Developing Biodegradable Nanoparticles Loaded with Mometasone

Furoate for Potential Nasal Drug Delivery

(Mengembangkan Partikel Nano Biodegradable yang Dimuat dengan Mometasone Furoate
untuk Penghantaran Obat Hidung yang Potensial..)

Abstrak
Pemberian obat intranasal dianggap rutin dalam pengobatan banyak kondisi hidung termasuk
rinosinusitis kronis (CRS), yang merupakan penyakit umum yang melibatkan peradangan jangka
panjang pada mukosa hidung. Perawatan steroid hidung topikal aman dan mudah digunakan
dan memainkan peran dasar dalam perawatan non-bedah dan bedah untuk CRS. Terapi steroid
intranasal untuk berbagai interval waktu biasanya digunakan sebelum dan sesudah operasi
hidung CRS endoskopi untuk mengurangi peradangan dan edema dan untuk meningkatkan
penyembuhan mukosa. Obat saat ini diberikan melalui semprotan hidung konvensional; oleh
karena itu, ada insentif untuk mengembangkan sistem penghantaran obat yang lebih efisien
untuk pelepasan terkontrol steroid topikal ke dalam rongga sinonasal dalam jangka waktu lama.
Dalam penelitian ini, nanopartikel poli (laktat-ko-glikolat) (PLGA) yang dimuat dengan
mometasone furoate (MF) dihasilkan menggunakan metode nanopresipitasi dan dikarakterisasi
secara fisikokimia dan morfologis. MF NP menunjukkan sifat fisikokimia yang memadai dan
efisiensi enkapsulasi obat yang tinggi serta konten pemuatan. MF menunjukkan pelepasan
berkelanjutan dari NP selama 7 hari in vitro dengan pelepasan ledakan awal; berbagai model
matematika diterapkan untuk menentukan kinetika pelepasan obat. Setelah Menunjukkan
kemampuan untuk memuat MF di PLGA-NP menggunakan metode nanopresipitasi untuk
pertama kalinya, NP ini mendesak perlunya penyelidikan tambahan untuk menunjukkan potensi
terapeutiknya dalam aplikasi pengiriman hidung.

1. Introduction
Rinosinusitis kronis (CRS) adalah penyakit peradangan umum yang mempengaruhi
rongga hidung dan sinus paranasal, yang secara signifikan dapat mempengaruhi fungsi
dan kualitas hidup seseorang sehari-hari. Hal ini umumnya ditandai dengan hidung
tersumbat dan sekret yang berlangsung setidaknya 12 minggu.1 Pendekatan terapeutik
untuk pasien CRS melibatkan kombinasi kompleks dari terapi bedah dan medis,
sedangkan penggunaan steroid topikal dan sistemik adalah dasar untuk pengobatan
kondisi ini. Bedah sinus endoskopik (ESS) diterima secara luas sebagai prosedur
pembedahan pilihan untuk merawat CRS, yang refrakter terhadap terapi medis
konvensional karena meningkatkan patensi jalan napas sinonasal dan membersihkan
sinus sekaligus mengurangi keparahan inflamasi. Namun demikian, itu tidak selalu
merupakan prosedur yang sederhana dan jinak dan potensi komplikasi termasuk
perdarahan hebat pasca operasi, adhesi mukosa, infeksi, peradangan, dan hasil bedah
yang terganggu.
Steroid biasanya digunakan untuk mengelola CRS karena sifat anti-inflamasinya yang
kuat. Namun, sementara steroid oral efektif, penggunaannya dikaitkan dengan
beberapa efek samping.3 Oleh karena itu, steroid topikal semakin banyak digunakan
karena profil keamanannya yang menguntungkan dan karena fakta bahwa pemberian
intranasal melalui berbagai semprotan hidung sangat umum dan umumnya lebih
disukai. baik oleh pasien maupun dokter. Steroid intranasal dianggap sebagai modalitas
pengobatan dasar terapi CRS, memberikan konsentrasi obat lokal yang tinggi sambil
meminimalkan paparan sistemik.4 Mometasone furoate (MF) telah terbukti efektif
dalam mengobati gangguan inflamasi hidung.5,6 Telah digunakan di praktek klinis untuk
indikasi sinonasal selama lebih dari 20 tahun, dan literatur yang signifikan telah
menunjukkan khasiatnya yang bermanfaat untuk kondisi seperti itu. Tinjauan sistematis
oleh Passali et al. memeriksa efektivitas semprotan hidung MF di CRS.5 MF terbukti
lebih efektif daripada pesaingnya dalam hal pengendalian gejala dan profil keamanan.
