Bcl-2, kami membuat garis sel kontrol (MDA-
MB-231/Vec) dan Bcl-2–overexpressing (MDA-MB-231/Bcl-2)
( Gambar 3B) dan merawatnya dengan LMWF. Kami
menemukan bahwa apoptosis yang diinduksi LMWF lebih
sedikit pada sel MDA-MB-231/Bcl-2 dibandingkan pada
kontrol MDA-MB-231/Vec (Gbr. 3C).
238 Z.ZMENGGANTUNGet al.

LMWF meningkatkan konsentrasi kalsium intraseluler dan
pembelahan spektrin
Ketidakseimbangan dalam Ca intraseluler2thkonsentrasi dapat
sitotoksik ke sel dan menginduksi baik kematian sel apoptosis
atau nekrotik.32)Untuk menyelidiki apakah LMWF mengganggu
Ca2thkompartementalisasi dalam sel MDA-MB-231, kami
menggunakan Fluo-4 Ca2thPewarna fluoresen yang sensitif
untuk mendeteksi perubahan Ca intraseluler2thtingkat. Gambar
4A menunjukkan bahwa pengobatan dengan LMWF
meningkatkan Ca intraseluler2thtingkat dalam sel MDA-MB-231.
Hasil ini dikonfirmasi oleh analisis aliran cytometric yang
menunjukkan bahwa pengobatan dengan LMWF selama 3 jam
secara signifikan meningkatkan Ca2+ intraseluler.2thtingkat (Gbr.
4B). Pretreatment dengan 10mMBAPTA-AM, Ca2th
chelator, secara efektif melemahkan peningkatan
fluoresensi Fluo-4 bila dibandingkan dengan sel yang diobati
dengan LMWF saja, menunjukkan bahwa efek sitotoksik dari
SEBUAH
LMWF melibatkan perubahan Ca intraseluler2thtingkat
(Gbr. 4A).
Kami selanjutnya menyelidiki peran calpain, protease sistein
yang bergantung pada kalsium, dalam apoptosis yang diinduksi
LMWF. Gambar 5A menunjukkan bahwa E-64d calpain inhibitor
memblokir sebagian apoptosis yang diinduksi LMWF, yang
diukur dengan pewarnaan ganda annexin V/PI (Gambar 5A).
Satu substrat calpain adalah protein 280 kDa, --spectrin, yang
dibelah untuk menghasilkan fragmen 150/145 kDa, dan juga
dapat dibelah dengan caspase-3 untuk menghasilkan fragmen
150 kDa/120 kDa.33)Gambar 5B menunjukkan bahwa mengobati
sel MDA-MB-231 dengan staurosporin (STS; kontrol positif dan
penginduksi apoptosis) dan LMWF menginduksi pembelahan
280-kDa --spectrin menjadi produk pemecahan 150/145-kDa dan
120-kDa. Namun, merawat sel dengan LMWF dengan adanya
inhibitor calpain E-64d mengurangi munculnya fragmen
150/145-kDa, tetapi tidak pada fragmen 120-kDa (Gbr. 5C).
Khususnya, pretreatment dengan E-64d juga mengurangi
gangguan --m dalam sel MDA-MB-231 yang dirawat LMWF (Gbr.
5D). Hasil ini secara kolektif menunjukkan bahwa apoptosis yang
diinduksi LMWF bergantung pada calpain.

Apoptosis sel MDA-MB-231 yang diinduksi LMWF

B Apoptosis sel yang diinduksi fucoidan sebelumnya
Gambar 2.Induksi dengan Low-Molecular-Weight Fucoidan (LMWF) dari
Kerusakan Mitokondria pada Sel MDA-MB-231.
A, Pelepasan sitokrom tergantung waktucdari mitokondria
ke dalam sitosol diukur dengan Western blotting. Sel MDA-
MB-231 diobati dengan 820mg/mL LMWF untuk waktu yang
ditunjukkan. B, sel MDA-MB-231 diobati dengan 820mg/mL
LMWF untuk waktu yang berbeda, dan gangguan --m diukur
dengan analisis fluoresensi sel bernoda ganda rhodamin 123/
propidium iodida.p <0:05;p <0:01.
dimediasi oleh aktivasi caspase
telah dilaporkan melibatkan aktivasi caspases.34–39)
Konsisten dengan ini, kami mengamati penampilan produk
pemecahan 120-kDa yang bergantung pada caspase
- - spektrin setelah pengobatan LMWF sel MDA-MB-231
(Gbr. 5B), menunjukkan bahwa caspase-3 telah diaktifkan
oleh LMWF. Oleh karena itu kami menyelidiki ekspresi
keluarga enzim caspase yang diaktifkan dengan Western
blotting sel yang diobati dengan LMWF. Seperti yang
diharapkan, sel MDA-MB-231 menunjukkan peningkatan
ekspresi caspase-3 yang dibelah, caspase-7, caspase-8,
caspase-9, dan poli (ADP-ribosa) polimerase (PARP) (Gbr.
