LAPORAN PRATIKUM RANCANGAN OBAT

PEMISAHAN DAN PEMURNIAN SENYAWA TARGET DENGAN

KROMATOGRAFI KOLOM

OLEH :

Indri Ilmiyatul Hasanah (19040059)

Jihan Lorenza (19040066)
Lanny Margareta (19040071)
Lilik Nur Fitriani (19040072)
Lina Rika Adiasmawati (19040073)
Manar Syathotho (19040077)
Novansyah Tri Wiyandodo (19040093)
Nur Khomah Sabawanti (19040073)

Kelompok 3

19B FARMASI

Dosen Pengampu :
Dr. apt. Ayik Rosita P,M.Farm.

LABORATORIUM TEKNOLOGI FARMASI

PROGRAM STUDI FARMASI
UNIVERSITAS dr SOEBANDI
2021
 BAB V
PEMISAHAN DAN PEMURNIAN SENYAWA TARGET DENGAN
KROMATOGRAFI KOLOM
A. Tujuan percobaan
Memisahkan dan memurnikan senyawa target menggunakan kromaografi kolom.
B. Alat dan bahan
Alat :
 Gelas beker 100ml, 250 ml
 Kolom kromaografi
 Batang pngaduk
 Kertas saring
 Oven
Bahan :
 Silika gel
 Pelarut
 Aquades

C. Cara Kerja

Silika Gel

 Dimasukkan kedalam Erlenmeyer

 Ditambahkan eluen diatas permukaan silica gel
 Dikocok pelan hingga merata
 Dimasukkan hati-hati kedalam kolom kromatografi
 Kolom tersebut diamkan selama 30 menit

Apabila kolom tidak retak, tambahkan eluen 0,5cm di atas permukaan

silica gel dan bila retak ulangi langgkah a. kemudian ke dalam kolom
ditambahkan sampel(1% bobot silica) yang telah dicampur dengan
silica gel.

Alirkan eluen dan ditampung sebanyak ±50 ml dalam erlenmeyer

(eluen ini belum membawa sampel sehingga dapat digunakan kembali
sebagai fase gerak).
 Selanjutnya kran dibuka dan diatur penetesnnya (1 tetes/detik) dan
ditampung dalam vial atau tampung yang telah diberi nomor masing-
masing vial 25ml (10vial)

Pada setiap vial dilakkan uji KLT untuk melihat noda yang dihasilkan.
Apabila menghasilkan noda yang sama, vial-vial tersebut digabung.
Penetesan dihentikan apabila vial sudah tidak meberikan noda saat
diuji KLT.

D. Skema Alat
 E. HASIL PERCOBAAN

DATA PERCOBAAN PEMISAHAN KROMATOGRAFI KOLOM

A. Evaluasi Menggunakan KLT

Sampel : Metil Yellow dan Metil Green

Jarak yang ditempuh sampel nomer 1 = 4,2 cm

Jarak yang ditempuh sampel nomer 5 = 4,2 cm

Jarak yang ditempuh sampel nomer 9 = 4,2 cm

Jarak yang ditempuh sampel nomer 13 =1,3 cm

Jarak yang ditempuh sampel nomer 15 = 1,3 cm

Jarak yang ditempuh oleh pelarut = 4,5 cm

F. PERHITUNGAN

𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑧𝑎𝑡

𝑅𝐹 =
𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑒𝑚𝑝𝑢ℎ 𝑝𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡

4,2 𝑐𝑚
sampel nomer 1 𝑅𝑓 = 4,5 𝑐𝑚 = 0,93

4,2 𝑐𝑚
sampel nomer 5 𝑅𝑓 = 4,5 𝑐𝑚 = 0,93

4,2 𝑐𝑚
sampel nomer 9 𝑅𝑓 = 4,5 𝑐𝑚 = 0,93

1,3 𝑐𝑚
sampel nomer 13 𝑅𝑓 = 4,5 𝑐𝑚 = 0,28

1,3 𝑐𝑚
sampel nomer 15 𝑅𝑓 = 4,5 𝑐𝑚 = 0,28
 G. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini yaitu kita melakukan praktikum pemisahan/pemurnian