Selanjutnya, Meltzer et al. menyelidiki kemanjuran MF versus antibiotik dalam
mengobati CRS dan menunjukkan bahwa MF secara signifikan lebih unggul daripada
amoksisilin dalam pengobatan kondisi ini.7 MF (Gambar 1) adalah obat yang sangat
lipofilik dan sulit larut dalam air dengan risiko penyerapan sistemik yang relatif rendah.
Kelarutan obat yang buruk dalam air adalah salah satu masalah paling signifikan dalam
pengembangan obat. Obat yang tidak larut membutuhkan eksipien untuk meningkatkan
kelarutan, termasuk surfaktan, cosolvent, larutan misel, agen pengompleks, dan
formulasi lipid.9 Sayangnya, peningkatan jumlah bahan yang diperlukan untuk
memformulasi molekul yang tidak larut dalam air dapat meningkatkan potensi efek
samping.
Penghantaran obat berbasis nanoteknologi dapat mengatasi hambatan anatomi,
fisiologis, kimia, dan klinis tertentu yang terkait dengan bentuk sediaan konvensional.
Nanopartikel (NP) adalah dispersi partikulat submikrometer, atau partikel padat, yang
dapat mengantarkan berbagai agen terapeutik penting seperti asam nukleat, peptida,
dan molekul hidrofobik dan hidrofilik kecil ke sistem biologis yang berbeda. Keuntungan
potensial dari NP termasuk peningkatan kelarutan dan stabilitas obat, peningkatan
bioavailabilitas di area target, dan durasi aksi yang lebih lama dengan mengendalikan
laju pelepasan. Hal ini dapat menghasilkan efek samping yang minimal dan rute
pemberian yang lebih nyaman, yang mengarah pada peningkatan kepatuhan pasien dan
peningkatan hasil terapi. Banyak jenis terapi nano telah dirancang dan dievaluasi selama
bertahun-tahun (misalnya, berdasarkan liposom, polimer, dan misel sebagai bahan
pembawa).10 Di antara bahan pembawa, kopolimer poli(asam laktat-ko-glikolat) (PLGA )
memiliki sejarah panjang penggunaan sebagai biomaterial karena biokompatibilitas dan
biodegradabilitasnya yang luar biasa. Sifat berat molekul dan laju biodegradasi dapat
dikontrol pada rentang nilai yang luas. Monomer terhidrolisis mudah dimetabolisme
dalam tubuh melalui siklus Krebs dan dihilangkan sebagai karbon dioksida dan air. PLGA
telah disetujui oleh FDA untuk digunakan dalam sistem penghantaran obat karena sifat
pelepasannya yang terkontrol dan berkelanjutan serta biokompatibilitas dengan
jaringan dan sel biologis.
NP PLGA yang mengandung obat paling sering dibuat dengan nanopresipitasi13,14 dan
penguapan pelarut emulsi tunggal atau ganda, di mana berbagai zat penstabil dan
pelarut organik digunakan dan memiliki efek kritis pada sifat fisikokimia NP.15,16
Selanjutnya, berat molekul PLGA, rasio obat/polimer, dan kondisi nanopresipitasi
 semuanya mempengaruhi sifat akhir dari NP.17−19 Solutol HS15 adalah surfaktan
nonionik biokompatibel dengan stabilitas tinggi dan kemampuan solubilisasi yang sangat
baik dari obat hidrofobik. Hal ini juga ditandai dengan peningkatan permeabilitas
mukosa dan perubahan farmakokinetik obat.
Satu-satunya persiapan PLGA NP yang mengandung MF yang ditemukan oleh penulis
adalah terkonjugasi dengan aglutinin bibit gandum (WGA), dilaporkan oleh Surti et al.