6A). Untuk menentukan apakah aktivasi caspase
berkontribusi pada apoptosis yang diinduksi LMWF, kami
menguji efek inhibitor caspase non-spesifik Z-VAD-fmk
dan inhibitor spesifik caspase-9 Z-LEHD-fmk. Gambar 6B
menunjukkan bahwa pretreating sel dengan

SEBUAH B

Gambar 3.Ekspresi Protein Bcl-2 dalam Sel MDA-MB-231 yang Diperlakukan dengan Fucoidan Berat Molekul Rendah (LMWF).
A, sel MDA-MB-231 diobati dengan 820mg/mL LMWF untuk waktu yang ditunjukkan, dan ekspresi Bcl-2, Mcl-1, dan Bcl-xl ditentukan dengan Western
blotting. B, Tingkat relatif sel Bcl-2 dan --actin dalam sel MDA-MB-231/Vec dan MDA-MB-231/Bcl-2 dideteksi dengan Western blotting dan dikuantifikasi
dengan menggunakan perangkat lunak Quantity One (Bio-Rad). Sel C, MDA-MB-231/Vec dan MDA-MB-231/Bcl-2 diobati dengan 82, 410, atau 820mg/
mL LMWF selama 48 jam dan dianalisis dengan annexin V/propidium iodide assay.p <0:05;p <0:01.
 Induksi Fucoidan dari Apoptosis dalam Sel MDA-MB-231 239

SEBUAH B

Gambar 4.Induksi oleh Low-Molecular-Weight Fucoidan (LMWF) dari Perubahan Ca Intraseluler2thKonsentrasi dalam Sel MDA-MB-231.
Sel MDA-MB-231 berlabel Fluo-4 AM tidak diobati atau diobati sebelumnya dengan 10mMBAPTA-AM selama 30 menit kemudian dipaparkan pada 820mg/mL
LMWF selama 3 jam. Sel dirawat selama 30 menit dengan 1mg / mL ionomycin berfungsi sebagai kontrol positif. A, Gambar mikroskopis fluoresensi direkam dengan
waktu pemaparan yang sama untuk setiap panel. B, Sel dicobakan, dicuci, dan dianalisis dengan flow cytometry.

SEBUAH B

C D

Gambar 5.Keterlibatan Calpain dalam Kematian Sel MDA-MB-231 yang Diinduksi dengan Berat Molekul Rendah (LMWF).
A, sel MDA-MB-231 tidak diobati atau diobati dengan 50mME-64d selama 1 jam dan kemudian diekspos ke 820mg/mL LMWF selama 48 jam. Setelah
perawatan ini, sel-sel apoptosis diidentifikasi dengan pewarnaan annexin V/propidium iodide.p <0:05;p <0:01.B, sel MDA-MB-231 diobati dengan 820m
g / mL LMWF untuk waktu yang ditunjukkan, dan lisat sel diperiksa untuk keberadaan fragmen --spectrin 150-kDa dan 120-kDa dengan Western
blotting. Sel dirawat selama 6 jam dengan 5 nMSTS berfungsi sebagai kontrol positif, dan --actin diperiksa sebagai kontrol pemuatan. Angka di bawah
setiap jalur menunjukkan kuantifikasi densitometrik dari setiap pita relatif terhadap jumlah dalam sel kontrol yang tidak diberi perlakuan. C, sel MDA-
MB-231 tidak diobati atau diobati dengan 50mME-64d selama 1 jam dan kemudian diinkubasi dengan LMWF (820mg/ml) selama 48 jam. Ekspresi protein
relatif dihitung. D, Sel tidak diobati atau diobati dengan 50mME-64d selama 1 jam dan kemudian diinkubasi dengan 820mg/mL LMWF selama 48 jam.
Gangguan --m dideteksi dengan pewarnaan rhodamine 123.p <0:05;p <0:01.

salah satu inhibitor sebagian tetapi secara signifikan mengurangi
apoptosis yang diinduksi oleh LMWF. Pretreating dengan Z-VADfmk
plus E-64d gagal untuk sepenuhnya memblokir apoptosis yang
diinduksi LMWF.