senyawa target dengan kromatografi kolom. Pemisahan dan pemurnian senyawa target
dengan kromatografi kolom itu tidak hanya dengan kromatografi kolom tapi bisa dengan
kromatografi preparatif contohnya bisa dari plat klt. Ada beberapa noda di totolkan sepanjang
dari plat klt digaris bawah itu nanti misalnya di bagian atas dikerok kemudian hasil kerokkan
itu adalah noda yang diinginkan kemudian noda yang diinginkan itu dilarutkan dengan
pelarut yang memang untuk noda tersebut. Ketika dilarutkan larutannya menguap itu
mendapatkan sampel kita. Hal itu disebut preparatif bisa juga dengan yang namanya HPLC
preparat artinya disuntikkan (pada hplc pasti ada puncak-puncaknya namun waktu retensi
pada waktu tertentu). Ketika menggunakan pemisahan kolom ini kelebihannya adalah
mendapatkan senyawa yang diinginkan dalam jumlah banyak jika diinginkan elusidasi
ataupun identifikasi struktur yang dengan beberapa macam instrumen misalkan dengan MS
dengan FTIR kemudian dengan NMR baik H maupun cnmr maka ini sangat disarankan
apalagi jika dilanjutkan uji aktivitas . Uji aktivitas nanti tidak cuma 1 macam misalkan anti
kanker anti malaria Analgesik antibiotik, anti mikroba dan lain sebagainya atau anti diabet
anti hipertensi itu maka membutuhkan senyawa yang banyak karena nanti akan dimasukkan.
secara sel ya diberikan pada sel sedikit tapi kalau pada hewan coba seperti mencit atau tikus
maka memerlukan senyawa yang cukup banyak maka kolom merupakan pilihan yang pilihan
yang bagus untuk mendapatkan nyawa target dengan jumlah yang banyak.
Tujuannya memisahkan dan memurnikan senyawa karbon menggunakan kromatografi
kolom alat dan bahannya yaitu gelas, kolom ,batang pengaduk, kertas saring, oven, silica gel,
pelarut larutan, aquades . kemudian dengan menggunakan silica sistemnya adalah like
dissolve like artinya kelarutan senyawa yang eluen yang paling banyak itu yang akan turun,
jadi nanti ada dua macam. Kerjanya silica gel sebanyak 100 kali sampel dimasukkan dalam
erlemeyer dan ditambahkan dengan silica gel dikocok hingga merata dan masukkan ke
dengan hati-hati ke dalam kolom kromatografi. Biasanya silica gel di aktifasi di oven diatas
100ºC misalkan 105 atau 110ºC mungkin sekitar 30 menit sampai 1 jam. Setelah satu jam itu
bertujuan untuk dalam silika gel itu masih menyerap air, air ini kalau masuk ke dalam
kolom silikanya nanti itu akan menyebabkan cracking atau pecahnya jadi caranya diaktivasi
dulu silikanya di dalam oven selama setengah atau 1 jam suhunya 105 atau 110°C artinya
untuk menguapkan air, kemudian di keluarkan dari oven didinginkan pelan-pelan dikasih
eluen. Di kasih eluen di larutkan silica nya nantik bentuk nya akan menjadi bubur pada
kolom. Di bagian bawahnya itu adalah isinya kapas-kapas kemudian dibasahi dengan eluen,
kemudian bubur ini dimasukkan ke dalam, dimasukkan ke dalam kolom pelan-pelan di mana
krannya ini dibuka tapi jangan grojok terlalu keras cukup keluar airnya sehingga nanti si
buburnya akan ke bawah dan jangan sampai buburnya kering sehingga eluennya tentu lebih
banyak sehingga bubur atau bubur silikanya itu akan ke (bawah) dan eluen masih ada di atas
terus supaya turun ke bawah biasanya ditepuk-tepuk. Untuk kolomnya biasanya jika pakai
ban dalamnya sepeda motor itu di gunting nanti ditepuk-tepuk, jika pakai sedikit mental-
mental sehingga turun ke bawah, jika tidak dipakai seperti pensil atau pulpen itu sedikit kaku
sedikit akan turunnya, kemudian biasanya jika itu sudah sampai krannya di buka sehingga
eluennya akan turun ke (paling bawah) hal ini bisa dipakai lagi untuk melarutkan bubur ini, di
masukan lagi, jadi eluennya tidak hilang percuma. Kemudian tutup supaya dia memadat
sempurna, mungkin didiamkan cuma 30 menit atau 1 jam (sebenarnya semakin lama semakin
bagus biasanya pakai nya 24 jam). Oleh karena itu eluen akan mudah menguap di tutup,
bagian atas kran juga di tutup dengan aluminium foil bubur ini harus tetap terendam dengan
