RTM PRODUK BIOTEKNOLOGI FARMASI

“THEURAPEUTIC HORMONES : INSULIN”

OLEH

KELOMPOK 2 / A5D

 
1.        Ni Putu Laras Ayu Ningrat      (201021099)
2.        Ni Putu Meysa Yanti               (201021100)
3.        Ni Putu Noviana Dewi             (201021101)
4.        Ni Putu Ratih Wulandari         (201021102)

 
Dosen Pengampu : I Gusti Ngurah Agung Windra W. P, S. Farm., M.Sc., Apt

 
PROGRAM STUDI FARMASI KLINIS
FAKULTAS ILMU-ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS BALI INTERNASIONAL
DENPASAR
2022

1
 KATA PENGANTAR

Puja dan puji syukur dihaturkan kepada Ida Sang Hyang Widhi Wasa (Tuhan Yang Maha
Esa) karena atas rahmat dan karunia-Nya, penulis dapat menyelesaikan makalah ini tepat pada
waktunya.

Makalah Rancangan Tugas Mahasiswa (RTM) dengan judul “Produk Bioteknologi

Farmasi” ini disusun dalam rangka melengkapi tugas akademik mata kuliah Bioteknologi
Farmasi pada Semester kelima (5) tahun akademik 2022/2023. Adapun tujuan penyusunan
makalah ini adalah untuk memperdalam pengetahuan dan pemahaman mengenai “Produk 
Bioteknologi Farmasi”

Di dalam menyelesaikan makalah ini, penulis mengalami hambatan dan berbagai

kesulitan sebagai akibat kurangnya pengalaman menyusun makalah. Berkat semangat dan kerja
keras, hambatan tersebut dapat diatasi. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih
kepada yang telah membantu, terutama pengampu mata kuliah Bioteknologi Farmasi. Penulis
menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari kata sempurna, oleh karena itu segala tanggapan
kritik dan saran perbaikan akan diterima dengan rendah hati untuk menyempurnakan makalah
berikutnya. Akhirnya penulis berharap, semoga makalah ini ada manfaatnya.

                                                                     Denpasar, 11 November 2022

                                                                                                     Penulis

                                                                                                                                

2
 DAFTAR ISI

COVER………………………………………………………………………………...1

KATA PENGANTAR………………………………………………………………..2

DAFTAR ISI…………………………………………………………………………..3

BAB I PENDAHULUAN…………………………………………………………….4

1.1. Latar belakang……………………………………………………………………4

1.2. Rumusan Masalah………………………………………………………………..6

1.3. Tujuan Penulisan…………………………………………………………………6

1.4. Manfaat Penulisan………………………………………………………………..6

BAB II PEMBAHASAN……………………………………………………………...7

2.1. Definisi Insulin…………………………………………………………………….7

2.2. Struktur Insulin…………………………………………………………………...8

2.3. Dosis Insulin……………………………………………………………………….8

2.4. Up Stream Process Insulin……………………………………………………….9

2.5. Down Stream Process Insulin……………………………………………………13

2.6. Analisis Kemurnian Protein……………………………………………………...19

BAB III PENUTUP…………………………………………………………………...20

3.1.Kesimpulan………………………………………………………………………...20

3.2.Saran……………………………………………………………………………….20

DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………………………21

3
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1.Latar belakang

Bioteknologi adalah bidang penerapan biosains dan teknologi yang menyangkut

penerapan praktis organisme hidup atau komponen sub sellulernya pada industri jasa
dan manufaktur serta pengelolaan lingkungan. Atau dapat pula didefinisikan sebagai
teknologi yang menggunakan sistem hayati (proses-proses biologi) untuk
mendapatkan barang dan jasa yang berguna bagi kesejahteraan manusia. Bioteknologi
memanfaatkan: bakteri, ragi, kapang, alga, sel tumbuhan atau sel hewan yang
dibiakkan sebagai konstituen berbagai proses industri (Sutarno,2016).

Pada umumnya bioteknologi dibedakan menjadi bioteknologi tradisional dan

modern. Bioteknologi tradisional adalah bioteknologi yang memanfaatkan mikrobia
(organisme) untuk memodifikasi bahan dan dan lingkungan untuk memperoleh
produk optimal. Misalnya pembuatan tempe, tape, roti, pengomposan sampah.
Sedangkan bioteknologi modern dilakukan melalui pemanfaatan keterampilan
manusia dalam melakukan manipulasi makhluk hidup agar dapat digunakan untuk
menghasilkan produk sesuai yang diinginkan manusia. Misalnya melalui teknik
rekayasa genetik. Rekayasa genetik merupakan teknik untuk menghasilkan molekul
DNA yang berisi gen baru yang diinginkan atau kombinasi gen-gen baru atau dapat
dikatakan sebagai manipulasi organisme (Nurcahyo, 2011).

Munculnya teknologi DNA rekombinan (rDNA) dan penggunaannya di industri

farmasi telah membawa pertumbuhan pesat bagi perusahaan bioteknologi dan
sejumlah produk rDNA terapeutik tersedia untuk manusia. Teknologi rekombinan
DNA (rDNA) telah membuat dampak revolusioner di bidang perawatan kesehatan
manusia dengan memungkinkan produksi massal produk ekspresi rDNA yang aman,
murni dan efektif (Nurcahyo, 2011) Bioteknologi modern tidak terlepas dengan

4
 aplikasi metode-metode mutakhir bioteknologi (current methods of biotecnology)
seperti : (Nurcahyo, 2011)

1. Kultur jaringan merupakan suatu metode untuk memperbanyak jaringan/sel yang

berasal atau yang didapat dari jaringan orisinal tumbuhan atau hewan setelah terlebih
dahulu mengalami pemisahan (disagregasi) secara mekanis, atau kimiawi (enzimatis)
secara in vitro (dalam tabung kaca).

