Subscribe to DeepL Pro to translate larger documents.

Visit www.DeepL.com/pro for more information.

Martinez-Garcia dan van der Maarel AMB Expr (2016) 6:71

DOI 10.1186/s13568-016-0244-6

ARTIKEL ASLI Akses

Terbuka

Produksi floridosida oleh si merah

mikroalga Galdieria sulphuraria di bawah
kondisi pertumbuhan dan tekanan osmotik
yang berbeda
Marta Martinez-Garcia dan Marc J. E. C. van der Maarel*

Abstrak
Floridoside adalah zat terlarut yang kompatibel yang disintesis oleh ganggang merah yang telah menarik banyak
perhatian karena sifat antifouling dan terapeutiknya yang menjanjikan. Namun, penelitian tentang aplikasi industri
floridosida terhambat oleh ketersediaan senyawa yang terbatas dan pengembangan proses produksi yang
menghasilkan glikosida dalam jumlah besar belum dieksplorasi. Dalam penelitian ini, akumulasi floridosida oleh
mikroalga merah Galdieria sulphuraria di bawah kondisi yang berbeda diselidiki untuk mengoptimalkan produksi glikosida
ini dalam mikroalga ini. G. sulphuraria menunjukkan keunggulan dibandingkan ganggang merah lainnya sebagai
produsen industri potensial floridosida karena sifatnya yang uniseluler, kemampuannya untuk tumbuh secara heterotrofik
dalam kegelapan total dan gaya hidupnya yang asidofilik.
Zat terlarut utama yang kompatibel yang diakumulasi oleh G. sulphuraria di bawah cekaman garam telah
dimurnikan, diidentifikasi sebagai floridosida oleh1 H-NMR dan digunakan sebagai standar untuk kuantifikasi. Hasil
penelitian kami menunjukkan bahwa menerapkan tekanan osmotik setelah
Sel yang ditumbuhkan terlebih dahulu pada medium tanpa garam menghasilkan hasil floridosida yang lebih tinggi
dibandingkan dengan sel yang ditumbuhkan pada medium yang mengalami tekanan osmotik sejak awal. Di antara
beberapa parameter yang diuji, penggunaan gliserol sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan sel menunjukkan
dampak yang paling signifikan terhadap akumulasi floridosida, yang mencapai maksimum
56,8 mg/g biomassa kering.
Kata kunci: Mikroalga merah, Zat terlarut yang kompatibel, Stres osmotik, Floridosida, Galaktosilgliserol, Galdieria
sulphuraria

et al. 2001, 2002). Terlepas dari

Pendahuluan
Zat terlarut yang kompatibel adalah molekul organik
kecil yang disintesis oleh sel dalam berbagai kondisi
stres yang dapat diakumulasikan pada konsentrasi
intraseluler yang tinggi tanpa mengganggu fungsi normal
metabolisme (da Costa et al. 1998; Roberts 2005;
Hagemann dan Pade 2015). Floridoside (2-O-α-d-
galactopyranosylglycerol) adalah zat terlarut yang
kompatibel yang disintesis oleh hampir semua spesies
alga merah, kecuali anggota kelas Ceramidiales, di
bawah kondisi tekanan osmotik yang tinggi (Kirst dan
Bis- son 1979; Reed 1985; Ekman dkk., 1995). Glikosida
ini juga merupakan kumpulan karbon terlarut utama
yang difiksasi oleh fotosintesis dan merupakan prekursor
untuk polisakarida dinding sel pada beberapa spesies (Li
 kelautan (Callow dan Callow 2002). Selain itu,
Selain peran in vivo sebagai osmolit, floridosida telah
floridosida adalah agen terapeutik potensial dengan
dideskripsikan memiliki sifat-sifat tertentu yang telah
kemampuan untuk memodulasi respon imun (Courtois
meningkatkan ketertarikan pada molekul ini. Hellio dkk.
et al. 2008; Kim et al. 2013) dan untuk meningkatkan
(2004) melaporkan bahwa floridosida mampu
pembentukan tulang (Ryu et al. 2015). Floridoside
menghambat pengendapan larva cryptid di permukaan
memiliki kemiripan struktural dengan 2-O-α-d-
perangkat bawah air, menunjukkan aplikasinya sebagai
glukopiranosilgliserol (GG), zat terlarut yang
senyawa alami yang tidak beracun untuk mencegah
kompatibel yang diakumulasi oleh cyanobacteria yang
biofouling, masalah di seluruh dunia yang diperkirakan
dianggap sebagai agen pelembab yang menjanjikan
menyebabkan kerugian miliaran dolar pada industri
(Thiem et al.
1997), pemanis non-kariogenik dan rendah kalori
(Takenaka
*Korespondensi: m.j.e.c.van.der.maarel@rug.nl dan Uchiyama 2000) dan penstabil protein (Sawangwan
Bioteknologi Akuatik dan Rekayasa Bioproduk, Teknik et al. 2010). Kemiripan struktural menunjukkan bahwa
and Technology Institute Groningen (ENTEG), Universitas Groningen,
Groningen, Belanda
sisi florido mungkin juga fungsional dalam aplikasi ini.

