Nama : Hanifa Nuh Malika Hari/Tanggal : Rabu 09 Juni 2021

NIM : 11190950000096 Dosen : Remila Selvany, M.Si.

Kelas : 4-C2 Ariana Findo Sari, M.Si.

Asisten : Yussi Sanjaya

Nur Amalia Rahmi

Praktikum Ke-9

ANALISIS PIGMEN DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (KLT)

I. Tujuan
1. Praktikan mampu memahami cara menganalisis pigmen dengan kromatografi lapis
tipis.
II. Cara Kerja
Sampel dimasukkan ke ddalam microtube 1, kemudian
Daun
ditambahkan aseton 90% sebanyak 400 µL, lalu diaduk
dihaluskan
dengan micropestle dampai larut dan berubah warna.
dengan mortar
selanjutnya diberi aston 90% lagi sebanyak 600 µL dan
dan alu.
dihomogenkan dengan vortex.

Supernatan dipindahkan ke microtube 2, Supernatan dipindahkan

Sampel disentrifugasi kemudian ditambahkan n-hekasana ke microtube 3 dan diberi
dengan kecepatan 6000 sebanyak µL, lalu dihomogenkan dengan 200 µL aquades kemudian
rpm selama 1 menit. vortex, selanjutnya disentrifugasi selama 1 dihomogenkan lagi
menit dengan kecepatan 6000 rpm. dengan vortex.

Sampel no.5 disentrifugasi lagi Plat kromatografi lapis tipis ditandai/digaris dengan jarak atas dan
dengan kecepatan 6000 rpm bawah 1 cm lalu ditandai baris atas dengan tulisan A, B, C dan D
selama 1 menit dan (kel 1-4) serta E, F, G, dan H (kel 5-8) sedangkan garis bawah
supernatannya dimasukkan ke ditandai dengan titik sejajar tegak lurus dengan huruf A, B, C, dan
microtube 4. D (kel 1-4) serta E, F, G, dan H (kel 5-8).

Plat KLT dimasukkan ke beaker Sampel A, B, C dan D (kel 1-4)

Solvent dimasukkan ke
glass. Tandai beaker glass sesuai serta E, F, G dan H (kel 5-8)
beaker glass sesuai dengan
garis bawah plat KLT dengan ditotolkan ke titik sejajar lurus
garis tanda pembatas plat
spidol, kemudian plat dengan huruf pada baris atas plat
yang telah dibuat (no.8).
dikeluarkan dari beaker glass. KLT, kemudian dikering anginkan.

Plat KLT dikeluarkan dari

Plat KLT dimasukkan ke Warna fragmen
beaker glass, sebelum strip
beaker glass yang berisi strip tiap sampel
pigmen warna sampel
solvent, didiamkan ±5 diamati dan dicari
menyentuh garis batas atas
menit. nilai RF nya.
(jarak 1 cm).
 III. Hasil Pengamatan
Tabel 1. Hasil Percobaan Tiap Sampel dengan KLT

