LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN SEDERHANA

Rabu, 4 Maret 2015

Kelompok II
Rabu, Pukul 10.00 – 13.00 WIB

Nama NPM
Iman Firmansyah 260110130044

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
2015

Nilai TTD
 PEWARNAAN SEDERHANA

I . Tujuan

Mengamati ukuran, bentuk dan struktur-struktur tertentu dari bakteri, dengan

menggunakan satu macam zat pewarna.

II. Prinsip

1. Teknik Aseptis
Cara kerja yang menjaga sterilitas ketika menangani pengkulturan
mikroorganisme untuk mencegah kontaminasi terhadap kultur
mikroorganisme yang diinginkan ( Siswaya, 2014 ).
2. Pewarnaan Sederhana
Mengidentifikasi morfologi sel bakteri dengan menggunakan zat warna
tunggal. pewarnaan ini hanya menggunakan satu macam zat warna saja. Zat
warna yang di gunakan adalah Methylen blue, Crystal violet, basic fuchin
atau safranin ( Sutedjo, 1991 ).
3. Ikatan Ion
Ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari
pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya
muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna ( Volk &
Wheeler, 1984 ).

III. Teori Dasar

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan

sifat-sifat yang khas begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir
tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri yang ada di
suspensikan. Salah satu cara unutk mengamati bentuk sel bakteri sehingga
mudah di identifikasi adalah dengan cara metode pengenceran atau pewarnaan.
Hal tersebut berfungsi untuk mengetahuisifat fisiologisnya yaitu mengetahui
reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecetan atau pewarnaan
(Dwidjoseputro, 2005).
 Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena
selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Unutk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri
sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik
pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi (Dwidjoseputro, 2005).

Bakteri atau mikroba lainya dapat di lihat dengan mikroskop biasa tanpa
yaitu dengan cara-cara khusus, misalnya dengan cara tetesan bergantung,
menggunakan kondensor medan gelap dan lain-lain.Tetapi pengamatan dari
pewarnaan ini lebih sukar dan tidak di pakai untuk melihat bagian-bagian sel
dengan teliti, karena sel bakteri dan mikroba lainya transparan. Melihat dan
mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu
tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil untuk mengatasi hal tersebut
maka di kembangkan suatu teknik pewarnaan bakteri ,sehingga sel dapat
terlihat jelas dan mudah di amati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri
ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Dwidjoseputro, 2005).

Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan

sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah
”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel - sel bakteri hanya
digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi
dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik
(suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan
sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan
positif) ( Pelczar, 2007 ).
Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan
mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar
dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-
sifat fisik dan kimia yang khas dari pada bakteri dengan zat warna, serta
meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya ( Pelczar, 2007 ).
 Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga
macamyaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan
struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan
menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan,
yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan
yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel
mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial ( Pelczar, 2007 ).

Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen
selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen.
Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen
seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu
pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan
sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai
serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode
pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri ( Volk &
Wheeler, 1984 ).

Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif,
salah satu di antaranya berwarna. Pada zat warna yang bersifat basa, warna
terdapatpada ion positif (zat pewarna+ Cl- ) dan pada pewarna asam, warna
akan terdapat pada ion negatif (zat pewarna- Na+ ). Hubungan antara bakteri
dengan zat pewarna basa yang menonjol disebabkan terutama oleh adanya
asam nukleat dalam jumlah besar dalam protoplasma sel. Jadi, jika bakteri itu
diwarnai, muatan negatif dalam asam nukleat bakteri akan bereaksi dengan ion
positif zat pewarna basa, Kristalviolet, safranin dan metilinblue adalah
beberapa zat pewarna basa yang biasa digunakan. Sebaliknya zat pewarna
asam ditolak oleh muatan negatif bakteri menyeluruh. Jadi, mewarnai bakteri
dengan zat pewarna asam akan menghasilkan hanya pewarnaan pada daerah
latar belakang saja. Karena sel bakteri tak berwarna di atas latar belakang yang
berwarna ( Volk & Wheeler, 1984 ).
 Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus
dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Pada
umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak
bakteri yang tidak mempunyai zat warna. Tujuan dari pewarnaan adalah untuk
mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad,
mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad
terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat
diketahui (Waluyo, 2004).

Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu

pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik
adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam
yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah
satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat
pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah
ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang
mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut
pewarna negatif ( Hadiutomo, 1990 ).

Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim,
prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal
violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang
kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam
yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo (Lay.1994).

Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini

sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada
mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentuk yang bulat (coccus), batang
(basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan
bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (streptococcus),
buah anggur ( stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang
terdiri dari 4 atau 8 (saranae) (Lay.1994).
IV. Alat dan Bahan

1. Alat :
a. Bak Pewarna.
b. Buku Gambar
c. Cawan Petri
d. Kaca Objek.
e. Kapas.
f. Kertas Saring.
g. Korek api
h. Mikroskop Majemuk.
i. Ose.
j. Pembakar Spirtus.
k. Pensil warna Merah, Biru, Ungu
l. Spidol
2. Bahan :
a. Air Suling dalam Botol Semprot.
b. Alkohol 70%.
c. Desinfektan.
d. Emersi Oil.
e. Sampel Air Liur.
f. Zat Warna Karbol Fuksin.
g. Zat Warna Metilen Biru.
3. Gambar alat :
V . Prosedur

Sampel air liur di letakkan kedalam cawan petri.Kaca objek di sterilisasi

dengan cara dicuci, lalu dimasukkan kedalam larutan desinfektan, kemudian
dimasukkan kedalam larutan alkohol 70%. Setelah kaca objek disterilisasi, di
lap menggunakan kapas sampai mengeluarkan suara berdecit. Lingkari bagian
bawah kaca objek dengan spidol sebagai area untuk pengolesan sampel
bakteri. Ose difiksasi dengan cara dibakar dengan pembakar spirtus sampai
ose berpijar. Ose didinginkan dengan cara didekatkan dengan pembakar
spirtus.
 Dibuat olesan bakteri dari air liur di atas kaca obyek yang bersih serta
bebas lemak dengan menggunakan ose yang sudah di fiksasi. Setelah
pengolesan, kaca objek di lewatkan di atas api pembakar spirtus sampai
sampel di atas kaca objek berubah warna menjadi pucat (keputih – putihan).
Kemudian letakkan kaca objek di atas bak warna, genangi olesan tersebut
dengan salah satu warna (Metilen biru, Karbol fuksin). Biarkan olesan
terwarnai selama 2 menit untuk metilen biru, 5 menit untuk karbol fuksin.
Tuangkan zat warna berlebih dari preparat, lalu bilas dengan aquades sampai
air bilasan berwarna pucat. Keringkan kaca objek dengan kertas saring.
Teteskan sedikit emersi oil pada kaca objek, lalu periksa dibawah mikroskop
dengan perbesaran 40X dan 100X. Amati dan gambar hasilnya.

VI. Data Pengamatan

No Keterangan Hasil

1 Sampel air liur dengan

pewarna karbol fuksin pada
pembesaran mikroskop 40X.

Bakteri berbentuk coccus.

 2. Sampel air liur dengan
pewarna karbol fuksin pada
pembesaran mikroskop 100X.

Bakteri berbentuk coccus.

3. Sampel air liur dengan

pewarna metilen biru pada
pembesaran mikroskop 100X.

Bakteri berbentuk basil.

VII. Pembahasan

Bakteri umumnya tidak memiliki pigmen, sehingga tidak berwarna

dan hampir tidak terlihat karena tidak kontras dengan media dimana
mereka hidup. Oleh karena itu, perlu dilakukan pewarnaan agar bakteri
tampak jelas bila diamati dengan mikroskop.

Pada praktikum kali ini dilakukan pewarnaan bakteri berupa

pewarnaan sederhana. Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang
paling umum digunakan. Berbagai macan tipe morfologi bakteri seperti
coccus, bacillus, dan sebagainya dapat dibedakan dengan menggunakan
pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya menggunakan
satu macam zat warna saja.
 Hal pertama yang dilakukan adalah sterilisasi kaca objek dengan
cara di celupkan kedalam larutan desinfektan kemudian dicelupkan
kedalam alkohol 70%. Sterilisasi bertujuan untuk memusnahkan atau
mengeliminasi semua mikroorganisme termasuk spora bakteri yang
resisten dalam alat yang akan digunakan. Setelah melakukan sterilisasi,
kemudian melakukan olesan bakteri pada kaca objek, tetapi sebelumnya
ose di fiksasi di api pada pembakar spiritus yang bertujuan untuk
mematikan bakteri dengan cepat pada ose, supaya tidak tercampur dengan
bakteri yang akan di uji. Sebelum melakukan pengolesan bakteri kaca
objek di beri tanda lingkaran di bawahnya sebagai tanda area untuk
melakukan pengolesan sel bakteri dari suspensi. Pada percobaan kali ini
pengolesan di lakukan dengan sampel air liur menggunakan pewarna
karbol fuksin dan metilen biru.