2. Teknologi DNA rekombinan (recombinant DNA technology) adalah suatu metode

untuk merekayasa genetik dengan cara menyisipkan (insert) gen yang dikehendaki ke
dalam suatu organisme. Transgenik adalah suatu metode untuk. Rekayasa protein
(protein engineering).

3. Kloning adalah suatu metode untuk menghasilkan keturunan yang dikehendaki sama
persis dengan induknya.

4. Polymerase chains reaction (PCR) merupakan metode yang sangat sensitif untuk
mendeteksi dan menganalisis sekuen asam nukleat. RT-PCR untuk memperbanyak
(amplifikasi) rantai RNA menjadi DNA; tissue/cells → extracted → RNA/mRNA →
rT-PCR → copy DNA (cDNA).

 5. Hibridisasi DNA adalah metode untuk menyeleksi sekuen DNA dengan menggunakan
probes DNA untuk hibridisasi (pencangkokan) rantai DNA Pita ganda.

Terapi hormon adalah metode terapi pengobatan yang dilakukan untuk mengatasi
kondisi medis yang berhubungan dengan gangguan hormonal. Biasanya, terapi ini
digunakan untuk menjaga kadar hormon tetap terkendali dan membantu pengobatan
penyakit yang disebabkan oleh ketidakseimbangan hormon dalam tubuh
(Berenson,2012).

Insulin adalah hormone alami yang dikeluarkan oleh pankreas. Insulin dibutuhkan
oleh sel tubuh untuk mengubah dan menggunakan glukosa darah (gula darah), dari
glukosa, sel membuat energi yang dibutuhkan untuk menjalankan fungsinya. Pasien
diabetes mellitus tidak memiliki kemampuan untuk mengambil dan menggunakan

5
 gula darah, sehingga kadar gula darah meningkat. Insulin diberikan dengan cara
disuntikan di bawah kulit (subkutan). Jaringan subkutan perut adalah yang terbaik
karena penyerapan insulin lebih konsisten dibanding tempat lainnya. Terdapat banyak
bentuk insulin. Insulin diklasifikasikan berdasarkan dari berapa cepat insulin mulai
bekerja dan berapa lama insulin bekerja (Berenson,2012).

1.2. Rumusan Masalah

1.2.1. Apa pengertian dari insulin?

1.2.2. Bagaimana up stream process dari insulin?

1.2.3. Bagaimana down stream process dari insulin?

1.2.4. Bagaimana analisis kemurnian protein dari insulin?

1.3. Tujuan Penulisan

1.3.1. Agar mengetahui pengertian dari insulin

1.3.2. Agar mengetahui up stream process dari insulin

1.3.3. Agar mengetahui down stream process dari insulin

1.3.4. Agar mengetahui analisis kemurnian protein dari insulin 

1.4. Manfaat Penulisan

1.4.1. Agar mahasiswa dapat mengetahui pengertian dari insulin

1.4.2. Agar mahasiswa dapat mengetahui up stream process dari insulin

1.4.3. Agar mahasiswa dapat mengetahui down stream process dari insulin

1.4.4. Agar mahasiswa dapat mengetahui analisis kemurnian protein dari insulin

6
 BAB II

PEMBAHASAN

2.1. Definisi Insulin

Insulin berasal dari bahasa latin insula, “pulau”, karena diproduksi di pulau-pulau
langerhans di pankreas adalah sebuah hormon polipeptida yang mengatur
metabolisme karbohidrat. Insulin merupakan suatu protein berukuran kecil dengan
berat molekul 5808 pada manusia. Insulin mempunyai peran yang sangat penting dan
luas dalam pengendalian metabolisme. Insulin yang disekresikan oleh sel sel β
pankreas akan langsung di infusikan kedalam hati melalui vena porta, yang kemudian
akan didistribusikan keseluruh tubuh melalui peredaran darah. Efek kerja insulin yang
sudah sangat dikenal adalah membantu transport glukosa dari darah kedalam sel
(Katzung, 2000).

Insulin adalah hormone alami yang dikeluarkan oleh pankreas. Insulin dibutuhkan
oleh sel tubuh untuk mengubah dan menggunakan glukosa darah (gula darah), dari
glukosa, sel membuat energi yang dibutuhkan untuk menjalankan fungsinya. Pasien
diabetes mellitus tidak memiliki kemampuan untuk mengambil dan menggunakan
gula darah, sehingga kadar gula darah meningkat. Pada diabetes tipe I, pancreas tidak
dapat memproduksi insulin. Sehingga pemberian insulin diperlukan pada diabetes tipe
2, pasien memproduksi insulin, tetapi sel tubuh tidak merespon insulin dengan
normal. Namun demikian, insulin juga digunakan pada diabetes tipe 2 unmk
mengatasi resistensi sel terhadap insulin. Dengan peningkatan pengambilan glukosa
oleh sel dan menurunnya kadar gula darah, akan mencegah dan mengurangi
komplikasi lebih lanjut dari diabetes, seperti kerusakan pembuluh darah, mata, ginjal,
dan saraf. Insulin diberikan dengan cara disuntikan di bawah kulit (subkutan).
Jaringan subkutan perut adalah yang terbaik karena penyerapan insulin lebih
konsisten dibanding tempat lainnya. Terdapat banyak bentuk insulin. Insulin
diklasifikasikan berdasarkan dari berapa cepat insulin mulai bekerja dan berapa lama
insulin bekerja (Berenson,2012).