Jarak Jarak Identifikasi

Kode
Kelompok Sampel Tempuh Tempuh Nilai Rf pigmen Gambar
Sampel
Pelarut Komponen
A1 4,7 cm 2,5 cm 0,53191489 Klorofil b
Sp 1 A2 4,7 cm 2,8 cm 0,59574468 Klorofil a
A3 4,7 cm 4,1 cm 0,87234043 Feofitin a
B1 4,7 cm 2,5 cm 0,53191489 Klorofil a
B2 4,7 cm 2,8 cm 0,59574468 Klorofil a
Hanjua B3 3,4 cm Pelargonidi
ng 4,7 cm 0,72340426 n 3-
glukosida
B4 4,7 cm 4,1 cm 0,87234043 Karoten
1
C1 4,7 cm 2,6 cm 0,55319149 Ksantofil
Bayam C2 4,7 cm 2,9 cm 0,61702128 Klorofil a
Hijau C3 4,7 cm 3,5 cm 0,74468085 Feofitin
C4 4,7 cm 4,2 cm 0,89361702 Karoten
D1 4,7 cm 2,8 cm 0,59574468 Klorofil a
D2 3,1 cm Pelagordini
Bayam
4,7 cm 0,65957447 n 3-
Merah
glukosida
D3 4,7 cm 4,3 cm 0,91489362 Karoten
A1 4,8 cm 2,5 cm 0,52083333 Klorofil b
A2 4,8 cm 3,4 cm 0,70833333 Feofitin
Sp 1
A3 4,8 cm 4,3 cm 0,89583333 Karoten
2 A4 4,8 cm 4,7 cm 0,97916667 Tannin
B1 4,8 cm 2,4cm 0,5 Klorofil a
Hanjua
B2 4,8 cm 3,2 cm 0,66666667 Feofitin
ng
B3 4,8 cm 4,2cm 0,875 Karoten
 B4 4,8 cm 4,6cm 0,95833333 Tannin
C1 4,8 cm 2,4 cm 0,5 Klorofil a
Bayam C2 4,8 cm 3,3cm 0,6875 Feofitin
Hijau C3 4,8 cm 4,3cm 0,89583333 Karoten
C4 4,8 cm 4,7cm 0,97916667 Tannin
Bayam D1 4,8 cm 2,7cm 0,5625 Klorofil b
Merah D2 4,8 cm 4,3 cm 0,89583333 Karoten

A1 4,6 cm 1,5 cm 0,32608696 Ksantofil

A2 4,6 cm 2,0 cm 0,43478261 Ksantofil

A3 4,6 cm 2,3 cm 0,5 Klorofil b

Spesies Klorofil a
A4 4,6 cm 2,9 cm 0,63043478
1
A5 4,6 cm 3,1 cm 0,67391304 Klorofil a

A6 4,6 cm 3,8 cm 0,82608696 Feofitin

A7 4,6 cm 4,5 cm 0,97826087 Tannin

B1 4,6 cm 1,9 cm 0,41304348 Klorofil a

B2 4,6 cm 2,1 cm 0,45652174 Klorofil a

3
Hanjua Klorofil b
B3 4,6 cm 2,6 cm 0,56521739
ng
B4 4,6 cm 3,8 cm 0,82608696 Feofitin

B5 4,6 cm 4,5 cm 0,97826087 Tannin

C1 4,6 cm 1,3 cm 0,2826087 Ksantofil

Bayam Klorofil a
C2 4.6 cm 1,9 cm 0,41304348
hijau
C3 4.6 cm 2,6 cm 0,56521739 Klorofil b

D1 4,6 cm 1,3 cm 0,2826087 Ksantofil

Bayam Klorofil a
D2 4,6 cm 2,0 cm 0,43478261
merah
D3 4,6 cm 2,8 cm 0,60869565 Klorofil a

A1 4,2 cm 2,5 cm 0,5952381 Klorofil a

Sp 1 A2 4,2 cm 4 cm 0,95238095 Tannin
4
A3 4,2 cm 4,2 cm 1 Tannin

B1 4,2 cm 2,3 cm 0,54761905 Klorofil b

 Hanjua B2 4,2 cm 4,2 cm 1 Tannin
ng B3 4,2 cm 4,2 cm 1 Tannin

C1 4,2 cm 2,2 cm 0,52380952 Klorofil b

Bayam C2 4,2 cm 2,3 cm 0,54761905 Klorofil b
Hijau C3 4,2 cm 4,05 cm 0,96428571 Karoten