Diskusi
Ganggang coklat adalah kelompok besar ganggang laut yang sebagian
besar dikonsumsi sebagai bagian rutin dari makanan, khususnya
di negara-negara Asia. Fucoidan adalah polisakarida yang
diisolasi dari ganggang coklat yang memiliki potensi
aktivitas farmakologis dan biologis. Meskipun mekanisme
aktivitas anti-kanker fucoidan tidak sepenuhnya dipahami,
beberapa kemungkinan telah diusulkan, termasuk
gangguan proliferasi sel tumor (siklus sel dan apoptosis),
peningkatan pengawasan kekebalan, dan penghambatan
invasi sel tumor dan angiogenesis. Kami memfokuskan
penelitian ini pada aktivitas antitumor LMWF.
240 Z.ZMENGGANTUNGet al.

SEBUAH B

Gambar 6.Induksi oleh Low-Molecular-Weight Fucoidan (LMWF) dari Pembelahan Caspases yang Tergantung Waktu dalam Sel MDA-MB-231.
A, sel MDA-MB-231 diobati dengan 820mg / mL LMWF untuk waktu yang ditunjukkan, sebelum pembelahan caspases ditentukan oleh Western
blotting dari lisat sel. Ekspresi relatif dari setiap protein dihitung dan ditampilkan di bawah setiap pita. B, Efek inhibitor caspase dan calpain pada
apoptosis yang diinduksi oleh LMWF. Sel MDA-MB-231 diberi perlakuan awal dengan Z-VAD-fmk (10mM), Z-LEHD-fmk (10mM), atau Z-VAD-fmk (10mM)
ditambah E-64d (50mM) selama 1 jam dan kemudian diinkubasi dengan 820mg/mL LMWF selama 48 jam. Apoptosis dievaluasi dengan pewarnaan
ganda annexin V/ propidium iodide. Hasil berasal dari 3 percobaan independen.p <0:05;p <0:01.

Kami sebelumnya telah menemukan bahwa LMWF
memediasi penghambatan pertumbuhan spektrum luas sel
karsinoma manusia, termasuk adenokarsinoma serviks
HeLa, fibrosarcoma HT1080, leukemia K562, limfoma U937,
adenokarsinoma paru A549, dan sel leukemia HL-60.30)Garis
sel MCF-10A non-ganas kurang sensitif terhadap
pengobatan LMWF daripada garis sel ganas.30)
Selain itu, LMWF menghambat invasi dan angiogenesis sel
fibrosarcoma HT1080 dan menginduksi apoptosis pada sel
kanker MCF-7melaluijalur caspase-independen tetapi
bergantung pada mitokondria.30,31)Kami memberikan bukti
dalam penelitian ini untuk mendukung peran Ca yang saling
terkait2thhomeostasis, disfungsi mitokondria, dan aktivasi
caspase dalam memediasi efek apoptosis LMWF pada sel
kanker payudara MDA-MB-231.
Mitokondria memainkan peran penting dalam
mengintegrasikan dan mengarahkan sinyal kematian dan
bertanggung jawab atas berbagai peristiwa penting dalam
proses apoptosis, termasuk perubahan transpor elektron,
hilangnya --m, gangguan Ca2thhomeostasis, dan pembentukan
spesies oksigen reaktif.40,41)Disfungsi mitokondria menyebabkan
kebocoran faktor apoptosis seperti sitokromcdan AIF dari ruang
intermembran mitokondria ke dalam sitoplasma, di mana
mereka memulai kaskade peristiwa aktivasi kaspase yang pada
akhirnya membuat sel menjadi apoptosis.40,42)Kami sebelumnya
telah menunjukkan bahwa kematian sel MCF-7 yang diinduksi
LMWF melibatkan kerusakan mitokondria dan mengatur
ekspresi protein apoptosis pada atau di mitokondria.30)Kami
menemukan dalam penelitian ini bahwa LMWF juga
menginduksi keruntuhan berkelanjutan --m, pelepasan sitokrom
c,dan penurunan regulasi protein anti-apoptosis Bcl-2, Mcl-1,
dan Bcl-xl. Temuan ini menunjukkan bahwa disfungsi
mitokondria yang diinduksi LMWF secara langsung bertanggung
jawab atas induksi apoptosis pada sel MDA-MB-231.
Perubahan Ca2thpensinyalan dapat memengaruhi
proliferasi dan diferensiasi sel serta memodulasi apoptosis.