Preparasi dilakukan dengan teknik evaporasi emulsi-pelarut menggunakan polivinil
alkohol (PVA) sebagai stabilizer. Menariknya, belum ada laporan tentang preparasi dan
optimasi nanopartikel PLGA yang mengandung MF melalui metode nanopresipitasi
menggunakan Solutol HS15 sebagai stabilizer. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
merancang dan mengkarakterisasi NP PLGA yang mengenkapsulasi MF untuk pelepasan
obat berkelanjutan menggunakan nanopresipitasi. Hal ini dapat menyebabkan
peningkatan hasil terapi dan kepatuhan pasien.
2. Bagian Eksperimental
2.1. Bahan. Mometasone furoate (MF) dibeli dari Acros Organics (New Jersey, USA).
PLGA-Purasorb PDLG 5010 (50:50) dengan titik tengah viskositas inheren 1 dL/g
dengan baik hati disumbangkan oleh Corbion Purac (Gorinchem, Belanda). Solutol
HS 15 (Macrogol 15 hidroksistearat) dipasok dengan baik oleh BASF (Ludwigshafen,
Jerman). Sodium dodecyl sulfate (SDS) dibeli dari Biological Industries (Beit HaEmek,
Israel). Aseton dan metanol dibeli dari Sigma-Aldrich (Rehovot, Israel). Membran
dialisis Spectra/Por Biotech 1.1 dengan berat molekul cutoff (MWCO) 8000 Da dibeli
dari Spectrum Medical Industries (Houston, Texas, USA).
2.2. persiapan MF NP. Nanopartikel bermuatan MF disiapkan menggunakan metode
nanopresipitasi13 dengan modifikasi. Fase organik, terdiri dari 2 mg MF dan 6 mg
PLGA dalam 1 mL aseton, dituangkan dengan cepat ke dalam 2 mL larutan berair
yang mengandung 0,1% (b/v) Solutol HS 15. Suspensi diaduk pada 900 rpm selama
24 jam untuk memungkinkan penguapan lengkap dari pelarut organik, dan volume
formulasi disesuaikan dengan air menjadi 2 mL (Gambar 2). Penguapan sempurna
dikonfirmasi dengan menimbang botol kaca sebelum penambahan fase organik dan
setelah proses penguapan. Kemudian, formulasi disentrifugasi selama 1 menit pada
3000 rpm untuk membuang kotoran. Supernatan kemudian dipindahkan ke tabung
baru untuk penyelidikan lebih lanjut.
2.3. Karakterisasi Fisikokimia MF NP. Distribusi ukuran partikel, indeks polidispersitas
(PDI), dan potensi zeta NP dikarakterisasi dengan hamburan cahaya dinamis (DLS)
menggunakan Malvern's Zetasizer (seri Nano, Nanos-ZS, Inggris) pada suhu 25 °C
menggunakan air sebagai pengencer.
2.4. Penentuan Efisiensi Enkapsulasi Obat. NP MF disentrifugasi selama 30 menit pada
13.600 rpm untuk mengendapkan NP. Supernatan dibuang, dan sedimen dilarutkan
dalam aseton. Metanol kemudian ditambahkan untuk mengendapkan polimer,
dilanjutkan dengan vorteks dan sentrifugasi selama 1 menit pada 2000 rpm. Setelah
 itu, supernatan yang mengandung obat dan pelarut organik dipindahkan dan
diuapkan. Metanol kemudian ditambahkan ke residu, dan konsentrasi MF
ditentukan menggunakan spektrofotometer Biochrom UV−Vis pada panjang
gelombang 248 nm. Konsentrasi kurva kalibrasi berkisar dari 0 hingga 16 μg/mL
2.5. Evaluasi Morfologis MF NP. Evaluasi morfologi MF NP dilakukan dengan
menggunakan pemindaian mikroskop elektron (SEM) dan pemindaian mikroskop
elektron transmisi (STEM) dengan mikroskop elektron pemindaian resolusi tinggi
ekstrim (XHR SEM) (model Magellan 400L, FEI, Jerman). Sampel diencerkan dengan
air dan difiksasi pada stub SEM.