C4 4,2 cm 4,2 cm 1 Tanin

D1 4,2 cm 2,3 cm 0,54761905 Klorofil b

Bayam
D2 4,2 cm 4,1 cm 0,97619048 Tannin
Merah
D3 4,2 cm 4,2 cm 1 Tannin
A1 4,9 cm 3 cm 0,6122449 Klorofil a
A2 4,9 cm 3,4 cm 0,69387755 Klorofil a
Sp 1
A3 4,9 cm 4 cm 0,81632653 Karoten
A4 4,9 cm 4,8 0,97959184 Tannin
B1 4,9 cm 2,9 cm 0,59183673 Klorofil a
Hanjua B2 4,9cm 3,3 cm 0,67346939 Klorofil a
ng B3 4,9 cm 3,9 cm 0,79591837 Feofitin
B4 4,9 cm 4,8 cm 0,97959184 Tannin
5 C1 4,9 cm 2,9cm 0,59183673 Klorofil a
Bayam
C2 4,9 cm 3,3 cm 0,67346939 Feofitin
Hijau
C3 4,9 cm 4,7 cm 0,95918367 Tannin
D1 4,9 cm 2,1 cm 0,42857143 Klorofil a
D2 4,9 cm 3 cm 0,6122449 Klorofil a
Bayam D3 3,5 cm Pelagorsidi
Merah 4,9 cm 0,71428571 nin-3-
glukosida
D4 4,9 cm 4,8cm 0,97959184 Tannin
A1 4,8 cm 2cm 0,41666667 Klorofil b
6 Sp 1 A2 4,8 cm 2,4cm 0,5 Klorofil a
A3 4,8 cm 4,2cm 0,875 Karoten
 A4 4,8 cm 4,8cm 1 Tannin
B1 4,8 cm 1,8cm 0,375 Ksantofil
Hanjua B2 4,8 cm 2,2 cm 0,45833333 Klorofil b
ng B3 4,8 cm 4,2cm 0,875 Karoten
B4 4,8 cm 4,8cm 1 Tannin
Bayam C1 4,8 cm 2cm 0,41666667 Klorofil a
Hijau C2 4,8 cm 2,3cm 0,47916667 Klorofil a
C3 4,8 cm 4,2cm 0,875 Karoten
C4 4,8 cm 4,8cm 1 Tannin
D1 4,8 cm 1,9cm 0,39583333 Klorofil a
D2 4,8 cm 2,2cm 0,45833333 Klorofil a
Bayam D3 3,5cm Pelagordini
Merah 4,8 cm 0,72916667 n 3-
glukosida
D4 4,8 cm 4,8cm 1 Tannin
A1 4,5 cm 2cm 0,44444444 Klorofil a
A2 4,5 cm 2,4cm 0,53333333 Klorofil b
Sp 1
A3 4,5 cm 2,6cm 0,57777778 Klorofil b
A4 4,5 cm 4,3cm 0,95555556 Tannin
B1 4,5cm 2,3cm 0,51111111 Klorofil b
B2 4,5cm 2,6cm 0,57777778 Klorofil b
Hanjua B3 3,3cm Pelagordini
7 ng 4,5cm 0,73333333 n 3-
glukosida
B4 4,5cm 4,3cm 0,95555556 Tannin
C1 4,5 cm 2cm 0,44444444 Klorofil a
Bayam C2 4,5 cm 2,3cm 0,51111111 Klorofil b
Hijau C3 4,5 cm 2,5cm 0,55555556 Klorofil b
C4 4,5 cm 4,2cm 0,93333333 Karoten
Bayam D1 4,5 cm 1,5cm 0,33333333 Ksantofil
 Merah D2 4,5 cm 2,3cm 0,51111111 Klorofil b
D3 3,2cm Pelagordini
4,5 cm 0,71111111 n 3-
glukosida
D4 4,5 cm 3,5cm 0,77777778 Feofitin
8 A1 4,8cm 2,2cm 0,45833333 Feofitin
A2 4,8 cm 2,5cm 0,52083333 Klorofil b
Sp 1
A3 4,8 cm 4,3cm 0,89583333 Karoten
A4 4,8 cm 4,8cm 1 Tannin
B1 4,8 cm 2,3cm 0,47916667 Klorofil b
Hanjua B2 4,8 cm 3,2cm 0,66666667 Klorofil a
ng B3 4,8 cm 4,3cm 0,89583333 Karoten
B4 4,8 cm 4,8cm 1 Tannin
Bayam C1 4,8 cm 2,3cm 0,47916667 Klorofil b
Hijau C2 4,8 cm 4,8cm 1 Tannin
D1 4,8 cm 2,4cm 0,5 Klorofil b
Bayam
D2 4,8 cm 3,2cm 0,66666667 Klorofil a
Merah
D3 4,8 cm 4,8cm 1 Tannin