32,43)Kami menemukan dalam penelitian ini bahwa LMWF
membangkitkan peningkatan cepat Ca intraseluler2thtingkat
dalam sel MDA-MB-231, dan peningkatan ini secara
signifikan dihambat oleh Ca2thchelator, BAPTA-AM. Data ini
menunjukkan bahwa gangguan Ca2thhomeostasis berperan
dalam proses apoptosis. Calpain hadir dalam sitosol sebagai
proenzim tidak aktif, procalpain, yang bertranslokasi ke
membran sel dengan adanya konsentrasi mikromolar Ca
2th.44,45)Salah satu substrat yang menonjol untuk calpain
adalah --spectrin46)yang juga dikenal sebagai fodrin.
- - Spektrin telah terlibat sebagai "substrat kematian" yang,
ketika dibelah, mungkin berperan dalam menstabilkan
struktur membran, mempertahankan bentuk sel, dan
menghubungkan sitoskeleton ke membran plasma atau
vesikel intraseluler.47)Oleh karena itu, deteksi fragmen
proteolitik --spektrin yang diinduksi calpain mungkin sangat
penting dalam menggambarkan hubungan antara aktivasi
calpain dan tahap awal apoptosis sel. Kami telah
menunjukkan di sini bahwa --spectrin terdegradasi menjadi
fragmen 150-kDa dan 120-kDa dalam sel yang terpapar
LMWF. Inhibitor calpain E-64d mengurangi produksi
fragmen 150-kDa, tetapi memiliki sedikit efek pada
munculnya fragmen 120-kDa. E-64d juga mengurangi
persentase sel apoptosis yang diinduksi oleh LMWF. Temuan
ini menunjukkan bahwa calpain dan caspases berpartisipasi
dalam apoptosis yang diinduksi LMWF. Selain itu, E-64d
mengurangi disipasi --m, menegaskan peran Ca2thdalam
gangguan fungsi mitokondria. Kami menyarankan bahwa
LMWF bertindak setidaknya sebagian dengan membuka pori
transisi permeabilitas mitokondria. Jika demikian, aliran ion
melalui pori ini akan mengganggu --m dan melepaskan
protein proapoptosis yang bergantung pada mitokondria.
Telah dilaporkan bahwa aktivasi calpain dapat memproses
AIF protein proapoptosis dan, pada gilirannya, memfasilitasi
pelepasan AIF sitosol.48)Konsisten dengan gagasan ini,
penelitian kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa
pengobatan LMWF menginduksi pelepasan AIF dari
mitokondria ke dalam sitosol.30)Ada kemungkinan bahwa
LMWF menginduksi apoptosis melalui mekanisme di mana
aktivasi calpain menyelaraskan sinyal sitosol dan
mitokondria untuk mengeksekusi proses kematian.
Caspases adalah keluarga protease sistein yang
membelah beberapa substrat seluler dan merupakan
mediator penting dari apoptosis yang diinduksi oleh
berbagai rangsangan.49,50)Apoptosis yang diaktifkan
caspase terutama dipicu oleh pelepasan sitokromcdari
mitokondria ke dalam sitoplasma. Ini terkait dengan
aktivasi caspase-9, yang membelah dan mengaktifkan
caspase-3 dan caspase-7, algojo pusat.51)Pembelahan --
 Induksi Fucoidan dari Apoptosis dalam Sel MDA-MB-231
spektrin ke dalam fragmen 120-kDa, seperti yang diamati di sini,
dimediasi oleh caspase-3. Kami juga mengamati bahwa
caspase-9, caspase-3, dan caspase-7 dalam sel MDA-MB-231
diaktifkan ketika sitokromcdilepaskan ke sitosol setelah
runtuhnya --m. Pembelahan PARP, ciri khas apoptosis dan
aktivasi caspase, juga terdeteksi pada sel MDA-MB-231 yang
diobati dengan LMWF. Selain itu, inhibitor caspase non-spesifik
dan inhibitor spesifik caspase-9 keduanya mengurangi apoptosis
yang diinduksi LMWF. Efek ini menunjukkan bahwa aktivasi
caspase adalah salah satu mekanisme kematian sel yang
dimediasi LMWF dan konsisten dengan penelitian sebelumnya
yang menunjukkan bahwa apoptosis yang dimediasi fucoidan
melibatkan aktivasi anggota keluarga caspase.34–39)Kami
sebelumnya telah menunjukkan bahwa LMWF menginduksi jalur
apoptosis independen caspase dalam sel MCF-7.30)Sel MCF-7
tidak mengekspresikan full-length caspase-3 untuk menginduksi
loop umpan balik positif, juga tidak mengalami pembentukan
apoptosom.in vivo.52,53)Dengan demikian, perbedaan dalam efek
LMWF pada dua jalur sel ini mungkin disebabkan oleh status
caspase-3 yang berbeda dari sel MCF-7 (kekurangan caspase-3)
dan MDA-MB-231 (pengekspresian caspase 3). Pretreating sel
dengan Z-VAD-fmk plus E-64d gagal untuk sepenuhnya
memblokir apoptosis yang diinduksi LMWF, menunjukkan
bahwa calpain dan caspases tidak memainkan peran eksklusif
dalam pelaksanaan apoptosis. Kami sebelumnya telah
menunjukkan bahwa aktivasi c-Jun N-terminal kinase (JNK) yang
bergantung pada spesies oksigen reaktif memainkan peran
dalam apoptosis sel MCF-7 yang dimediasi LMWF dan bahwa AIF
adalah mediator penting dari apoptosis independen caspase
dalam sel-sel ini.30)Data ini menunjukkan bahwa aktivasi calpain
dan caspases akan menjadi penting untuk apoptosis yang
diinduksi LMWF dalam sel MDA-MB-231. Pekerjaan lebih lanjut
diperlukan untuk menentukan bagaimana berbagai jalur
transduksi sinyal memengaruhi apoptosis pada sel kanker yang
diobati dengan LMWF.