2.6. Studi Pelepasan Obat In Vitro. NP MF yang mengandung 225 μg MF ditempatkan
dalam kantong dialisis dengan batas molekul 8000 Da. Kantung dialisis
disuspensikan dalam 50 mL phosphate-buffered saline (PBS) yang mengandung 1%
SDS (pH 7,4 dan pH 6,4) dan dipertahankan pada suhu 37 °C (150 rpm). Pada
interval waktu yang telah ditentukan, 1 mL media pelepasan dibuang dan diganti
dengan media segar dengan volume yang sama untuk mempertahankan kondisi
bak. Konsentrasi MF ditentukan menggunakan UV−Vis pada panjang gelombang 248
nm. Konsentrasi kurva kalibrasi dalam PBS yang mengandung 1% SDS berkisar
antara 0 hingga 17,5 μg/mL (Gambar S2)
2.7. Kinetika Pelepasan Obat. Data yang diperoleh dari studi pelepasan dianalisis dengan
model matematika yang berbeda untuk mempelajari kinetika pelepasan obat dari
nanopartikel yang disiapkan: model Higuchi (persen kumulatif obat dilepaskan vs
(waktu)1/2), orde nol (persen kumulatif obat dilepaskan vs waktu), urutan pertama
(mencatat persen kumulatif obat yang ditahan vs waktu), dan 60% pelepasan obat
pertama sesuai dengan model Korsmeyer−Peppas (log persen kumulatif obat yang
dilepaskan vs log waktu).
2.8. Beku-Pengeringan MF NP. NP MF diliofilisasi dengan adanya dua krioprotektan,
manitol dan sukrosa, pada tiga konsentrasi berbeda: 4, 6, dan 8% (b/v). Setelah
pembubaran krioprotektan dalam nanosuspensi, sampel disimpan pada suhu -80 °C
selama setidaknya 24 jam sebelum liofilisasi. NP MF terliofilisasi kemudian disusun
kembali ke volume awal, dan sifat fisikokimianya dievaluasi
3. HASIL DAN DISKUSI
Steroid topikal merupakan terapi lini pertama dalam penatalaksanaan medis CRS, suatu
kondisi inflamasi persisten yang ditandai dengan akumulasi lendir yang sangat
viskoelastis di sinus. Namun, hasil klinis dari steroid topikal seringkali terbatas, terutama
karena distribusi yang buruk ke hidung dan sinus.23 Penghantaran obat lokal
menggunakan NP dapat memfasilitasi penghantaran yang konsisten ke tempat yang
ditargetkan, waktu kontak yang lama, peningkatan konsentrasi obat lokal, pengurangan
efek samping sistemik. efek, dan hasil terapi yang lebih baik. NP telah digunakan dalam
sistem pernapasan sebagai pembawa obat yang mampu meminimalkan pembersihan
mukosiliar dan menghindari fagositosis oleh makrofag, akibatnya meningkatkan
penyerapan obat.
Lai dkk. melaporkan bahwa perkiraan ukuran pori rata-rata lendir CRS setidaknya
150 ± 50 nm, dan nanopartikel polimer dengan diameter hingga 200 nm mampu dengan
mudah menembus lendir CRS yang sangat viskoelastik.25 Huang dan Donovan
menemukan bahwa nanopartikel polistiren termodifikasi amina yang lebih kecil dari 200
nm diangkut melintasi epitel pernapasan hidung kelinci melalui rute paraseluler dan
transelular.26 Dalam penelitian ini, NP PLGA bermuatan MF berhasil dibuat
menggunakan metode nanopresipitasi dengan ukuran partikel rata-rata 117 nm dan
indeks polidispersitas (PDI) yang memuaskan. ) sebesar 0,26 (Tabel 1 dan Gambar 3A)
sedemikian rupa sehingga dapat dengan mudah menembus lendir CRS.
Analisis potensial zeta secara rutin digunakan untuk menentukan muatan
permukaan dan stabilitas NP. Potensi zeta merupakan parameter penting untuk
mengevaluasi dispersi koloid. Nilai antara −30 dan + 30 mV menunjukkan
kecenderungan ketidakstabilan, agregasi, koagulasi, atau flokulasi.27 Nilai potensial zeta
negatif sekitar −32 mV diperoleh untuk MF NP, menunjukkan stabilitas partikel (Tabel 1
dan Gambar 3B). Potensi zeta mempengaruhi kemampuan NP untuk menembus lapisan
mukosa di mana muatan negatif dapat memfasilitasi penetrasi ke dalam lapisan lendir.