IV. Pembahasan
Kromatografi merupakan suatu metode yang digunakan untuk memisahkan
campuran komponen. Pemisahan campuran komponen tersebut didasarkan pada
distribusi komponen pada fase gerak dan fase diamnya. Kromatografi lapis tipis
biasanya digunakan untuk tujuan analisis kualitatif, analisis kuantitatif dan analisis
preparatif. Suatu sistem KLT terdiri dari fase diam dan fase gerak (Jayanti dkk, 2015).
Plat KLT dapat berupa lembaran kaca, logam atau plastik yang dilapisi dengan lapisan
tipis adsorben padat (silica gel atau alumina). Sebagian kecil campuran yang akan
dianalisis ditotolkan dekat bagian bawah plat. Plat KLT kemudian ditempatkan didasar
chamber (ruang mengembang) sehingga hanya bagian paling bawah plat yang berada
dalam cairan. Cairan ini, atau eluen, adalah fase gerak, dan perlahan-lahan naik ke atas
plat KLT dengan aksi kapiler (Kumar et al, 2013).
 Pelaksanaan analisis dengan KLT diawali dengan menotolkan alikuot kecil sampel
pada salah satu ujung fase diam (lempeng KLT), untuk membentuk zona awal.
Kemudian sampel 2 dikeringkan. Ujung fase diam yang terdapat zona awal dicelupkan
ke dalam fase gerak (pelarut tunggal ataupun campuran dua sampai empat pelarut
murni) di dalam chamber. Jika fase diam dan fase gerak dipilih dengan benar, campuran
komponen-komponen sampel bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda selama
pergerakan fase gerak melalui fase diam. Hal ini disebut dengan pengembangan
kromatogram. Ketika fase gerak telah bergerak sampai jarak yang diinginkan, fase
diam diambil, fase gerak yang terjebak dalam lempeng dikeringkan, dan zona yang
dihasilkan dideteksi secara langsung (visual) atau di bawah sinar ultraviolet (UV) baik
dengan atau tanpa penambahan pereaksi penampak noda yang cocok (Wulandari,
2011).
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan
diameter partikel antara 10-30 µm. Semakin kecil ukuran rata-rata fase diam dan
semakin sempit ukuran fase diam maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisisensi
dan resolusinya (Sakinah, 2013). Penjerap yang umum digunakan yaitu silika gel,
alumina, oksida mineral lainnya, silika kimia-berikat gel, selulosa, poliamida,
pertukaran ion polimer, diresapi silika gel, dan fase kiral (Gocan, 2002). Diantara
semua fase diam tersebut silika gel adalah yang palik banyak digunakan. Banyaknya
penggunaan silika gel karena silika dapat menjadi fase diam bagi banyak zat kimia.
Fase gerak merupakan medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut.
Fase gerak bergerak dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Pelarut yang
digunakan sebagai fase gerak hanyalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila
diperlukan sistem pelarut multikomponen ini harus berupa suatu campuran yang
sesederhana mungkin yang terdiri atas maksimum 3 komponen (Stahl, 1998). Eluen
atau fase gerak yang digunakan dalam KLT dikelompokkan ke dalam dua kelompok,
yaitu untuk pemisahan senyawa hidrofil dan lipofil. Eluen untuk pemisahan senyawa
hidrofil meliputi air, metanol, asam asetat, etanol, isopropanol, aseton, n-propanol, tert-
