LATIHAN VIII

Identifikasi Campuran Simplisia Dengan KLT

Tujuan :
Pada akhir praktikum mahasiswa mampu melakukan identifikasi simplisia nabati
dengan metode Kromatografi Lapis Tipis.

Bahan :
Campuran serbuk simplisia

Pelaksanaan :
Untuk tujuan identifikasi simplisia maka dilakukan perbandingan profil kromatogram
ekstrak simplisia ‘x’ dengan simplisia standar yang telah diketahui menggunakan
beberapa jenis zat penyari dan fasa gerak yang berlainan. Ekstrak simplisia ‘x’ dan
ekstrak simplisia standar harus ditempatkan pada plat KLT yang sama. Semakin
banyak jenis fasa gerak yang digunakan maka hasil identifikasi semakin terpercaya.
Kesamaan profil kromatogram hanya pada satu jenis penyari dan satu jenis fasa gerak
saja sebenarnya belum dapat digunakan untuk menarik kesimpulan. Pada praktikum
ini hanya digunakan satu penyari dan satu fasa gerak saja yang dimaksudkan sebagai
contoh pelaksanaan KLT.
Tugas dilakukan secara berkelompok yang terdiri dari 4 mahasiswa per kelompok.
Setiap kelompok akan mendapatkan satu campuran yang terdiri dari 2 - 3 serbuk
simplisia untuk dianalisis secara KLT dan mikroskopi.

Cara kerja
I. Identifikasi Kandungan Senyawa dengan KLT
1. Uji Kandungan alkaloid
Dua gram serbuk diekstraksi dengan 5 ml etanol + larutan NH4OH 5%
dalam tabung reaksi. Dikocok selama 5 menit, filtrat dipisahkan. Ekstrak
yang diperoleh ditambah pelarut kloroform (sama banyak), kocok selama 5
menit. Biarkan hingga terjadi pemisahan. Ekstrak kloroform yang ada di
lapisan bawah diambil dengan pipet panjang, selanjutnya ekstrak kloroform
ini yang digunakan untuk KLT.
Fase gerak : Etil asetat : Metanol : Air (100:18,5:13,5)
Fase diam : silika gel GF 254
 Penampak noda : sinar uv dan pereaksi dragendorf
Warna noda : jingga (dengan pereaksi dragendorf)
2. Uji Kandungan Flavonoid
Dua gram serbuk + 10 ml metanol dikocok dalam tabung reaksi selama lima
menit. Ekstrak metanol yang diperoleh dipisahkan dan dimasukan dalam
vial kering. Ekstrak metanol ini yang digunakan untuk KLT.
Fase gerak : Metanol : air = 4 : 1
Fase Diam : silika gel GF-254
Penampak noda : uap NH4OH (amoniak)
Warna noda : kuning intensif (dengan pereaksi uap amoniak)
3. Uji kandungan terpenoid, steroid, minyak atsiri
Dua gram serbuk + 10 ml heksan, dikocok dalam tabung reaksi selama lima
menit. Ekstrak heksan yang diperoleh dipisahkan dengan cara peyaringan
dan dimasukan ke dalam vial kering. Ekstrak heksan ini selanjutnya
digunakan untuk KLT.
Fase gerak : Heksan : Etil asetat = 4 : 1
Fase diam : silika gel GF-254
Penampak noda : sinar uv dan pereaksi anisaldehida-asam sulfat
Warna noda : biru – ungu (dengan pereaksi anisaldehid-H2SO4)