Estrogen diketahui merangsang pertumbuhan sel dan
menghambat apoptosis pada sel kanker payudara ER-positif.54)
Hubungan antara ekspresi Bcl-2 dan status ER dianggap penting
untuk karakterisasi klinis kanker payudara.55)Kanker payudara
ER-negatif, yang masing-masing mengekspresikan Bcl-2 tingkat
rendah, lebih resisten daripada kanker ER-positif terhadap terapi
hormon dan kemoterapi.56)Kami sebelumnya telah
menunjukkan bahwa ekspresi Bcl-2 LMWF yang diatur turun
dalam sel MCF-7 ER-positif,30)dan kami telah menunjukkan di sini
efek yang sama pada sel MDA-MB-231 ER-negatif. Sel-sel Bcl-2-
overexpressing MDA-MB-231 yang diobati dengan LMWF
menunjukkan tingkat apoptosis yang lebih rendah daripada sel
MDA-MB-231/ Vec yang diperlakukan serupa. Data ini
menunjukkan bahwa kemampuan LMWF untuk mengurangi
ekspresi Bcl-2 dapat membuat sel kanker payudara lebih sensitif
terhadap pengobatan, terlepas dari status ER-nya. Ekspresi
JNK-1 yang aktif secara konstitutif dalam sel kanker payudara ER-
positif telah terbukti memblokir apoptosis yang diinduksi
estradiol.23)Kami sebelumnya telah melaporkan bahwa aktivasi
JNK mempromosikan --m disipasi dan apoptosis berikutnya
dalam sel MCF-7 ER-positif.30)Studi lebih lanjut yang berfokus
pada efek LMWF pada aktivasi JNK pada sel kanker payudara ER-
negatif oleh karena itu akan meningkatkan pemahaman kita
tentang mekanisme dimana LMWF menginduksi apoptosis pada
sel kanker payudara ER-negatif dan ER-positif.
Fucoidan telah terbukti mempengaruhi fungsi beberapa
protein permukaan sel yang terlibat dalam migrasi dan
241
adhesi sel, termasuk integrin, faktor pertumbuhan endotel
vaskular-1 dan -2, P-selektin, dan neuropilin-1.19,57–59)
Selain itu, perawatan fucoidan telah mempengaruhi -1ekspresi
integrin, meningkatkan asosiasi caspase-8 dengan domain
intraseluler -1integrin, dan menginduksi apoptosis yang bergantung
pada caspase-8 dalam sel MCF-7.57)Dengan demikian akan menarik
untuk menyelidiki lebih lanjut bagaimana interaksi LMWF dengan
protein membran permukaan sel dapat berkontribusi pada efeknya
pada sel kanker.
Pemberian tunggal 1 g Okinawa mozuku fucoidan dengan
berat molekul tinggi (28,8 kDa MW) kepada subyek manusia
telah menghasilkan deteksi 0,1mg/mL fucoidan dalam
serum setelah 6 jam dan 1mg/mL fucoidan dalam urea
setelah 9 jam.60)Irhimehet al.61)juga telah melaporkan bahwa
konsentrasi fukoidan dengan berat molekul tinggi adalah 13
mg/mL dalam plasma manusia ketika 3 gwakamefucoidan
diberikan setiap hari selama 12 hari. Sekitar 17 g LMWF
sebenarnya telah diberikan setiap hari selama 30 sampai 90
hari dalam pengobatan integratif untuk mengobati kanker.