eluen. Silica dicampur sampelnya kemudian ditambahkan eluen membentuk bubur sampelnya
yang untuk di masukan.
Elusi ada dua macam : ada isokratik dan ada gradient. Pada isokratik ini biasanya hanya
1 macam eluen saja, pelarut mudah menguap yang ada perbandingan tertentu pada
kromatografi jika menggunakan plat klt biasanya isokratik ini berdasarkan data plat klt. Jadi
pada saat plat klt di totol kan, senyawa yang mau dipisahkan itu yang akan dimurnikan ada 3
noda, misalkan 3 noda ini pemisahannya bagus dan ingin mengambil masing-masing
tentunya dengan isokratik artinya pisahnya tidak dempet-dempet misalkan dengan setelah
optimasi mendapatkan kloroform dibanding dengan misalkan etil asetat, 7 : 3 misalkan
sehingga kita itu kalau membuat eluen isokratik itu kita bikin 7 : 3, misalkan 50 mL. 50 mL
ini berartikan bikinnya untuk yang klorofom berarti 7 per 10 (10 dari mana 7 + 3 ) 7 per 10 x
50 berarti 35 mL yang etil asetatnya 15 mL sehingga 50mL. 50 mL ini yang dimasukkan
dalam silika gel yang dalam erlemeyeer tadi setelah di aktivasi untuk membentuk bubur.
Kalau sistemnya adalah isokratik.
Gradien itu adalah penurunan secara perlahan dari suatu polaritas pelarut eluen, jadi
misalkan n-heksan itu mewakili yang nonpolar kemudian etil asetat itu mewakili yang semi
polar metanol ini mewakili yang polar sehingga ini perbandingannya misalkan bikin
berbandinganya 9 : 1 atau yang pertama kali bukan sembilan tapi 10 etil asetatnya 0. Jadi
bikin nya 10 ml aja misalkan lanjut lagi 9 : 1 itu 10 mL juga (tidak ada ketentuan). Jika akan
mengisi sedikit-sedikit seperti ini kemudian 8 : 2 , 7 : 3, sampai akhirnya nanti etil asetatnya
10 dan n-heksannya 0. Jadi bikin 10 mL, selama bikin 10 mL dituang ke dalam silika untuk
menjadi bubur biasanya untuk pertama pada saat membuat bubur supaya padat biasanya n-
heksan di grojok dulu sampai memadat, baru setelah bentuk kolomnya terbentuk besoknya
ketika sampel sudah masuk baru bikin perbandingan setiap 10:0 = 10 mL, lalu di masukkan.
Kemudian 9 : 1 , 9 ml heksan dan 1 mL etil asetatnya di masukan. 8 : 2, 8 mL heksannya
dan 2 mL etil asetatnya di masukkan begitu seterusnya. Memang akan membutuhkan eluen
banyak tapi ini akan lebih bisa mendapatkan posisi pita ataupun senyawa yang diinginkan
lebih jelas. Perbandingan eluen berdasarkan yang isokratik ketika dengan plat klt misalkan
optimasi pemisahannya bagus 7 : 3 diaplikasikan di kolom itu belum tentu bagus, karena
silikanya itu mempengaruhi pada plat klt. Silika gel gf254 itu lembut sekali untuk
diameternya, ketika kita pakai pada kolom silikanya yang ada misalkan diameternya agak
lebih besaran artinya disitu sudah ada perbedaan dan kemungkinan tidak akan sama
pemisahannya, untuk mendapatkan senyawa yang diinginkannya pemisahannya akan lebih
jelas. Seperti non polar dan semi polar misalkan kemudian si etil asetatnya ini 10 kemudian
n-heksan nya ini 0 maka lanjut ke arah polar sehingga etil asetat 10 dan metanol nya 0. Pada
perbandingan 9 : 1, 8 : 2, 7 : 3 dan seterusnya merupakan proses yang namanya gradien
secara pelan-pelan berubah dari non polar ke polar dengan perbandingan untuk mendapatkan
senyawa pemisahan yang diinginkan biasanya ini dilakukan isolasi pada ekstraksinasi
kemudian isolasi pada ekstrak-ekstrak atau tanaman untuk mendapatkan senyawa target yang
diinginkan. Untuk senyawa yang sifatnya sintesis seperti paranitro atau asetosal ada
pengotornya yang cuma ada dua noda itu pemisahannya biasanya isokratik saja sudah cukup,
tapi kalau sudah pemisahannya itu lebih kompleks banyak senyawa-senyawa di dalam ketika
di klt itu banyak noda-noda itu perlu dilakukan dengan cara gradien.
Untuk membuat kolomnya silica gel sebanyak 100 kali bobot, sampel dimasukkan
dalam erlenmeyer ditambahkan eluen kemudian kurang lebih 2 cm di atas permukaan silica
gel jangan sampai kering kemudian dikocok perlahan hingga merata dan masukkan ke dalam
kolomnya secara hati-hati pada bagian awalnya yang telah diberi kapas. Kapas yang dibasahi