butanol, fenol, dan n-butanol sedangkan untuk pemisahan senyawa lipofil meliputi etil
asetat, eter, kloroform, benzena, toluena, sikloheksana, dan petroleum eter (Puspita,
2009).
 Deteksi senyawa menjadi mudah ketika senyawa secara alami dapat berwarna atau
berberfluoresensi atau menyerap sinar UV. Namun, perlakuan penambahan pereaksi
penampak noda dengan penyemprotan atau pencelupan terkadang diperlukan untuk
menghasilkan turunan senyawa yang berwarna atau berfluoresensi. Pada umumnya
senyawa aromatik terkonjugasi dan beberapa senyawa tak jenuh dapat menyerap sinar
UV. Senyawa-senyawa ini dapat dianalisis dengan KLT dengan fase diam yang
diimpregnasi indikator fluoresensi dan deteksi dapat dilakukan hanya dengan
pemeriksaan di bawah sinar UV 254 nm. Faktor-faktor yang menyebabkan nilai Rf
bervariasi meliputi dimensi dan jenis ruang, sifat dan ukuran lempeng, arah aliran fase
gerak, volume dan komposisi fase gerak, kondisi kesetimbangan, kelembaban, dan
metode persiapan sampel KLT sebelumnya. Konfirmasi identifikasi dapat diperoleh
dengan mengerok noda dalam lempeng kemudian analit dalam lempeng dielusi dan
dideteksi dengan spektrometri inframerah (IR), spektrometri Nuclear magnetic
resonance (NMR), spektrometri massa, atau metode spektrometri lain jika senyawa
hasil elusi cukup tersedia. Metode identifikasi ini juga dapat menggunakan untuk
menandai zona langsung pada lapisan (in situ) (Wulandari, 2011).
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika
menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana
dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan terlalu banyak
maka akan menurunkan resolusi. Aplikasi sampel pada sorben lempeng KLT dapat
dilakukan secara manual dengan peralatan sederhana dan dapat juga dengan peralatan
otomatis. Semakin tepat posisi penotolan dan kecepatan penotolan semakin baik
kromatogram yang dihasilkan. Aplikasi sampel secara otomatis dapat memperbaiki
kualitas penotolan sampel (Wulandari, 2011). Rentang nilai Rf untuk pigmen ialah
pigmen ksantofil 0,26-0,34 berwarna kuning, klorofil a dengan range 0,40-0,63
berwarna hijau biru, klorofil b dengan range 0,30-057 berwarna hijau kuning,
pelagordinin 3-glukosida dengan range 0,71-0,74 yang berwarna merah darah, feofitin
dengan range 0,74-0,82 berwarna abu-abu, karoten 0,87-0,93 yang memiliki pigmen
warna orange, tanin dengan range Rf 0,94-0,98 memiliki pigmen warna kuning
kehijauan (Heriyanto, 2006).
V. Kesimpulan
 Kromatografi merupakan suatu metode yang digunakan untuk memisahkan
campuran komponen. Pemisahan campuran komponen tersebut didasarkan pada
distribusi komponen pada fase gerak dan fase diamnya. Rentang nilai Rf untuk pigmen
ialah pigmen ksantofil 0,26-0,34 berwarna kuning, klorofil a dengan range 0,40-0,63
berwarna hijau biru, klorofil b dengan range 0,30-057 berwarna hijau kuning,
pelagordinin 3-glukosida dengan range 0,71-0,74 yang berwarna merah darah, feofitin
dengan range 0,74-0,82 berwarna abu-abu, karoten 0,87-0,93 yang memiliki pigmen
warna orange, tanin dengan range Rf 0,94-0,98 memiliki pigmen warna kuning
kehijauan.