Meskipun kami menggunakan 80mg/mL LMWF sebagai
jumlah minimum dalamin vitropercobaan, kami
mengasumsikan bahwa LMWF dengan berat molekul rendah
(kebanyakan di bawah 500 MW) akan diserap dari saluran
pencernaan lebih efisien daripada fukoidan dengan berat
molekul tinggi. Menariknya, Tokitaet al.60)
telah melaporkan pendeteksian fukoidan 55–96 kDa
dalam serum manusia dan 1,8–3,1 kDa dalam urin
manusia, menunjukkan bahwa fukoidan dengan berat
molekul tinggi langsung diserap dari saluran pencernaan
tanpa degradasi. Irhimehet al.61)juga telah melaporkan
bahwa fukoidan dengan berat molekul tinggi dapat
dideteksi dalam plasma manusia setelah diberikan
secara oral kepada subjek. Sweeneyet al.62)telah
melaporkan bahwa fucoidan dengan berat molekul
tinggi dapat berhasil diberikan secara intravena ke tikus
dan monyet pada 100mg/kg (sekitar 1,4mg/mL dalam
darah ketika jumlah darah sekitar 7,3% dari total tubuh
pada tikus) untuk menyelidiki efek dari fucoidan pada
mobilisasi sel induk / progenitor.
Fucoidan dengan berat molekul tinggi dapat langsung
dimasukkan ke dalam darahmelaluipersimpangan ketat
di usus. Epitel usus manusia dibentuk oleh satu lapisan
sel epitel yang memisahkan lumen usus dari lamina
propria di bawahnya. Ruang antara sel-sel ini disegel
oleh persimpangan ketat yang mengatur permeabilitas
penghalang usus. Persimpangan ketat baru-baru ini
dilaporkan dikendalikan oleh sejumlah molekul
pensinyalan serta oleh komponen makanan, termasuk
polisakarida seperti kitosan.63)Persimpangan ketat
dianggap memiliki sifat kontradiktif yang memungkinkan
penetrasi zat yang berguna bagi tubuh kita terlepas dari
fungsi penghalangnya. Mekanisme penetrasi fucoidan
masih harus diselidiki di masa depan. Pemantauan
konsentrasi LMWF dalam serum dan urin manusia akan
memberikan informasi berharga tentang kemungkinan
penggunaan LMWF sebagai obat anti kanker.
Kesimpulan
Data kami menunjukkan bahwa sel MDA-MB-231 ER-
negatif sensitif terhadap penghambatan pertumbuhan dan
induksi apoptosis oleh LMWF. Apoptosis yang diinduksi
LMWF dikaitkan dengan jalur kematian sel mitokondria,
242
dimediasi oleh peningkatan Ca intraseluler2thkonsentrasi
dan aktivasi kaspase selanjutnya. Pemahaman yang lebih
baik tentang mekanisme aksi antikanker LMWF
meningkatkan kemungkinan bahwa LMWF berpotensi
sebagai agen antikankerin vivo.
Referensi
1) Nobili S, Lippi D, Witort E, Donnini M, Bausi L, Mini E, dan
Capaccioli S,Pharmacol. Res.,59,365–378 (2009).
2) MannJ,Nat. Pendeta Kanker,2,143–148 (2002).
3) Fulda S,Planta Med.,76,1075–1079 (2010).
4) Hayashi K, Nakano T, Hashimoto M, Kanekiyo K, and Hayashi
T,Int. Imun. farmakol.,8,109–116 (2008).
5) Cumashi A, Ushakova N, Preobrazhenskaya M, D'Incecco A,
Piccoli A, Totani L, Tinari N, Morozevich GE, Berman AE, Bilan
MI, Usov AI, Ustyuzhanina NE, Grachev AA, Sanderson
CJ, Kelly M, Rabinovich GA, Iacobelli S, and Nifantiev NE,
Glikobiologi,17,541–552 (2007).
6) Wang J, Zhang QB, Zhang ZS, Lagu HF, dan Li PC,Int. J.Biol.
Makromol.,46,6–12 (2010).
7) Maruyama H, Tamauchi H, Hashimoto M, dan Nakano T,Di
Vivo,17,245–250 (2003).
8) Alekseyenko TV, Zhanayeva SY, Venediktova AA, Zvyagintseva TN,
Kuznetsova TA, Besednova NN, dan Korolenko TA,Banteng.