7
2.2. Struktur Insulin

Insulin merupakan hormone peptide yang disekresikan oleh sel β dari Langerhans
pancreas. Fungsi insulin adalah untuk mengatur kadar normal glukosa darah. Insulin
bekerja melalui memperantarai uptake glukosa seluler, regulasi metabolism karbohidrat,
lemak, dan protein, serta mendorong pemisahan dan pertumbuhan sel melalui efek
motigenik pada insulin (Wilcox, 2005). 

Gambar 1. Struktur Insulin

Insulin memiliki struktur dipeptida, yang terdiri dari rantai A dan B. Kedua rantai
ini dihubungkan dengan jembatan sulfide yang menghubungkan struktur helix terminal
N-C dari rantai A dengan struktur central helix dari rantai B. Insulin mengandung 51
asam amino, dengan berat molekul 5802. Rantai A terdiri dari 21 asam amino dan rantai
B terdiri dari 30 asam amino (Wilcox, 2005).

2.3. Dosis Insulin

Dosis insulin disesuaikan untuk setiap individu, dengan cara meningkatkan dosis
secara bertahap tetapi dengan tetap menghindarkan terjadinya hipoglikemia. Ada 3
macam sediaan insulin:

1. Insulin kerja singkat (short-acting): mula kerja relatif cepat, yaitu insulin soluble,
insulin lispro dan insulin aspart;
2. Insulin kerja sedang (intermediate-acting): misalnya insulin isophane dan suspensi
insulin seng;
3. Insulin kerja panjang dengan mula kerja lebih lambat: misalnya suspensi insulin seng.

8
 Lama kerja untuk tiap tipe insulin bervariasi pada tiap individu sehingga perlu
dinilai secara individual.

Contoh dosis insulin yang dianjurkan sebagai berikut : 

 Insulin kerja singkat dikombinasi dengan insulin kerja sedang: dua kali sehari
(sebelum makan);
 Insulin kerja singkat dikombinasi dengan insulin kerja sedang: sebelum makan pagi
Insulin kerja singkat: sebelum makan malam Insulin kerja sedang: malam sebelum
tidur;
 Insulin kerja singkat: 3 kali sehari (sebelum makan pagi, makan siang dan makan
malam) dikombinasi dengan insulin kerja sedang: pada waktu sebelum tidur malam;
 Insulin kerja sedang dengan atau tanpa insulin kerja singkat: cukup sekali sehari
sebelum makan pagi atau sebelum tidur malam untuk beberapa pasien dengan
diabetes tipe 2 yang memerlukan insulin, kadang-kadang dikombinasi dengan obat
hipoglikemik oral.

Kebutuhan insulin meningkat dengan adanya infeksi, stres, kecelakaan atau

trauma bedah, pubertas dan selama kehamilan trimester 2 dan 3. Kebutuhan mungkin
menurun pada pasien dengan gangguan fungsi ginjal (lampiran 3) atau gangguan fungsi
hati dan pada beberapa pasien gangguan endokrin (misalnya Addison’s disease,
hipopituarism) atau celiac disease. Selama menyusui, dosis insulin perlu disesuaikan,
pada wanita hamil kebutuhan insulin sebaiknya sering dinilai ulang oleh dokter spesialis
endokrinologi yang berpengalaman.

2.4. Up Stream Process Insulin

2.4.1 Host
Sistem insulin dapat dipengaruhi oleh perubahan sintesis pada tingkat transkripsi
gen, translasi, dan modifikasi pasca-translasi di Golgi serta oleh faktor-faktor yang
mempengaruhi pelepasan insulin dari butiran sekretori. Modifikasi jangka panjang dapat
terjadi melalui pengaruh pada massa dan diferensiasi sel β.11 Mengingat peran penting

9
insulin dalam pemanfaatan dan metabolisme glukosa, tidak mengherankan bahwa glukosa
memiliki banyak pengaruh pada biosintesis dan sekresi insulin. Namun, faktor lain seperti
asam amino, asam lemak, asetilkolin, polipeptida pengaktif adenilat siklase hipofisis
(PACAP), polipeptida insulinotropik yang bergantung pada glukosa (GIP), glukagon-like
peptide-1 (GLP-1), dan beberapa agonis lainnya, bersama-sama dalam kombinasi, juga
mempengaruhi proses ini.

2.4.2 Sumber Gen

Sumber gen dari insulin adalah hormon alami yang diproduksi oleh pankreas.
Ketika kita makan, pankreas melepaskan hormon insulin yang memungkinkan tubuh
mengubah glukosa menjadi energi dan disebarkan di seluruh tubuh. Hormon yang satu ini
juga membantu tubuh menyimpan energi tersebut.
Selama pankreas memproduksi cukup hormon insulin dan tubuh dapat
menggunakannya dengan benar, maka kadar gula darah pasti akan selalu berada dalam
kisaran yang sehat. Karena pada hakikatnya, kadar glukosa yang terlalu banyak atau
terlalu sedikit tidak baik bagi kesehatan.
Apabila pankreas tidak menghasilkan hormon yang cukup atau sel-sel tubuh
menjadi kebal terhadap insulin, kadar gula darah bisa melonjak (hiperglikemia). Kadar
gula darah yang tinggi lama-kelamaan akan menimbulkan penyakit gula darah, seperti
diabetes melitus.