dengan eluen dengan isokratik, kalau menggunakan gradien dengan pelarut awalnya misalkan
non polar dengan heksan itu di grojogan sampai terbentuk, kemudian sebelum penuangan
dinding luar kolom disemprot dengan etanol kolom tersebut kemudian didiamkan selama 30
menit untuk pemampatan dan melihat ada tidaknya keretakan. Lalu untuk sampelnya
perlakuannya sama. Biasanya baru besoknya di kerjakan jadi silikannya diaktifkan sisanya
dari yang kemarin sedikit saja. Nanti seperseratus nya 1/100 nya berarti 1 gram kemudian di
buat buburnya silica nanti sekitar 1 - 2 cm (kecil sekali) di atas silicanya di ketuk-ketuk
kemudian ada eluen di atasnya sehingga tetap terendam. Ketika menuangkan seperti ini
karena eluen itu mudah menguap ditutup dengan aluminium foil ataupun dengan suatu
saringan atau dengan corong-corong ditutup ketika mau dituang baru dibuka, supaya eluen
nya tidak menguap. Tiap tetesannya dari awal sampai akhir itu harus sama misalkan 1 tetes
per detik, berarti 1 tetes per detik terus dan vial yang di gunakan kalau menggunakan vial 5
mL berarti 5 mL semua atau pakai 10 mL berarti 10 mL semua. Kemudian disemprot di
bagian luar, selama tidak terjadi craking tidak perlu disemprot tapi kalau terjadi cracking di
bawah atau di tengah itu memang harus di semprot tapi pakai tisu. Caranya tempelkan tisu di
luar baru disemprot dengan etanol ataupun aseton jadi dengan pelarut yang mudah menguap.
Pada keadaan yang dingin cracking terjadi karena gesekan dari cairan yang turun ke bawah
dengan silikanya sehingga ada energi-energi panas airnya pecah kalau tidak hati-hati. Pada
pecah-pecahan ini tidak menyatu, itu akan menyebabkan pemisahannya kurang sempurna
akhirnya nanti ke tercampur-campur. Misalkan kalau nodanya sebenarnya pisah atas bawah
ini bisa kecampur kemudian kalau kalau di tempel tisu di bagian luar itu disemprot, untuk
disemprot aja di bagian luar kaca kemudian dia akan turun dan pelan-pelan akan menutup,
tapi kalau di bagian atas yang pecah misalkan di bagian sampel ataupun silika yang bagian
atasnya tusuk itu pelan-pelan.
Kalau isokratik untuk eluennya dimasukkan sama komposisinya cuma di masukan terus
menerus, tapi kalau gradient harus membuat perbandingannya dulu baru dimasukkan
kemudian apabila kolom tidak retak tambahkan eluen 0,5 cm di atas permukaan silika gel.
Kalau tidak retak itu tambahkan eluen karena memang tidak boleh kering harus terendam
kemudian bila retak ulangi langkah awal. Kemudian ke dalam kolom tambahkan sampel 1%
bobot silika yang telah dicampur dengan silica (kalau retaknya banyak diulang) tapi kalau
misalkan retaknya dikit bagian tengah bisa diatasi seperti disemprot dengan pelarut etanol
atau aston atau pelarut organik yang mudah menguap dan juga dingin sehingga nanti retaknya
itu akan menyatu. Kemudian kalau bagian atas bisa ditusuk tadi untuk sampelnya 1% dari
bubuk silica, untuk bubuk silica nya 100 gram berarti 1 % nanti dilarutkan dicampur dengan
bubuk silica. Kalau untuk sampel ada warnanya itu bisa membedakan adalah misalkan pada
ekstrak tanaman yang warnanya hijau ataupun agak coklat itu bisa dibedakan tapi yang susah
kalau hasil sintesis kemudian lihat warnanya sama putih semua itu yang agak susah tapi
tentunya dengan dicampur nanti kita bisa mengira-ngira kalau sama-sama warnanya putih.
Intinya 1 cm di atas dari silikanya itu menjadi sampelnya kemudian alirkan eluen dan
ditampung sebanyak 50 mL dalam erlenmeyer 50 mL ini grojokan yang pertama misalkan
seperti pertama itu terus di grojok asal kranya jangan di buka penuh, supaya bubur silikanya
terus ke bawah, ditampung dengan erlenmeyer besar kalau sudah selesai baru di diamkan 30
menit. Kemudian dialirkan 50 mL itu kan masih belum ada samplenya grojokan, yang awal
hanya untuk memadatkan volume silikanya saja, langkah selanjutnya jika sudah ada sampel
maka dibuka krannya dan diatur pementasannya mau 1 tetes per detik. Lalu ditampung dalam
vial , vial diberi nomor masing-masing. Contohnya 25 mL ada 10 vial di nomor I ada 1 - 10
