LAPORAN PRAKTIKUM RANCANGAN OBAT

PEMISAHAN & PEMURNIAN SENYAWA TARGET DENGAN KROMATOGRAFI

KOLOM

Dosen Pengampu :

Dr. Apt. Ayik Rosita, M. Farm.

Oleh :

Kelompok 5

Ichda Ramadani Utomo 19040056

Miatuz Zaqia 19040081

Nadya Marcellin 19040085

Nadya selita 19040086

Nailiyatul Hikmiyah 19040087

Nanda Ragil Baskoro 19040088

Ni Putu Dinda Prasasty 19040090

Nindia Putri 19040091

Nur Azizah Permadani 19040094

LABORATORIUM TEKNOLOGI FARMASI

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

UNIVERSITAS dr. SOEBANDI

2021/2022
A.TUJUAN

Memisahkan dan memurnikan senyawa target menggunakan kromatografi kolom.

B. DASAR TEORI

Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak

digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah
yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah
silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion.

Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk
memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Alat tersebut berupa pipa gelas yang
dilengkapi suatu kran dibagian bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair, ukuran kolom
tergantung dari banyaknya zat yang akan dipindahkan. Secara umum perbandingan panjang dan
diameter kolom sekitar 8:1 sedangkan daya penyerapnya adlah 25-30 kali berat bahan yang akan
dipisahkan. Teknik banyak digunakan dalam pemisahan senyawa-senyawa organic dan
konstituen-konstituen yang sukar menguap sedangkan untuk pemisahan jenis logan-logam atau
senyawa anorganik jarang dipakai (Yazid, 2005, hal: 98).

Pelarut (fase gerak) dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan
oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita, senyawa linarut bergerak melalui kolom
dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas
kolom. Kromatografi kolom konvensional memiliki berbagai keterbatasan dalam penggunannya,
kromatografi kolom vakum dapat meningkatkan laju pengelusian dan mempersingkat waktu
kontak linarut dengan penjerap

C. ALAT & BAHAN

Alat : Bahan :

 Gelas beker 100ml,250ml silica gel

 Kolom kromatografi pelarut
 Batang pengaduk aquadest
 Kertas saring
 Oven
D. Cara kerja:

Silica gel sebanyak 100x bobot sampel dimasukkan dalam Erlenmeyer dan ditambahkan
dengan eluen ±2cm di atas permukaan silica gel. Lalu dikocok pelan hingga merata dan
masukkan dengan hati hati ke dalam kolom kromatografi yang diberi kapas.

Sebelum penuangan, dinding luar kolom kromatografi disemprot dengan etanol .kemudian
diamkan selama 30menit untuk menempatkan dan melihat ada tidaknya keretakan

Apabila kolom tidak retak tambahkan eluen ±0,5cm di atas permukaan silica gel dan bila
retak,ulangi langkah 1. Kemudian ke dalam kolom ditambahkan sampel (1% bobot
silica)yang telah dicampur dengan silica gel.

Alirkan eluen dan ditampung sebanyak ±50ml dalam Erlenmeyer (eluen ini belum membawa
sampel sehingga dapat digunakan kembali sebagai fase gerak)

Selanjutnya kran dibuka dan diatur penetesanya (1 tetes/detik) dan ditampung dalam vial atau
tamping yang telah diberi nomor masing masing vial 25ml (10vial) pada setiap vial dilakukan
uji KLT untuk melihat noda yang dihasilkan

Apabila menghasilkan noda yang sama, vial vial tersebut digabung. Oenetesan dihentikan
apabila vial sudah tidak memberikan noda saat diuji KLT.