Exp. Biol. kedokteran,143,730–732 (2007).
9) Coombe DR, Paroki CR, Ramshaw IA, dan Snowden JM,Int.
J.Kanker,39,82–88 (1987).
10) Koyanagi S, Tanigawa N, Nakagawa H, Soeda S, and Shimeno
H,Biokimia. farmakol.,65,173–179 (2003).
11) Nishimoto SJ,J.Int. Soc. Info Kehidupan. Sains,22,497–505 (2004).
12) Irhimeh MR, Fitton JH, Lowenthal RM, dan Kongtawelert P,
Metode Temukan. Exp. Klinik. farmakol.,27,1–7 (2005).
13) Funahashi H, Imai T, Mase T, Sekiya M, Yokoi K, Hayashi H,
Shibata A, Hayashi T, Nishikawa M, Suda N, Hibi Y, Mizuno
Y, Tsukamura K, Hayakawa A, and Tanuma S,Jpn. J. Kanker
Res.,92,483–487 (2001).
14) Li N, Zhang Q, dan Lagu J,Makanan Kimia. racun.,43,421–426
(2005).
15) Irhimeh MR, Fitton JH, dan Lowenthal RM,Exp. Hematol.,35, 989–
994 (2007).
16) Matsubara K, Xue C, Zhao X, Mori M, dan Sugawara T,Int. J.Mol.
kedokteran,15,695–699 (2005).
17) Zemani F, Benisvy D, Galy-Fauroux I, Lokajczyk A, Colliec-
Jouault S, Uzan G, Fischer AM, dan Boisson-Vidal C,
Biokimia. farmakol.,70,1167–1175 (2005).
18) Alkhatib B, Freguin-Bouilland C, Lallemand F, Henry JP, Litzler
PY, Marie JP, Richard V, Thuillez C, and Plissonnier D,
Transpl. Imunol.,16,14–19 (2006).
19) Danau AC, Vassy R, Di Benedetto M, Lavigne D, Le Visage C,
Perret GY, dan Letourneur D,J.Biol. Kimia,281,37844–37852
(2006).
20) Freguin-Bouilland C, Alkhatib B, David N, Lallemand F, Henry
JP, Godin M, Thuillez C, and Plissonnier D,Transplantasi,
83,1234–1241 (2007).
21) Nishino T dan Nagumo T,Karbohidrat. Res.,211,77–90 (1991).
22) Lagu MY, Ku SK, dan Han JS,Makanan Kimia. racun.,50,790– 796
(2012).
23) Razandi M, Pedram A, dan Levin ER,Mol. Endokrinol.,14,
1434–1447 (2000).
24) Parkin DM dan Fernández LMG,Payudara J.,12 (Suppl 1), S70– S80
(2006).
25) Porter PL,Salud Publica Mex.,51 (Suppl 2), s141–s146 (2009).
26) Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, and Forman D,
CA Cancer J.Clin.,61,69–90 (2011).
27) Doyle DM dan Miller KD,Kanker payudara,15,49–56 (2008).
28) Gluz O, Liedtke C, Gottschalk N, Pusztai L, Nitz U, dan
Harbeck N,Ann. Oncol.,20,1913–1927 (2009).
29) Foulkes WD, Smith IE, dan Reis-Filho JS,N.Engl. J.Med.,
363,1938–1948 (2010).
30) Zhang Z, Teruya K, Eto H, and Shirahata S,PLoS SATU,6,
e27441 (2011).
Z.ZMENGGANTUNGet al.
31) Ye J, Li YP, Teruya K, Katakura Y, Ichikawa A, Eto H, Hosoi
M, Hosoi M, Nishimoto S, and Shirahata S,Sitoteknologi,47,
117–126 (2005).
32) Orrenius S, Zhivotovsky B, dan Nicotera P,Nat. Pendeta Mol. Bio
sel.,4,552–565 (2003).
33) Nath R, Raser KJ, Stafford D, Hajimohammadreza I, Posner A,
Allen H, RV Talanian, Yuen P, Gilbertsen RB, dan Wang KK,
Biokimia. J.,319 (Pt. 3), 683–690 (1996).
34) Aisa Y, Miyakawa Y, Nakazato T, Shibata H, Saito K, Ikeda Y, dan
Kizaki M,Saya. J. Hematol.,78,7–14 (2005).
35) Haneji K, Matsuda T, Tomita M, Kawakami H, Ohshiro K,
Uchihara JN, Masuda M, Takasu N, Tanaka Y, Ohta T, dan
Mori N,Nutr. Kanker,52,189–201 (2005).