2.4.3 Mekanisme Kloning

Kloning sebenarnya memiliki arti yang sangat penting untuk menghasilkan
organisme baru yang unggul. Kemajuan kloning pada tumbuhan dan hewan disambut
baik oleh umat manusia. Tetapi pada saat kloning berkembang dan mulai menuju kloning
terhadap manusia, mulai muncul berbagai pendapat dan perdebatan yang terjadi
dikalangan ilmuan, politisi, masyarakat, dan tokoh agama. Ada yang mendukung dan ada
pula yang menolak adanya kloning pada manusia. Berbagai kalangan yang mendukung
beralasan keberhasilan kloning gen pada manusia dapat menghasilkan sel, jaringan, dan
organ yang dapat digunakan untuk mengobati berbagai penyakit, seperti diabetes dan
leukimia.

10
 Kloning adalah suatu teknik reproduksi secara aseksual yang menggunakan sel
tubuh (sel somatis) makhluk hidup. Kloning didasarkan pada konsep bahwa sel makhluk
hidup bersifat totipotensi, yaitu kemampuan setiap sel yang darimana saja sel tersebut
diambil apabila diletakkan dilingkungan yang sesuai akan tumbuh menjadi individu baru
yang sempurna. Kloning berasal dari bahasa Yunani Kuno, yaitu Clone yang artinya
ranting atau cangkokan. Istilah  Clone atau klona pertama kali diusulkan pada tahun 1903
oleh Herbert Webber.
Kloning gen atau molekuler adalah sekelompok salinan gen, bersifat identik yang
direplikasi dari satu gen dan dimasukkan kedalam sel inang. Kloning gen merupakan
suatu terobosan baru, dengan tujuan untuk mendapatkan sebuah gen yang mungkin
dibutuhkan bagi kehidupan manusia. Kloning gen meliputi serangkaian proses isolasi
fragmen DNA spesifik dari genom suatu organisme, penentuan sekuen atau fragmen
DNA, pembentukan molekul DNA rekombinan, dan ekspresi gen target dalam sel inang.
Langkah – Langkah Kloning Gen adalah sebagai berikut:
1. Penentuan sekuen atau fragmen DNA untuk memastikan fragmen DNA yang diisolasi
adalah gen target sesuai dengan kehendak kita.
2. Pemotongan DNA sumber gen dan vektor kloning menggunakan enzim restriksi
3. Menyisipkan potongan DNA sumber gen ke dalam vektor kloning yang telah dipotong
dan disambung dengan bantuan enzim DNA ligase
4. Hasil DNA rekombinan kemudian ditransformasi ke dalam sel inang (biasanya sel
bakteri, misalnya strain E.coli walaupun sel jenis lain dapat di gunakan) untuk diproduksi
lebih banyak.
5. Selanjutnya dilakukan proses pra Inkubasi, dimana sel E.coli calon penerima plasmid
dipaparkan kepada ion positif kalsium klorida (CaCl2). Perlakuan ini dilakukan agar
membran sel dan dinding sel bakteri E.coli menjadi permeable terhadap plasmid donor.
Sehingga sel bakteri E.coli akan menjadi “kompeten” untuk  dapat menerima plasmid.
6. Pada proses inkubasi plasmid ditambahkan ke dalam suspensi sel E.coli kompeten.
Suspensi sel E.coli kompeten lainnya yang tidak ditambah plasmid sebagai kontrol.
7. Sel kompeten (baik yang diberi plasmid maupun sebagai kontrol) dipaparkan sejenak
selama 90 detik pada suhu 42oC. Langkah ini dilakukan dengan tujuan untuk dapat
memaksimumkan masuknya plasmid menembus membran dan dinding sel.

11
8. Selanjutnya adalah proses penyembuhan (Recovery). Sel-sel kompeten (baik yang diberi
plasmid maupun sebagai kontrol) ditumbuhkan dalam sebuah medium kaya nutrisi untuk
memberi kesempatan proses penyembuhan pada sel bakteri setelah mengalami cekaman
dan kejutan. Masa penyembuhan berlangsung satu waktu generasi (untuk E. coli berkisar
antara 30 hingga 45 menit)
9. Di dalam sel inang, vektor melakukan replikasi yang dapat menghasilkan banyak turunan
identik, baik vektornya sendiri maupun gen yang dibawanya (gen target).
10. Ketika sel inang melakukan pembelahan, salinan molekul DNA rekombinan diwariskan
pada progeni dan terjadi proses replikasi vektor selanjutnya.
11. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka akan dihasilkan koloni atau klon sel
inang yang identik.
12. Setiap sel dalam klon mengandung satu salinan atau lebih molekul DNA rekombinan;
sehingga dapat dikatakan bahwa gen yang dibawa oleh molekul DNA rekombinan telah
diklon.
13. Gen target yang ada di dalam sel inang jika diekspresikan akan menghasilkan produk gen
yang kita inginkan

2.4.4 Ekspresi Gen

Ekspresi gen adalah rangkaian proses penggunaan informasi dari suatu gen untuk
sintesis produk gen fungsional. Produk-produk tersebut dapat berupa protein, juga gen
penyandi non-protein seperti transfer RNA (tRNA) atau gen RNA inti kecil (snRNA)
yang mana keduanya merupakan produk RNA fungsional.

2.4.5 Proses Fermentasi

Proses  Fermentasi, pada proses ini, media fermentasi disiapkan dalam tangki
stainless steel (V- 101) dan disterilisasikan di heat sterilizer (ST-lOI). Kompresor (G-lOI)
dan filter (AF-lOI) berguna untuk mengalirkan udara dan amonia menuju fermentor (V-
102). Dalam fermentor terdapat bakteri E. coli untuk menghasilkan Trp-proinsulin
(Tryptophan-proinsulin). Waktu fermentasi adalah 18 jam dengan suhu 37°C. Trp-
proinsulin berakumulasi ke dalam sel E. coli sebagai IB's (Inclusion Body). Pada kondisi
awal, diasumsikan jumlah IB's sebesar 20 % dari total berat kering.