boleh lebih. Kalau belum selesai pita-pitanya dari pemisahannya boleh dilanjutkan pada
setiap vial lalu dilakukan uji klt untuk melihat noda yang dihasilkan jadi setiap fayel di plate
klt. Menggunakan eluen yang optimasi misalkan kloroform etil asetat tadi 7:3 misalkan
seperti itu maka digunakan eluen yang sama. Kemudian kecuali kalau gradien tinggal kita
optimasi misalnya kalau yang keluar pertama nonpolar berarti kita harus bermain dengan non
polar dan semi polar untuk perbandingan gradient, tapi ketika sudah masuk ke semi polar dan
polar maka kita main di eluen ataupun perbandingan dari eluen yang semi polar dan polar itu
kalau sistemnya gradien maka setiap vial nanti di klt, maka ketika menghasilkan noda yang
semipolar sama vial-vial tersebut digabung misalkan 1-10, Rf nya sama misalkan di 0,3
semua digabung jadi satu kemudian diuapkan hasil yang diuapkan tersebut menjadi hasil
murni.
Hasil pemisahan ataupun hasil merancang ataupun hasil isolasi dari pencarian obat baru
ataupun kalau sintesis pembentukan kemudian vial-vial itu di gabung pemetesan dihentikan
apabila fayel sudah selesai uji dengan klt yang di tempuh 13 aya yang sampai 16, maksudnya
ketinggiannya jadi untuk RF nya nanti dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut. Pada
nomor 10-12 tidak ada kemungkinan itu keadakan transisi dari jarak 4,2 ke 1,3 akhirnya itu
menjadi campuran. Sehingga kalau dipaksakan untuk dimasukkan takutnya itu nanti malah
tidak murni misalkan kalau awal warnanya ada metil yellow artinya dia kuning satunya hijau,
kuning dan hijau mungkin ada hijau muda nya itu yang jangan sampai dicampur itu karena
merupakan senyawa yang transisi. Karena apa yang hasil murni itu nantinya akan diujikan di
instrumen maupun di uji farmakologi atau aktivitas misalkan MS itu harus murni kalau ada
pengotornya akan mempengaruhi hasil. Artinya yang diingkan senyawanya adalah para
nitroasetanili ada nitro nya misalkan di posisi para tapi di posisi metana atau di posisi orto ini
yang nantinya akan mempengaruhi hasil atau misalkan kalau di uji aktivitas senyawa
campuran sama senyawa yang murni tentunya aktivitasnya kalau untuk disimpulkan senyawa
campuran nanti pasti standar deviasinya mungkin besar, kadang dia memberikan aktivitas
bagus kadang jelek fluktuatif tapi kalau ada senyawa yang murni itu akan stabil. Kalau
misalkan sebagai uji bakteri ke bakteri lainnya bakteri, materinya atau isinya gitu menjadi
stabil yang diinginkan adalah senyawa yang murni nilai RF nya. Jarak ditempuh zat dibagi
jarak tempuh pelarut itu menjadi nilai RF. Untuk kromatografi kolom adalah suatu proses
pemisahan dan pemurnian menggunakan suatu kolom baik menggunakan silica ataupun
dengan bahan lain yang fungsinya sama. Kalau silika gel itu sistemnya adalah like disolve
like artinya senyawa atau sampel yang terkandung di dalam kelarutannya pada nonpolar
misalkan maka akan ikut pada bagian nonpolar kalau yang polar maka ikut bagian yang
polarnya. Kemudian pada silica gel itu juga ada diameter dari silica artinya kalau diameternya
dia kecil tentunya untuk menembus itu akan sulit untuk senyawa-senyawa yang molekulnya
besar kalau senyawa molekul nya kecil artinya turun terlebih dahulu jadi tegantung dari silica
gel nya.
Titik kritisnya yaitu ketika membuat bubur silika jel dan membuat kolomnya maka
silikanya harus diaktivasi terlebih dahulu dengan dioven kemudian kalau terjadi cracking bisa
disemprot dengan metanol etanol itu kalau ada cracking bagian bawah atau tengah kalau
bagian atas bisa ditusuk. Perbandingan antara sampel dan silika itu harus sesuai karena kalau
kebanyakan pada sampel metil yellow dan green, sampelnya akan hijau semua warnanya atau
kuning semua. Untuk mengeluarkan satu persatu sampelnya akan sulit terdeteksi misalnya itu
campurannya tidak sesuai. Kemudian vial yang digunakan harus sama terus volumenya harus
sama dan tetesannya harus sama. Sehingga itu menjadi titik-titik kritis pada praktikum ini.