E. HASIL PERCOBAAN

 Sampel : Metil Yellow dan Metil Green

 Jarak yang ditempuh sampel nomer 1 = 4,2 cm
 Jarak yang ditempuh sampel nomer 5 = 4,2 cm
 Jarak yang ditempuh sampel nomer 9 = 4,2 cm
 Jarak yang ditempuh sampel nomer 13 =1,3 cm
 Jarak yang ditempuh sampel nomer 1 = 1,3 cm
 Jarak yang ditempuh oleh pelarut = 4,5 cm
F. PERHITUNGAN

Rf =

Nilai Rf
,
 Sampel no 1 = ,
= 0.93
,
 Sampel no 5 = ,
= 0,93
,
 Sampel no 9 = ,
= 0,93
,
 Sampel no 13 = ,
= 0,29
,
 Sampel no 15 = ,
= 0,29

G. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan pemisahan dan pemurnian senyawa target
menggunakan kromatografi kolom. Kromatografi kolom adalah kromatografi yang
menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran.
Alat tersebut berupa pipa gelas yang dilengkapi suatu kran dibagian bawah kolom untuk
mengendalikan aliran zat cair, ukuran kolom tergantung dari banyaknya zat yang akan
dipindahkan.

Prinsip metode pemisahan kromatografi kolom ini memerlukan bahan kimia yang cukup
banyak sebagai fasa diam dan fasa bergerak bergantung pada ukuran kolom gelas. Untuk
melakukan pemisahan campuran dengan metode kromatografi kolom diperlukan waktu yang
cukup lama, bisa berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran. Selain itu, hasil
pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar mendapatkan pemisahan secara sempurna
karena pita komponen yang satu bertumpang tindih dengan komponen lainnya. Masalah waktu
yang lama disebabkan laju alir fasa gerak hanya dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi, ukuran
diameter partikel yang cukup besar membuat luas permukaan fasa diam relatif kecil sehingga
tempat untuk berinteraksi antara komponen-komponen dengan fasa diam menjadi terbatas.
Apabila ukuran diameter partikel diperkecil supaya luas permukaan fasa diam bertambah
menyebabkan semakin lambatnya aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak mengalir sama sekali.
Selain itu fasa diam yang sudah terpakai tidak dapat digunakan lagi untuk pemisahan campuran
yang lain karena sukar meregenerasi fasa diam (Hendayana, 2006: 2-3). Pada percobaan ini
digunakan bahan silica gel.
 Pada skala laboratorium, silika gel biasa digunakan untuk pemisahan senyawa organik
pada analisis kromatografi kolom. Penggunaan silika gel pada kromatografi kolom umumnya
membutuhkan kuantitas silika gel yang cukup banyak, sedangkan secara ekonomis harga silika
gel cukup mahal. Hal ini menyiratkan bahwa diperlukan cara alternatif untuk memperoleh silika
gel dengan kualitas baik namun memiliki nilai ekonomis yang tinggi.

Kromatografi kolom merupakan metode yang digunakan untuk pemisahan komonen dari
suatu senyawa. Metode ini bisa digunakan untuk menganalisis komponen suatu senyawa
berdasarkan kualitatif maupun kuantitatif. Prosedur awal dari metode ini adalah penyiapan
kolom dan fase diam. Fase diam yang digunakan adalah silica gel karena memiliki tekstur yang
lebih kompak dan teratur. Saat memadat, silica gel akan berbentuk tetrahedral raksasa sehingga
ikatannya kuat dan rapat,sehingga proses pemisahannya menjadi optimal. Awalnya pada
praktikum kelompok kami Silica gel sebanyak 100x bobot sampel dimasukkan dalam erlenmeyer
dan ditambahkan dengan eluen ±2cm di atas permukaan silica gel, dikocok pelan hingga merata
dan masukkan dengan hati-hati ke dalam kolom kromatografi yang pada bagian awalnya telah
diberi kapas.