Kemudian melakukan pengolesan pada kaca objek dengan salah satu

sampel air lieur, setelah itu di fiksasi di atas api dengan cara di lewat –
lewatkan tidak terlalu dekat api supaya bakteri tidak mati. Fiksasi dalam
tahap ini bertujuan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak
struktur selnya, mempermudah pengecetan,dan sediaan tahan untuk
disimpan jika belum sempat dicat.

Kaca objek yang sudah dioleskan bakteri kemudian di simpan di atas

bak warna lalu di teteskan pewarna karbol fuksin dan diamkan selama 5
menit supaya warna menyerap masuk ke sel bakteri. Karbol fuchsin
merupakan pewarna dasar, yang mengandung fenol untuk membantu
melarutkan dinding sel.

Setelah 5 menit olesan bakteri yang telah terwarnai di bilas dengan

aquades. Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan
pembilasan terhadap kaca objek dengan menggunakan aquades. Pembilasan
ini bertujuan untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang
diberikan.
 Objek yang telah dibasuh aquades kemudian dikeringkan dengan
menggunakan kertas saring, tidak ditiup-tiup karena dikhawatirkan ada
bakteri lain yang menempel pada objek glass.

Kemudian olesan di tetesi emersi oil sebanyak satu tetes. Minyak

emersi adalah minyak yang di pakai untuk olesan pada mikroskop, yang
fungsinya untuk memperjelas objek, dan melindungi mikroskop. Minyak
emersi memiliki indeks refraksi yang tinggi dibandingkan dengan air,
sehingga objek yang kita amati dapat terlihat lebih jelas dibandingkan
dengan tanpa minyak emersi. Lalu diamati dengan mikroskop pada
pembesaran 40X dan 100X.

Dari hasil pengamatan mikroskop sampel air liur yang menggunakan

pewarna karbol fuksin didapatkan morfologi bakteri berbentuk coccus
(bulat).

Kemudian percobaan selanjutnya menggunakan pewarna metilen

biru, step – step yang digunakan sama seperti percobaan yang menggunakan
pewarna karbol fuksin hanya yang berbeda dari segi pemberian warna.
Metilen biru adalah pewarna yang biasa di pakai dalam pewarnaan umum.
Biasanya hanya untuk membedakan sel bakteri dengan latar belakangnya.
Metilen biru memberi warna biru cerah yang bisa bergradasi dari biru muda
sampai biru agak tua seperti pada hasil pengamatan.

Dari hasil pengamatan mikroskop sampel air liur yang menggunakan

pewarna metilen biru di dapatkan morfologi bakteri berbentuk basil
(batang).

Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara
komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang
disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarnanya.

Pewarna karbol fuksin dan metilen biru termasuk kedalam

pewarnaan basa. Pewarnaan asam yaitu pewarnaan yang menggunakan satu
 macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk selnya saja.
Pewarna basa bisa terjadi bila senyawa pewarna bersifat positif, sehingga
akan diikat oleh dinding sel bakteri dan sel bakteri ini jadi berwarna dan
terlihat. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna - pewarna
sederhana, karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa)
sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan
positif). Kromofor merupakan bagian yang berperan dalam memberikan
warna.

VIII. Simpulan

Dapat mengamati ukuran, bentuk dan struktur – struktur tertentu

dari bakteri, yang menggunakan satu macam zat warna dengan hasil
morfologi bakteri berbentuk coccus yang menggunakan zat warna karbol
fuksin dan bentuk basil yang menggunakan zat warna metilen biru.
 DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D.2005.Dasar - Dasar Mikrobiologi.Malang: Penerbit Djambatan.

Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga.

Lay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta : Rajawali.

Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press.

Siswaya,Yoanne.2014.Teknik Kultur Secara Aseptik. Tersedia online di

http://www.academia.edu/6138539/Praktikum_2 [Diakses pada tanggal 8
Maret 2015]

Sutedjo, M.1991. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : Rhineka Cipta.

Volk & Wheeler. 1984. Mikrobiologi Dasar Edisi Kelima Jilid I. Jakarta :
Erlangga

Waluyo, Lud. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.