12
2.5. Down Stream Process Insulin

2.5.1 Pemisahan Protein Dengan Sel

Adapun teknik pemisahan protein insulin yaitu: 
1. Pembelahan sianogen bromida (CNBr) 
Dalam terjemahan protein E. coli, protein rekombinan harus diterjemahkan
sebagai protein fusi di mana ekstensi N-terminal menyediakan inisiator N-
formylmethionine (fMet) (Laursen et al. 2005). fMet adalah metionin termodifikasi
yang digunakan sebagai asam amino pertama di sebagian besar protein bakteri.
Karena fMet dikenali oleh sistem kekebalan manusia sebagai benda asing, penting
untuk menghilangkannya untuk menghindari reaksi imunogenik yang tidak
diinginkan. Untuk menghapus urutan sinyal, penghubung metionin proinsulin dapat
dibelah dengan sianogen bromida (CNBr) sebelum pemurnian. Singkatnya, proses ini
melibatkan suspensi sampel protein dalam asam format 70% dan inkubasi dengan
CNBr pada suhu kamar dalam kegelapan selama 12-16 jam (Cowley dan Mackin
1997; Mackin dan Choquette 2003; Petrides et al. 1995). Kerugian dari metode ini
adalah spesifisitas pembelahan yang rendah, penguapan CNBr yang berkepanjangan,
toksisitas dan volatilitas CNBr yang tinggi, dan kemungkinan modifikasi kimia dari
produk yang dilepaskan (Mackin dan Choquette 2003). Metode alternatif
menggunakan protease protein untuk membelah protein fusi, meskipun kita harus
berhati-hati untuk memastikan bahwa protease membelah di tempat yang benar untuk
menghilangkan peptida fusi terminal-N.
2. Pertukaran penyangga 
Beberapa reagen yang digunakan dalam ekstraksi protein, preparasi sampel, dan
pemurnian mungkin memiliki efek merugikan pada fungsi dan stabilitas protein. Ini
dapat mengganggu proses hilir berikutnya. Oleh karena itu, perlu untuk
menghilangkan atau mengurangi kontaminan ini menggunakan satu atau lebih metode
pembersihan protein. Tujuannya adalah untuk membuat sampel protein yang
diekstraksi atau dimurnikan kompatibel dengan aplikasi hilir berikutnya. Di sini, kami
membahas penggunaan teknik pertukaran buffer (yaitu, dialisis, diafiltrasi, dan
kromatografi eksklusi ukuran) dalam produksi insulin/analog manusia. 

13
3. Dialisis 
Dialisis adalah metode tradisional untuk menghilangkan garam atau pertukaran
buffer, menggunakan tekanan osmotik untuk mendorong zat terlarut melintasi
membran (Merck Millipore 2021). Kerugian utama dari dialisis adalah waktu yang
lama untuk menyelesaikan pertukaran dan membutuhkan area membran permukaan
yang besar untuk pertukaran. Namun cocok untuk protein sensitif yang mudah
mengendap. Dalam skala laboratorium, larutan yang mengandung badan inklusi yang
mengandung proinsulin terlarut dapat didialisis untuk menghilangkan urea (Nilsson et
al. 1996).
4. Diafiltrasi 
Diafiltrasi mencapai penghilangan garam atau pertukaran buffer melalui
penggunaan gaya sentrifugal atau tekanan eksternal lainnya untuk mendorong zat
terlarut mikro kecil melalui membran berpori (Merck Millipore 2021). Membran
tidak memungkinkan zat terlarut makro yang lebih besar dari ukuran pori untuk
melewatinya. Keuntungan utama diafiltrasi terletak pada kemampuannya untuk
memekatkan sampel protein. Dalam industri, diafiltrasi diterapkan setelah langkah-
langkah reaksi utama untuk menghilangkan reagen yang mengganggu. Misalnya,
diafiltrasi diterapkan setelah pelarutan tubuh inklusi dan reaksi sulfitolisis untuk
menghilangkan konsentrasi tinggi reagen urea dan sulfitolisis (Petrides et al. 1995).
Selain itu, sampel yang direnaturasi dapat dipekatkan dan buffer ditukar dengan
diafiltrasi menjadi buffer yang sesuai untuk terjadinya konversi enzimatik (Astolfi et
al. 2004). 
5. Kromatografi pengecualian ukuran (SEC) 
Metode ketiga untuk menghilangkan garam dan pertukaran buffer adalah untuk:
menggunakan kromatografi eksklusi ukuran (SEC), juga dikenal sebagai
kromatografi filtrasi gel. SEC memisahkan molekul menurut ukuran relatifnya
(Pharmacia Biotech 2021). Menggunakan teknik pemisahan kelompok, molekul
kecil, seperti garam, dapat dipisahkan dari peptida yang lebih besar. SEC adalah
alternatif yang lebih cepat untuk dialisis, dan membutuhkan faktor pengenceran yang
rendah. Untuk produksi insulin/analog manusia, resin Sephadex G-25 telah banyak
digunakan dalam desalting. Ini berguna untuk menghilangkan garam dan kotoran