H. KESIMPULAN
4,2 𝑐𝑚
sampel nomer 1 𝑅𝑓 = 4,5 𝑐𝑚 = 0,93

4,2 𝑐𝑚
sampel nomer 5 𝑅𝑓 = 4,5 𝑐𝑚 = 0,93

4,2 𝑐𝑚
sampel nomer 9 𝑅𝑓 = 4,5 𝑐𝑚 = 0,93

1,3 𝑐𝑚
sampel nomer 13 𝑅𝑓 = = 0,28
4,5 𝑐𝑚

1,3 𝑐𝑚
sampel nomer 15 𝑅𝑓 = 4,5 𝑐𝑚 = 0,28
Nilai Rf dinyatakan sampai angka 1 nilai Rf cukup baik yaitu antara 0,2-0,8 (Rohman,

2009). diberikan (Harmita, 2004) dan dapat diterima untuk suatu metode analisis yang

valid.
I. DAFTAR PUSTAKA

Buono, Riyadi Selot. Optimasi Pemisahan Campuran Hasil Reaksi Antara Asam O-
Kumarat Dan Benzoil Klorida Dengan Metode Kromatografi Kolom. Diss.
UNIVERSITAS AIRLANGGA, 2020.
Sutomo, Sutomo. "Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Antioksidan Dari Buah Kasturi
(Mangifera casturi Kosterm.)." Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Antioksidan
Dari Buah Kasturi (Mangifera casturi Kosterm.) 4.2 (2017): 246-254.
Tetti, M. (2014). Ekstraksi, pemisahan senyawa, dan identifikasi senyawa
aktif. Jurnal Kesehatan, 7(2).
Scanned with CamScanner
Scanned with CamScanner
Scanned with CamScanner
Scanned by TapScanner
Scanned by TapScanner