Sebelum penuangan, dinding luar kolom kromatograf disemprot dengan etanol. Kolom
tersebut kemudian didiamkan selama 30menit untuk memampatkan dan melihat ada tidaknya
keretakan. Alasan memasukkan dengan hati-hati ke dalam kolom kromatografi adalah agar
gelembung udara tidak terjebak di tengah-tengah silica, jika ada gelembung udara akan
mengurangi kesuksesan proses pemisahan atau terdapat keretakan. Setelah itu Apabila kolom
tidak retak, tambahkan eluen 0,5cm di atas permukaan silica gel dan bila retak ulangi langgkah a.
kemudian ke dalam kolom ditambahkan sampel(1% bobot silica) yang telah dicapur dengan
silica gel. Untuk meratakan sususnan silica, kolom ditepuk-tepuk perlahan hingga teksturnya
menjadi rapat dan padat. Setelah itu Alirkan eluen dan ditampung sebanyak ±50 ml dalam
erlenmeyer (eluen ini belum membawa sampel sehingga dapat digunakan kembali sebagai fase
gerak).

Selanjutkan kran dibuka dan diatur penetesnnya (1 tetes/detik) dan ditampung dalam vial
atau tampung yang telah diberi nomor masing-masing vial 25ml (10vial). Tahap terpenting
adalah proses elusi. Elusi dimasukkan perlahan dengan pipet tetes kapiler melalui dinding kolom.
Disamping pemasukan eluen, kran kolom dibuka dan tetesannya diatur sedemikian rupa agar
tidak terlalu pelan atau cepat. Eluen yang ada di kolom harus selalu diamati agar tingginya tidak
menyerupai permukaan silica., ini bertujuan agar silica tidak kering dan retak. Eluen yang keluar
dimasukkan dalam botol vial berdasarkan warnanya. Lalu pada setiap vial dilakukan uji KLT
untuk melihat noda yang dihasilkan. Apabila menghasilkan noda yang sama, vial-vial tersebut
digabung. Penetesan dihentikan apabila vial sudah tidak meberikan noda saat diuji KLT.

Penuangan eluen dilakukan secara berurutan mulai dari non polar hingga non polar.
Komponen yang bersifat polar akan terikat dengan permukaan silica sehingga akan tertahan
sementara. Sedangkan komponen yang bersifat non ,polar akan terbawa dengan eluen non polar
keluar kolom. Saat eluen polar masuk, komponen yang bersifat polar akan terlepas dari silica dan
ikut keluar bersama eluen. Noda yang tampak pada lempeng KLT tersebut dideteksi dengan
menggunakan sinar UV, kemudian noda tersebut ditandai untuk dihitung nilai Rf. Apabila pada
lempeng KLT menghasilkan noda yang sama dapat digabung karena dalam vial tersebut
memiliki nilai Rf yang sama dengan nilai Rf standar maka senyawa yang sama dengan standar.
Penetasan dapat dihentikan apabila vial terakhir sudah tidak memberikan noda saat diuji KLT
karena dianggap dalam larutan vial tersebut sudah tidak terdapat komponen senyawa dalam
sampel.

Pada praktikum ini didapatkan data hasil pemisahan dan pemurnian senyawa target
menggunakan kromatografi kolom yaitu dihasilkan jarak yang ditempuh oleh pelarut adalah 4,5
cm dan jarak yang ditempuh oleh sampel no 1 ; 5 ; 9 ; 13 ; 15 adalah sebesar 0,93 ; 0,93 ; 0,93 ;
0,29 ; 0,29. Dari data yang diperoleh, dapat disimpulakn bahwa dalam praktikum kali ini
berhasil memisahkan senyawa target. karena pada sampel dengan nilai Rf 0,93 mengahasilkan
warna hijau (metil green) yaitu sampel no 1, 5 & 9. Sedangkan pada sampel dengan nilai Rf 0,29
menghasilkan warna kuning (metil yellow) yaitu sampel 13 & 15.

Metil hijau (CI 42585) adalah pewarna kationik atau bermuatan positif, terkait dengan
Etil Hijau, yang telah digunakan untuk pewarnaan DNA sejak abad ke-19. Ini telah digunakan
untuk pewarnaan inti sel baik sebagai bagian dari pewarnaan Unna-Pappenheim klasik, atau
sebagai counterstain nuklir sejak saat itu.