14
kecil lainnya dari molekul dengan massa molekul di atas 5000 Da (Cytiva 2021).
Penggunaan Sephadex G-25 untuk pertukaran buffer telah dilaporkan setelah reaksi
sulfitolisis (Cowley dan Mackin 1997) dan sebelum renaturasi proinsulin (Astolfi et
al. 2004; Cowley dan Mackin 1997). Ada juga laporan yang menggunakan Sephadex
G-25 setelah lisis, tetapi media filtrasi gel menjadi sangat terkontaminasi dengan
bahan yang tidak dapat dikromatografi sehingga dibuang setelah setiap percobaan
(Mackin 1999). Dimungkinkan juga untuk menggunakan Sephadex G-25 setelah
langkah pemolesan RP-HPLC untuk menukar buffer sampel dan untuk
menghilangkan sisa asetonitril (Zieliński et al. 2019). Bio-Gel P2 digunakan untuk
menghilangkan asam format dan sisa sianogen bromida setelah pembelahan protein
fusi (Mackin dan Choquette 2003).
6. Kromatografi afinitas (AC) 
AC adalah teknik pemisahan berdasarkan interaksi pengikatan spesifik antara
ligan yang tidak bergerak dan pasangan pengikatnya. Tergantung pada spesifisitas
interaksi, tingkat pemurnian bisa sangat tinggi. Beberapa penggunaan AC yang
dilaporkan dalam pemurnian proinsulin disajikan pada Tabel 6. Agar AC dapat
bekerja, tag fusi yang sesuai harus menyatu dengan molekul proinsulin. Tabel 7
memberikan daftar tag fusi yang diadopsi dalam berbagai skema pemurnian insulin
dan kelebihannya. Polyhistidine tag adalah tag fusi yang paling sering diadopsi
dalam produksi insulin. Untuk penangkapan afinitas dari proinsulin bertanda-Nya,
biasanya digunakan kolom nikel dengan elusi imidazole. Pemuatan sampel di
hadapan rendah konsentrasi imidazol dan konsentrasi sedang tion garam secara
signifikan mengurangi pengikatan nonspesifik mengkontaminasi protein (Mackin
1999). Sebagai konsentrasi tinggi- tras urea kompatibel dengan logam amobil
kromatografi afinitas ion (IMAC), berguna untuk memurnikan proinsulin
terdenaturasi dari badan inklusi. Tag fusi yang dirancang dengan baik diinginkan
untuk proses hulu dan hilir. Selain fungsi yang jelas untuk pemurnian, tag fusi dapat
meningkatkan stabilitas insulin/analog manusia rekombinan. Hal ini sangat berguna
mengingat bahwa proinsulin adalah peptida panjang pendek dan rentan terhadap
degradasi (Min et al. 2011).

15
7. Kromatografi penukar-lon (lon-exchange chromatography (IEX)) 
IEX melibatkan pemisahan molekul terionisasi berdasarkan muatan totalnya.
Karena insulin/analog manusia dan prekursornya memiliki gugus anionik dan
kationik, dimungkinkan untuk menggunakan kromatografi penukar anion (AEX)
dan/atau kromatografi penukar kation (CEX) untuk pemurnian. Muatan negatif yang
signifikan dari protein fusi tersulfonasi S dapat mengikat kuat ke AEX. Namun,
pengotor non-protein bermuatan negatif seperti asam nukleat juga dapat bersaing
untuk mengikat. Oleh karena itu, dalam beberapa kasus, penggunaan CEX
menguntungkan. Tabel 8 memberikan daftar aplikasi yang telah dilaporkan
menggunakan IEX dalam pemurnian insulin/analog manusia dan prekursornya. IEX
adalah teknik serbaguna yang dapat memurnikan prekursor insulin/insulin terlipat
atau proinsulin tersulfonasi dalam kondisi denaturasi. Umumnya, IEX diadopsi
sebagai langkah penangkapan prekursor insulin atau sebagai langkah pertama setelah
pembelahan enzimatik. Kapasitas pengikatannya yang tinggi dan kemungkinan
menyertakan beberapa langkah pencucian memungkinkan penghilangan sejumlah
besar kontaminan yang dapat mempersulit pemurnian selanjutnya. Kontaminan ini
terdiri dari pengotor sel inang (protein, DNA, endotoksin), enzim proteolitik, dan
pengotor produk yang dihasilkan selama pencernaan enzimatik. ini sebuah saya t
saya 1 tmsebuah saya t (fragmen dan miscleavage yang dipotong). 
8. Kromatografi fase terbalik (RP) 
RP melibatkan pemisahan molekul berdasarkan interaksi hidrofobik antara ligan
yang melekat pada fase diam dan molekul terlarut dalam fase gerak. Ada perbedaan
mekanisme dimana polipeptida berinteraksi dengan permukaan RP, dibandingkan
dengan molekul kecil (Carr 2016). Dalam pemisahan molekul-molekul kecil, terjadi
pembagian molekul-molekul secara terus-menerus antara fase gerak dan fase diam
hidrofobik. Di sisi lain, polipeptida terlalu besar untuk dipartisi menjadi fase diam.
"Kaki" hidrofobik dari polipeptida tetap teradsorpsi ke permukaan hidrofobik fase
diam hingga titik konsentrasi pengubah organik tertentu tercapai, dan ini akan
mendesorpsi polipeptida. Tabel 9 menyajikan aplikasi RP yang dilaporkan dalam
skema pemurnian insulin/analog manusia. RP biasanya ditempatkan setelah konversi
enzimatik dari proinsulin menjadi insulin. Setelah pencernaan enzimatik, pemurnian