Daftar Pustaka

Gocan, S. (2002). Stationary Phases for Thin-Layer Chromatography. Journal of

Chromatographic Science., Vol. 40., pp. 1-12.
Heriyanto dan Leenawaty Limantara. (2006). Komposisi Dan Kandungan Pigmen
Utama Tumbuhan Taliputri Cuscuta australis R.Br. Dan Cassytha filiformis L.
Makara, Sains, Vol. 10, NO. 2. 69-75
Jayanti, R. (2015). Analisis Kualitatif Bahan Kimia Obat (BKO) Glibenklamid dalam
Sediaan Jamu Diabetes yang Beredar Dipasaran. Prosiding Penelitian SPeSIA
Unisba. (ISSN 2460-6472): 651.
Kumar, S. Pandey, A.K. (2013).Chemistry and Biological Activities of Flavonoids: An
Overview, The Scientific World Journal. Department of Biochemistry, University
of Allahabad, India.
Puspita, M.D.A. (2009). Pengoptimuman Fase Gerak KLT Menggunakan Desain
Campuran Untuk Pemisahan Komponen Ekstrak Meniran (Phyllanthus Niruri).
Bogor: Skripsi. Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut
Pertanian Bogor
Sakinah, R.C. (2013). Analisis Bahan Kimia Obat (Paracetamol dan Asam Mefenamat)
Dalam Jamu Asam Urat Dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri.
Malang: Skripsi. Prodi Farmasi Fakultas Ilmu Kesehatan UMM.
Stahl, E. (1998). Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. Bandung: ITB.
Wulandari, Lestyo. (2011). Kromatografi Lapis Tipis. Jember: PT. Taman Kampus
Presindo.
Lampiran
Soal
1. Apa yang dimaksud fase gerak dan fase diam?
Fase gerak, meliputi beberapa variasi eluen, eluen yang digunakan untuk proses
elusi terdapat dua jenis yakni eluen polar dan kurang polar.
Fase diam, disebut adsorben contohnya silika gelm alumina, kieslguhr, dan
selulosa.
2. Apa prinsip kerja kromatografi lapis tipis?
Berdasarkan adsorpsi dan partisi dimana sampel akan berpisah berdasarkan
perbedaaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Semakin
dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa
oleh fase gerak.
3. Apa fungsi penggunaan kromatografi lapis tipis?
Untuk memisahkan senyawa-senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida-lipida
dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas, analisis fraksi
yang di peroleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi,
dan isolasi senyawa murni sekala kecil.
4. Apa yang dimaksud nilai RF?
Adalah parameter yang menyatakan posisi noda pada fase diam setelah dielusi.
5. Bagaimana mendeteksi pigmen dengan KLT?
Dengan cara melihat nilai Rf atau mencari nilai Rf dengan rumus tertentu.
6. Carilah jenis kromatografi lain dan tuliskan kelebihan dan kekurangannya!
Kromatografi kolom,
Kelebihan: biaya yang digunakan lebih rendah dan kemudahan membuang fese
diam yang telah digunakan.
Kekurangan: membutuhkan waktu yang lama untuk menyelasaikannya, perlu
dilakukan elusi secara bertahap agar semua fase gerak digunakan habis pada wadah
yang berbeda.
Kromatografi cair vakum,
Keuntungan: proses terjadi secara cepat karena adanya bantuan vakum dan proses
elusi terjadi secara sempurna.
 Kekurangan: pada proses pemisahan senyawa tidak sempurna karena proses yang
cepat dan biaya yang mahal.
7. Apa hal yang paling penting dalam pengerjaan analisis menggunakan KLT?
Jelaskan!
Pemilihan eluen merupakan faktor yang paling berpengaruh pada sistem KLT.
Eluen dapat terdiri dari satu pelarut atau campuran dua sampai enam pelarut.
Campuran pelarut harus saling sampur dan tidak ada tanda-tanda kekeruhan.
Fungsi eluen dalam KLT : Untuk melarutkan campuran zat, Untuk mengangkat
atau membawa komponen yang akan dipisahkan melewati sorben fase diam
sehingga noda memiliki Rf dalam rentang yang dipersyaratkan, untuk memberikan
selektivitas yang memadai untuk campuran senyawa yang akan dipisahkan.
8. Fase diam atau plat silika gel bersifat polar atau non polar?
Bersifat polar
9. Chamber yang berisi eluen, ditutup saat proses agar jenuh. Kenapa harus jenuh?
Bagaimana mengecek sudah jenuh atau belum?
Agar tidak ada lagi udara bebas yang mengalir yang dapat mengganggu jalannya
analisis, mencegah penguapan pelarut. Pengecekan dilakukan dengan bejana yang
dilapisi dengan kertas saring, jika fase gerak telah mencapai ujung atas kertas
saring, maka dikatakan fase gerak telah jenuh.