Metil yellow merupakan senyawa kimia azo aromatic amin yang dapat menimbulkan
tumor dalam berbagai jaringan hati, kandung kemih, saluran pencernaan atau jaringan kulit.
Metil yellow dibuat dari asam metanilat dan difenilamin. Hasil nilai RF yang diperoleh memiliki
nilai yang hamoir sama, menandakan kemungkinan senyawa tersebut adalah senyawa yang
sama.

TITIK KRITIS

Apabila eluen yang dibuat sudah jadi,Silika gel dimasukkan ke dalam beaker glass dan
ditambahkan dengan eluen di atas permukaan silika gel, dikocok pelan hingga merata.Kemudian
silika gel tersebut dimasukkan kedalam kolom kromatografi ( yang pada bagian bawahnya telah
diberi kapas ) dengan hati – hati.(Tujuan penambahan eluen pada silika gel adalah agar saat
silika gel dimasukkan ke dalam kolom kromatrogafi agar tidak terdapat gelembung udara pada
kolom kromatografi yang dapat menahan pergerakan eluen maupun sampel, sehingga proses
pemisahan tidak optimal).

Sebelum silika gel dimasukkan kedalam kolom, bagian bawah kolomdiberi kapas.(Hal ini
bertujuan untuk mencegah bahan padat seperti bubuk silika gel pada kolom kromatografi keluar
saat kran pada kolom kromatografi dibuka). Selain itu, sebelum penuangan dilakukan dinding lua
kolom kromtografi disemprot dengan etanol.(Tujuan dinding luar disemprot dengan etanol
adalah untuk mengurangi keretakan pada kolom kromatografi dan meminimalisir timbulnya
gelembung udara.) Setelah silika gel dimasukkan ke dalam kolom , Kolom kromatografi
didiamkan selama 30 menit untuk memampatkan dan melihat ada tidaknya keretakan. Apabila
kolom tidak retak, ditambahkan eluen diatas permukaan silika gel dan apabila terjadi keretakan,
ulangi langkah paling awal.

Pada saat penampungan fraksi larutan dalam vial, eluen juga harus ditambahkan terus
menerus kedalam kolom kromatografisambil kolom diketok-ketok dengan pelan. Pengetokan
kolom kromatografi bertujuan agar densitas cairan merata dan menghilangkan adanya
gelembung udara yang dapat menyebabkan keretakan kolom kromatografi sehingga proses
emisahan dapa berjalan dengan sempurna dan optimal.) Penampungan larutan kedalam vial
dilakukan berdasarkan fraksi larutan yang memiliki warna yang sama dan sudah terpisah dari
komponen lainnya.(Hal ini, bertujuan untuk mendapatkan sampel yang mungkin sudah sama dan
sudah terpisah dari komponen senywa lainnya.Setelah itu, pada setiap vial dilakukan uji KLT
untuk melihat noda yang dihasilkan.

H. KESIMPULAN

Pada praktikum ini didapatkan nilai Rf 0,93 mengahasilkan warna hijau (metil green)
yaitu sampel no 1, 5 & 9. Sedangkan pada sampel dengan nilai Rf 0,29 menghasilkan warna
kuning (metil yellow) yaitu sampel 13 & 15.

I. DAFTAR PUSTAKA

Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan. Bandung: Remaja Rosdakarya.

Hidayati, Sholihatil. 2021. Petunjuk Praktikum Rancangan Obat. Stikes dr Soebandi. Jember

Tungkananurak, K., Kerdsiri, S., Jadsadapattarakul, D. & Burns, D. T., Semi-micropreparation

and characterization of mesoporous silica microspheres from rice husksodium silicate
using a non-ionic surfactant as a template: Application in normal phaseHPLC columns.
Microchim. Acta, 159(3–4): 217–222 (2007).

Yazid, Estien. 2005. Kimia Fisika Paramedis. Yogyakarta: Andi