16
insulin atau analog insulin biasanya memerlukan dua sampai tiga langkah pemurnian
kromatografi ortogonal. Pemurnian dengan RP melengkapi IEX dan SEC dengan
memberikan selektivitas berdasarkan perbedaan hidrofobisitas. RP biasanya
ditempatkan di akhir skema pemurnian keseluruhan (misalnya, setelah IEX) untuk
memungkinkan langkah sebelumnya menghilangkan sebagian besar pengotor terkait
sel inang. Ini akan bermanfaat dalam memperpanjang umur efektif fase diam RP
karena rentan terhadap pengotoran akibat pengikatan yang tidak dapat diubah atau
kelarutan kontaminan yang rendah (Kroeff et al. 1989). Hal ini penting karena
kemasan berbasis silika memiliki batasan pH yang mencegah penggunaan pH
ekstrem untuk pembersihan dan regenerasi kromatografi. 
9. Kromatografi mode campuran (MMC)
Dalam beberapa tahun terakhir, MMC menjadi semakin populer dalam
pemurnian insulin/analog manusia. MMC menggunakan lebih dari satu bentuk
interaksi antara fase diam dan analit untuk mencapai pemisahannya (Zhang dan Liu
2016). Beberapa mode interaksi termasuk afinitas, pertukaran ion, pengecualian
ukuran, hidroksiapatit, dan interaksi hidrofobik. Penukar ion mode campuran
memberikan selektivitas yang berbeda dibandingkan dengan penukar ion
konvensional. Ini juga memungkinkan kemungkinan pengikatan protein pada kondisi
garam tinggi, yang menghilangkan kebutuhan untuk menghilangkan garam atau
pengenceran sebelum melakukan MMC. Tabel 12 menyajikan contoh aplikasi MMC
yang dilaporkan dalam pemurnian proinsulin dan insulin/analog manusia. 
10. Presipitasi pH
Metode presipitasi telah diadopsi dalam pemrosesan hilir insulin/analog manusia
untuk pemisahan yang kasar dan cepat dari insulin/analog manusia dari pengotor
lainnya. Metode ini juga dapat digunakan untuk memekatkan protein untuk tahap
pemurnian lebih lanjut. Pemurnian dan konsentrasi protein terlarut dari badan inklusi
dapat dicapai dengan presipitasi pH. Karena protein memiliki kelarutan terendah
pada titik isoelektriknya (pl), ia akan mengendap keluar dari larutan pada titik plnya.
Setelah itu, sentrifugasi dapat dilakukan untuk memulihkan protein yang diinginkan.
Misalnya, protein fusi terlarut dapat diendapkan dengan menurunkan pH menjadi

17
5,0, disentrifugasi, dan kemudian dilarutkan kembali dalam buffer basa pada pH 8,5
untuk meningkatkan kemurnian protein terlarut (Astolfi et al. 2004).
11. Kristalisasi seng 
Dengan adanya ion seng, insulin mampu berasosiasi sendiri untuk
membentuk heksamer, di-heksamer, atau kompleks peptida insulin yang lebih besar
(Mollerup dan Frederiksen 2016). Heksamer terdiri dari tiga dimer yang terkait erat
melalui interaksi dengan dua ion seng pada intinya yang diposisikan pada sumbu tiga
kali lipat. Kemampuan insulin untuk membentuk kristal dapat digunakan dalam
skema pemurnian untuk mengisolasi insulin dari pengotor yang tidak ikut
mengkristal (Mollerup et al. 2010). Kristalisasi seng adalah metode yang nyaman dan
efisien untuk mengkonsentrasikan dan menahan insulin sementara sebelum diproses
lebih lanjut (Kroeff et al. 1989). Bentuk heksamerik juga melindungi insulin dari
degradasi fisik dan kimia selama penyimpanan (Mollerup dan Frederiksen 2016).

2.5.2 Pemurnian Protein

Dalam pemurnian proinsulin, penambahan 0,1 M sampai 0,5 M larutan seng
klorida di antara langkah-langkah pemurnian kromatografi telah dilaporkan untuk
mengendapkan protein yang dielusi (Redwan et al. 2007). Setelah decitraconylation,
larutan seng klorida 1 M ditambahkan ke sampel yang mengandung insulin dan pH
disesuaikan menjadi 5,9 untuk mengendapkan insulin (Zieliński et al. 2019).
Kristalisasi seng dapat dilakukan sesegera mungkin setelah langkah pemurnian RP
untuk menghilangkan insulin dari lingkungan asam untuk meminimalkan deamidasi
(Brange 1994).

2.5.3 Modifikasi Protein

Setelah pemurnian kromatografi akhir, produk harus dikondisikan untuk
formulasi selanjutnya menjadi produk obat yang stabil selama penyimpanan. Faktor
risiko utama yang terlibat saat menangani produk setelah pemurnian kromatografi
akhir adalah deamidasi molekul insulin dan pembentukan agregat/fibril (Brange
1994). Agregasi dapat terjadi setelah penekanan molekul dengan agitasi, pH rendah,
suhu tinggi, konsentrasi protein tinggi, kekuatan ion tinggi, dan adanya denaturan
18
 atau pelarut organik konsentrasi tinggi (Nielsen et al. 2001; Tiiman et al. 2013).
Deamidasi dapat terjadi bila ada kontak yang terlalu lama dengan kondisi asam untuk
membentuk insulin desamido A21 (Mollerup et al. 2010). Jadi, untuk mencegah
fibrilasi dan deamidasi insulin, garam sisa dan buffer dari pemurnian kromatografi
harus dihilangkan melalui kristalisasi dan liofilisasi. Kristal insulin dapat diisolasi
dengan sentrifugasi, dekantasi atau filtrasi, dan akhirnya, mereka dicuci untuk
menghilangkan kandungan seng sisa. Setelah kristalisasi seng, langkah selanjutnya
adalah pengeringan beku (Coleman et al. 2019). Produk rekombinan akan larut saat
siap dikemas (Zimmerman dan Stokell 2010).