Efisiensi enkapsulasi obat adalah 90 ± 2,1%, sebagaimana ditentukan dengan
spektroskopi UV (Tabel 1). Dalam penelitian sebelumnya, efisiensi enkapsulasi MF pada
NP PLGA dan NP PLGA terkonjugasi WGA menggunakan teknik penguapan pelarut
emulsi masing-masing adalah 78 ± 5,5 dan 60 ± 2,5%. Selain itu, kandungan muatan obat
adalah 22,4 ± 0,5% ( w/w), di mana sebagian besar obat nano yang ada biasanya tidak
mencapai nilai yang lebih tinggi dari 10% kandungan muatan obat.
Morfologi MF NP diselidiki. Gambar 4 menunjukkan gambar SEM dan STEM dari
NP yang diperoleh. Morfologi nanocarrier hampir bulat untuk semua sampel yang diuji.
Ukuran rata-rata NP sesuai dengan yang diukur menggunakan DLS dalam kesalahan
eksperimental. Selain itu, distribusi ukuran diamati dan dapat dijelaskan dengan nilai
polidispersitas yang ditemukan oleh DLS.
Untuk mengevaluasi aplikasi potensial MF NP untuk pengiriman hidung,
pelepasan MF in vitro dari NP PLGA diperiksa dalam PBS (pH 6,4 dan pH 7,4) yang
mengandung 1% SDS untuk meniru pH lingkungan mikro mukosa hidung dan pH
fisiologis, masing-masing. , pada suhu 37°C selama 7 hari. Kurva pelepasan kumulatif
dari MF menunjukkan pelepasan ledakan pada awalnya diikuti oleh fase pelepasan
berkelanjutan, dan pelepasan lebih tinggi pada pH yang lebih rendah, seperti yang
diharapkan31 (Gambar 5). Pelepasan semburan awal obat dapat terjadi jika sejumlah
besar terikat lemah atau terserap ke permukaan NP yang relatif besar. Temuan serupa
juga dilaporkan oleh Gaonkar et al. menggunakan polimer yang tepat dengan senyawa
hidrofobik.

Model matematika umumnya digunakan untuk menentukan kinetika pelepasan

obat dari sistem penghantaran obat. Data yang diperoleh dari studi pelepasan in vitro
sesuai dengan beberapa model Untuk menentukan mekanisme pelepasan obat dari NP
yang disiapkan (Gambar 6 dan 7). Nilai R2 yang lebih tinggi diamati pada model orde
pertama relatif terhadap model orde nol, mengungkapkan pelepasan yang bergantung
pada konsentrasi. Di bawah kedua kondisi pH, NP MF ditemukan memiliki nilai R2 yang
lebih tinggi untuk model Higuchi, menunjukkan bahwa pelepasan MF dari NP PLGA
dikendalikan oleh difusi. Namun, model Higuchi tidak memperhitungkan pengaruh
pembengkakan matriks pada hidrasi atau erosi matriks.34 Namun, nilai R2 yang tinggi
diperoleh untuk model Korsmeyer-Peppas, di mana 60% data pelepasan obat pertama
sesuai. . Dalam model ini, nilai eksponen pelepasan “n” mencirikan mekanisme
pelepasan obat dari sistem matriks. Di bawah kedua kondisi pH, eksponen pelepasan
yang diperoleh adalah 0,45 < n < 0,89, menunjukkan bahwa pelepasan mengikuti
transportasi non-Fickian anomali karena kombinasi difusi obat melalui polimer, erosi
polimer, pembengkakan, dan degradasi.22,35 Sejak PLGA degradasi biasanya lambat,
pelepasan MF dari NP PLGA akan tergantung terutama pada kinetika difusi obat dan
pembengkakan dan erosi matriks, seperti yang dijelaskan oleh karya lain menggunakan
obat hidrofobik.36,37 Skala waktu di mana sistem pengiriman kami dipelajari lebih
pendek dari waktu di mana PLGA mengalami degradasi.