36) Hyun JH, Kim SC, Kang JI, Kim MK, Boo HJ, Kwon JM, Koh YS, Hyun
JW, Park DB, Yoo ES, dan Kang HK,Biol. Farmasi. Banteng.,32,
1760–1764 (2009).
37) Kim EJ, Park SY, Lee JY, and Park JH,BMC Gastroenterol.,
10,96–107 (2010).
38) Miyamoto YY, Yamasaki M, Tachibana H, and Yamada K,
J.Agri. kimia makanan.,57,8677–8682 (2009).
39) Nagamine T, Hayakawa K, Kusakabe T, Takada H, Nakazato K,
Hisanaga E, and Iha M,Nutr. Kanker,61,340–347 (2009).
40) Kroemer G, Galluzzi L, dan Brenner C,Fisik. Putaran.,87,99–
163 (2007).
41) Marchetti P, Castedo M, Susin SA, Zamzami N, Hirsch T, Macho A,
Haeffner A, Hirsch F, Geuskens M, dan Kroemer G,
J.Exp. kedokteran,184,1155–1160 (1996).
42) Kroemer G dan Reed JC,Nat. kedokteran,6,513–519 (2000).
43) Gunter TE, Yule DI, Gunter KK, Eliseev RA, dan Salter JD, FEB
Lett.,567,96–102 (2004).
44) Michetti M, Salamino F, Tedesco I, Averna M, Minafra R,
Melloni E, and Pontremoli S,FEB Lett.,392,11–15 (1996).
45) Suzuki K dan Sorimachi H,FEB Lett.,433,1–4 (1998).
46) Czogalla A dan Sikorski AF,Sel. Mol. Ilmu Kehidupan.,62,1913–1924
(2005).
47) Martin SJ, O'Brien GA, Nishioka WK, Mcgahon AJ, Mahboubi
A, Saido TC, dan Green DR,J.Biol. Kimia,270,6425–6428
(1995).
48) Norberg E, Gogvadze V, Ott M, Horn M, Uhle'n P, Orrenius S, dan
Zhivotovsky B,Kematian Sel Berbeda.,15,1857–1864 (2008).
49) Riedl SJ dan Shi Y,Nat. Pendeta Mol. Bio sel.,5,897–907
(2004).
50) Li J dan Yuan J,Onkogen,27,6194–6206 (2008).
51) Kumar S,Kematian Sel Berbeda.,14,32–43 (2007).
52) Slee EA, Harte MT, Kluck RM, Wolf BB, Casiano CA,
Newmeyer DD, Wang HG, Reed JC, Nicholson DW, Alnemri
ES, DR Hijau, dan Martin SJ,J. Cell Biol.,144,281–292 (1999).
53) Janicke RU,Res Kanker Payudara. Merawat.,117,219–221 (2009).
54) Wambi JSL dan Jordan VC,Res Kanker Payudara.,11,206–218
(2009).
55) Daidone MG, Luisi A, Veneroni S, Benini E, dan Silvestrini R,
Endokr. Relat. Kanker,6,61–68 (1999).
56) McGuireWL,Sem. Oncol.,5,428–433 (1978).
57) Yamasaki Y, Yamasaki M, Tachibana H, and Yamada K, Biosci.
Bioteknologi. Biokimia.,76,1163–1168 (2012).
58) Rouzet F, Violette LB, Alsac JM, Suzuki M, Meulemans A, Louedec
L, Petiet A, Perrus MJ, Chaubet F, Michel JB, Guludec
DL, dan Letourneur D,J.Nukl. kedokteran,52,1433–1440 (2011).
59) Bachelet L, Bertholon I, Lavigne D, Vassy R, Perrus MJ,
Chaubet F, dan Letourneur D,Biochim. Biofisika. Akting,
1790, 141–146 (2009).
60) Tokita Y, Nakajima K, Mochida H, Iha M, and Nagamine T, Biosci.
Bioteknologi. Biokimia.,74,350–357 (2010).
61) Irhimeh MR, Fitton JH, Lowenthal RM, and Kongtawelert P,
Metode Temukan. Exp. Klinik. farmakol.,27,705–710 (2005).
62) Sweeney EA, Priestley GV, Nakamoto B, Collins RG, Beaudet AL, dan
Papayannopoulous T,Proses Natl. Acad. Sains. AMERIKA SERIKAT,
97, 6544–6549 (2000).
63) Ulluwisherwa D, Anderson RC, McNabb WC, Moughan PJ,
Wells JM, dan Roy NC,J.Nutr.,141,769–776 (2011).