2.6. Analisis Kemurnian Protein

19
 BAB III

PENUTUP

3.1  Kesimpulan

Insulin adalah komoditas langka, dengan permintaan global diproyeksikan

meningkat karena meningkatnya prevalensi diabetes. Sifat kronis diabetes berarti bahwa
pasien memerlukan pengobatan insulin jangka panjang, dan ini dapat menempatkan
beban keuangan yang berat pada sistem perawatan kesehatan dan individu. Oleh karena
itu sangat penting bahwa semua produsen dan pemangku kepentingan terus memainkan
peran mereka dalam membuat kemajuan lebih lanjut dalam pengembangan dan produksi
insulin rekombinan terapeutik. Sebuah tinjauan komprehensif insulin manusia
rekombinan dan pemrosesan hilir analognya melalui "rute proinsulin" dari sistem
berbasis E. coli telah disajikan. Kami telah memberikan contoh terkait tahap produksi
kritis dan membahas aspek praktis dari mengintegrasikan setiap prosedur ke dalam skema
pemurnian multimodal. Sebagaimana dibuktikan dari tinjauan ini, sejumlah besar langkah
pemurnian dan konversi diperlukan untuk memulihkan dan memurnikan produk insulin
rekombinan. Tinjauan ini dapat berfungsi sebagai panduan untuk membantu ilmuwan
proses hilir mengembangkan proses yang lebih efisien dan ekonomis untuk produksi
insulin manusia dan analognya.

3.2 Saran

Dari tugas  RTM (Rancangan Tugas Mahasiswa) yang kami buat mengenai
pembahasan Insulin ini diharapkan  bisa dikembangkan lagi untuk menambah lebih
banyak manfaatnya khususnya bagi kesehatan dan diharapkan dapat menjadi sumber
bacaan dan referensi bagi mahasiswa, penelitian dan masyarakat  untuk menambah
pengetahuan di bidang kesehatan.

20
 DAFTAR PUSTAKA

Astolf Filho S, De Lima BD, Thiemann JE, de Sousa HR, Vilela L (2004) Vector for 
expression of heterologous protein and methods for extracting recombi-nant
protein and for purifying isolated recombinant insulin. United States patent
6,699,692, 2 Mar 2004.
Brange J (1994) Stability of insulin: studies on the physical and chemical stabil-ity of 
insulin in pharmaceutical formulation. Kluwer Academic, Boston
Brange J (2012) Galenics of insulin: the physico-chemical and pharmaceutical 
aspects of insulin and insulin preparations. Springer, Berlin
Brange J, Langkjœr L (1993) Insulin structure and stability. Stability and charac-\
terization of protein and peptide drugs. Springer, Boston, pp 315–350
Berenson DF, Weiss AR, Wan ZL dan Weiss MA. 2012. Insulin analogs for the 
treatment of diabetes mellitus: therapeutic applications of protein engineering.
Ann N Y Aad Sci.
Cowley DJ, Mackin RB (1997) Expression, purifcation and characterization of 
recombinant human proinsulin. FEBS Lett 402(2–3):124–130
Cytiva (2021) Sephadex G-25 Medium. https://www.cytivalifesciences.com/en/
us/shop/chromatography/resins/size-exclusion/sephadex-g-25-medium-
p-05608#tech-spec-table. Accessed 14 Apr 2021.
Katzung, B,G. 2000. Farmakologi Dasar Dan Klinik. Edisi ke VI. Jakarta : Salemba
 Medika.
Laursen BS, Sørensen HP, Mortensen KK, Sperling-Petersen HU (2005) Initiation 
of protein synthesis in bacteria. Microbiol Mol Biol Rev 69(1):101–123
Leng C, Li Q, Wu F, Chen L, Su P (2013) Detection of the single-chain precursor 
in the production and purifcation process of recombinant human insu-
lin. Monocl Antibodies Immunodiagn Immunother 32(4):255–261
Mackin RB (1999) Streamlined procedure for the production of normal and 
altered versions of recombinant human proinsulin. Protein Expr Purif 
15(3):308–313

21
Mackin RB (2014) Alternative preparation of inclusion bodies excludes interfer-
ing non-protein contaminants and improves the yield of recombinant 
proinsulin. MethodsX 1:108–117
Mackin RB, Choquette MH (2003) Expression, purifcation, and PC1-mediated 
processing of (H10D, P28K, and K29P)-human proinsulin. Protein Expr 
Purif 27(2):210–219
Nurcahyo, H. 2011. Diktat Bioteknologi. Jurusan Pendidikan Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Negeri Yogyakarta.
Nilsson J, Jonasson P, Samuelsson E, Stahl S, Uhlén M (1996) Integrated pro-
duction of human insulin and its C-peptide. J Biotechnol 48(3):241–250
Sutarno. 2016. Rekayasa Genetika dan Perkembangan Bioteknologi di Bidang
Peternakan. Proceeding Biology Education Conference. Universitas sebelas
Maret. Volume 13 (1)
Wilcox, Gisela. 2005. Insulin and Insulin Resistance. Clin Biochem Rev. 2005 May;
26(2): 19– 39.
Zhang K, Liu X (2016) Mixed-mode chromatography in pharmaceutical and 
biopharmaceutical applications. J Pharm Biomed Anal 128:73–88
Zieliński M, Romanik-Chruścielewska A, Mikiewicz D, Łukasiewicz N, 
Sokołowska I, Antosik J, Sobolewska-Ruta A, Bierczyńska-Krzysik A, Zaleski P,
Płucienniczak A (2019) Expression and purifcation of recombinant human insulin
from E. coli 20 strain. Protein Expr Purif 157:63–69
Zimmerman RE, Stokell DJ (2010) Insulin production methods and pro-insulin 
constructs. United States patent US 7

22