 Freeze-drying adalah metode yang dapat diandalkan untuk menjaga stabilitas
produk farmasi dan untuk memfasilitasi penanganan dan penyimpanan.42 Karena
proses ini sangat menekan NP, krioprotektan harus ditambahkan sebelum pembekuan
untuk melindungi NP. Krioprotektan yang paling disukai untuk NP kering beku adalah
turunan gula.43 Analisis ukuran partikel dengan rasio rata-rata diameter NP setelah dan
sebelum pengeringan beku (Sf/Si) adalah kunci penentu keberhasilan formulasi. NP
dianggap stabil selama proses freeze-drying jika rasio Sf/Si mendekati 1, dengan batas
atas 2,44−46. Dalam penelitian ini, sukrosa dan manitol digunakan sebagai
krioprotektan pada konsentrasi berbeda, dan sifat fisikokimia MF NP diukur dengan DLS
setelah pengeringan beku (Tabel 2). Rasio Sf/Si untuk MF NP menggunakan konsentrasi
sukrosa dan manitol yang berbeda berkisar antara 1,25 hingga 1,78, dengan
pengecualian manitol 6%, di mana rasio Sf/Si adalah 2,18. Perubahan distribusi ukuran
partikel dapat dihasilkan dari perilaku krioprotektan selama pengeringan beku dan
adsorpsinya pada permukaan NP.47 Selain itu, nilai potensial zeta berada di kisaran
−30,4 hingga −39,1 mV, menunjukkan stabilitas MF NP yang baik setelah proses
pengeringan beku menggunakan krioprotektan 4−8%.
Efek krioprotektan pada pelepasan MF setelah proses pengeringan beku
diselidiki pada sistem dengan krioprotektan 8% (b/v) karena memiliki rasio Sf/Si
terendah yang teramati. Gambar 8 menunjukkan laju pelepasan obat pada kedua
kondisi pH dengan krioprotektan, di mana tingkat pelepasan ledakan awal menurun
untuk semua formulasi beku-kering dan profil pelepasan dimodifikasi. Pada pH 7,4, NP
dengan krioprotektan sukrosa dan manitol menunjukkan sedikit penurunan pada laju
pelepasan dan persentase kumulatif MF yang dilepaskan, selain penurunan pelepasan
ledakan. Pada pH 6,4, sementara persentase MF yang lebih rendah awalnya dilepaskan
ketika sukrosa dan manitol ditambahkan digunakan, persentase kumulatif MF yang jauh
lebih tinggi diperoleh untuk sukrosa dalam periode waktu yang diuji secara absolut dan
dibandingkan dengan manitol dan MF NP tanpa krioprotektan. NP dengan krioprotektan
manitol menunjukkan profil pelepasan yang serupa pada kedua nilai pH seperti tanpa
krioprotektan setelah penurunan pelepasan semburan awal.
 Data yang diperoleh dari studi pelepasan in vitro sesuai dengan beberapa model
untuk menentukan mekanisme pelepasan obat dari NP beku-kering (Tabel 3 dan
Gambar S3−S6). Kinetika pelepasan MF dari NP setelah pengeringan beku menunjukkan
yang paling cocok untuk kinetika orde pertama, dan eksponen pelepasan yang diperoleh
dari model Korsmeyer−Peppas adalah 0,45 <n <0,89, menunjukkan bahwa pelepasan
mengikuti transpor non-Fickian yang anomali.

4. KESIMPULAN
Sepengetahuan kami, ini adalah laporan pertama persiapan NP PLGA yang mengandung
MF menggunakan metode presipitasi nano. PLGA NP yang dimuat MF berhasil disiapkan
dan menunjukkan sifat fisikokimia yang memadai serta efisiensi enkapsulasi obat yang
tinggi dan konten pemuatan. Pelepasan MF in vitro dari PLGA NP di bawah kondisi pH
yang meniru lingkungan mikro mukosa hidung menunjukkan pelepasan ledakan awal
diikuti dengan fase pelepasan berkelanjutan. Kinetika pelepasan obat mengikuti
transportasi non-Fickian yang anomali, dan NP dapat diliofilisasi untuk memberikan NP
yang stabil dengan pelepasan ledakan awal yang berkurang yang dapat menguntungkan
untuk formulasi akhir. Perawatan lokal CRS dengan NP MF hidung dapat bermanfaat
dalam mengurangi dosis yang dibutuhkan secara keseluruhan, dalam meminimalkan
efek samping, dan dalam meningkatkan kepatuhan pasien. Sebagai kesimpulan, kami
berharap bahwa pelepasan MF terkontrol menggunakan NP PLGA akan menjadi
pendekatan yang menjanjikan untuk meningkatkan pengobatan lokal CRS; karenanya,
potensi mereka untuk aplikasi pengiriman melalui hidung memerlukan penyelidikan in
vitro dan in vivo lebih lanjut.