II. Identifikasi serbuk campur simplisia dengan metode KLT

1. Siapkan ekstrak serbuk ‘x’
2. Siapkan bejana KLT yang telah dibersihkan dan dikeringkan, masukkan
kertas saring setinggi 8 cm melingkari bagian dalam bejana sampai melingkar
penuh. Isi dengan fasa gerak yang sesuai sampai setinggi 1 cm dari dasar
bejana. Tutup dan biarkan fasa gerak merambati kertas saring sampai
terbasahi semuanya.
3. Ambil plat KLT (E Merck DC-Alufolien) dengan ukuran 5 x 10 cm. Beri tanda
dengan pinsil berupa titik (setipis mungkin agar tidak merusak plat KLT dan
jangan berupa garis !) yang akan dijadikan tempat penotolan. Jarak tempat
penotolan dari dasar adalah 1,5 cm. Titik penotolan nomor 1 berjarak 0,5 cm
dari tepi kiri. Titik penotolan nomor 2 berjarak 1 cm dari nomor 1, demikian
seterusnya sampai tersedia 5 titik penotolan. Pada ujung atas plat KLT diberi
tanda akhir eluasi 0,5 cm dari pinggir atas plat.
 TAHAP PEKERJAAN NOMOR 1 s/d 3 DIKERJAKAN SECARA PARALEL
DENGAN PEMBAGIAN TUGAS DI ANTARA MASING-MASING
ANGGOTA KELOMPOK !
4. Pada titik penotolan nomor 1 totolkan kurang lebih 100-200 L ekstrak
pembanding A. Caranya : isi pipa kapiler dengan cara mencelupkan ujungnya
ke dalam ekstrak dan biarkan ekstrak merambat naik mengisi kapiler. Buang
kelebihan ekstrak dengan disentuhkan sekejap ke kertas tissue. Sentuhkan
ujung kapiler dengan tegak lurus pada titik penotolan (jangan ditekan !) dan
biarkan ekstrak terserap ke plat KLT namun harus segera diangkat dan ditiup
agar diameter penotolan tidak melampaui 0,5 cm. Sentuhkan kembali
berulang-ulang sampai isi kapiler habis dan kemudian kapiler diisi lagi dan
dilakukan penotolan lagi sampai tercapai jumlah penotolan 100-200 L
(kurang lebih 4 – 5 kali pengisian kapiler).
5. Ambil kapiler baru dan dengan cara seperti di atas totolkan ekstrak
pembanding B pada tempat penotolan nomor 2.
6. Dengan kapiler yang baru, totolkan ekstrak serbuk ‘x’ pada tempat penotolan
nomor 3 dengan cara yang sama.
7. Dengan cara yang sama, totolkan pembanding C dan pembanding D pada
tempat penotolan yang tersisa.
8. Biarkan pelarut menguap sebentar kemudian masukkan plat tersebut ke
dalam bejana, tutup, dan tunggu sampai eluen naik sampai batas akhir yang
telah diberi tanda. Kedalam sebuah bejana dapat dimasukkan 2 plat KLT
secara bersamaan. SELAMA ELUASI, TUTUP BEJANA TIDAK BOLEH
DIBUKA !.
9. Ambil plat KLT jika eluen sudah mencapai batas akhir dan biarkan plat
mengering.
10. Lakukan pengamatan dengan sinar ultra violet 255 nm dan 365 nm, beri tanda
dengan pinsil bercak/bercak yang tampak dan catat warna serta harga Rf-
nya.
11. Semprot plat dengan pereaksi yang sesuai secara merata namun jangan
sampai basah (dapat merusak plat KLT). LAKUKAN DI DALAM LEMARI
ASAM !. Biarkan sebentar sampai plat kering.
12. Bila perlu, letakkan plat di atas ‘hotplate’ sambil terus diamati munculnya
bercak-bercak berwarna. Segera angkat jika semua bercak sudah muncul.
13. Beri tanda, catat warna dan harga Rf-bercak-bercak utama.
14. Bandingkan bercak-bercak pada serbuk ‘x’ dengan bercak-bercak pada
pembanding.
 15. Lakukan analisis mikroskopi terhadap sisa sebuk ‘x’.
16. Buat kesimpulan kandungan serbuk ‘x’
17. Buat laporan.

A. HASIL KLT
N Harga Warna bercak dengan pereaksi anisaldehid-H2SO4
o Rf
Simplisia ‘x’ Pemband. A Pemband. B Pemband. C Pemband. D

N Harga Warna bercak dengan sinar uv

o Rf
Simplisia ‘x’ Pemband. A Pemband. B Pemband. C Pemband. D

III. ANALISIS MIKROSKOPI

(gambar dan keterangan fragmen-fragmen)

IV. KESIMPULAN
……………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………….

Referensi
• Departemen Kesehatan R.I., Materia Medika Indonesia.
• Wagner, Bladt and Zgainski. Plant Drug Analysis. Springer Verlag, Berlin, 1984.
B. Format Laporan Tugas VIII
1. Judul
2. Tujuan
3. Tinjauan Pustaka (Klasifikasi Tanaman, Ciri-ciri Morfologi dan
Anatomis Tanaman, Manfaat, Metode Kromatografi Lapis Tipis,
Identifikasi Golongan Senyawa Metabolit Sekunder)
4. Prosedur Kerja
5. Hasil (disertai dengan dokumentasi gambar)
6. Pembahasan

C. Laporan praktikum dikumpulkan 2 hari setelah kegiatan praktikum.