© 2016 Penulis(-penulis). Artikel ini didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi Atribusi Creative Commons 4.0 Internasional
(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi tanpa batas dalam
media apa pun, asalkan Anda memberikan kredit yang sesuai kepada penulis asli dan sumbernya, memberikan tautan ke
lisensi Creative Commons, dan menunjukkan jika ada perubahan.
Martinez-Garcia dan van der Maarel AMB Expr (2016) 6:71 Halaman 2
dari 8

Pengembangan aplikasi industri floriidosida dan pencahayaan konstan 100 µE/m2s. Koloni
terhambat oleh ketersediaan senyawa yang terbatas.
Sintesis kimiawi floridosida telah dilaporkan, meskipun
dengan hasil yang tidak mencukupi dan membutuhkan
s e r a n g k a i a n langkah untuk mengarahkan reaksi ke
arah produk yang murni secara stereokimia (Weïwer
dan Linhardt 2008). Sampai saat ini, belum ada
penelitian yang menjelaskan tentang produksi enzimatik
floridosida, tetapi strategi ini telah digunakan untuk
sintesis senyawa terkait 3-O-β-d-galaktopiranosilgliserol
dan GG (Takenaka dan Uchiyama 2000; Goedl dkk.
2008; Wei dkk. 2013; Jeong dkk. 2014). Meskipun
penggunaan glikosidase mengambil keuntungan dari
stereospesifikitas enzim ini ketika membentuk
hubungan dalam satu langkah, ia menderita karena
kurangnya oselektivitas terhadap gugus hidroksil
tertentu, yang mengarah ke produk menjadi campuran
regioisomer (Scigelova et al. 1999) yang dapat
mempersulit proses hilir. Ekstraksi floridosida dari
produsen alami,
yaitu ganggang merah, merupakan alternatif yang
menjanjikan tetapi membutuhkan optimalisasi kondisi
budidaya untuk meningkatkan produksi glikosida ini
oleh sel.
Dalam penelitian ini, kami memilih mikroalga merah
ekstremofilik Galdieria sulphuraria sebagai penghasil
floridosida. Rhodophyta uniseluler ini merupakan salah
satu eukariota paling primitif di bumi (Yoon et al. 2006)
dan tumbuh subur di lingkungan asam dengan nilai pH
dari 0 hingga 4 dan suhu hingga 56 °C. G. sulphuraria
juga merupakan spesies yang fleksibel secara metabolik,
mampu tumbuh dalam kegelapan total dengan
menggunakan berbagai sumber karbon (Gross dan
Schnarrenberger 1995) dan menunjukkan toleransi
terhadap berbagai tekanan (Schönknecht et al. 2013;
Minoda et al. 2015; Pade et al. 2015). Sifatnya yang
uniseluler akan memberikan G. sulphuraria keunggulan
dibandingkan spesies alga merah multi seluler lainnya
untuk budidaya skala besar dan akan memungkinkan
untuk menghindari variasi musiman dalam produksi
floridosida yang dilaporkan untuk rumput laut yang
dipanen dari habitat laut (Kasrten dkk. 1993; Meng dan
Srivastava 1993; Kerjean dkk. 2007). Selain itu, gaya
hidup asidofiliknya akan sangat mengurangi risiko
kontaminasi mikroba selama fermentasi skala besar.
Dalam penelitian ini, kami menganalisis akumulasi
floridosida di bawah kultivasi sel yang berbeda dan
kondisi stres osmotik untuk mengoptimalkan produksi
sisi gliko pada G. sulphuraria.

Bahan dan metode

Strain dan kondisi budidaya
Galdieria sulphuraria strain SAG 108.79 dibeli dari
koleksi kultur Universitas Göttin- gen (Sammlug von
Algenkulturen, Göttingen, Jerman). Sel-sel dipelihara
tumbuh di atas lempeng media mini- eral Allen (Allen
1959) pada pH 4 dengan 1,5% (b/v) agar pada suhu 40°C
Martinez-Garcia dan van der Maarel AMB Expr (2016) 6:71 menggunakan isopropanol: etilasetat: air (3:Halaman
1: 31
dipindahkan ke cawan baru sebulan sekali. Untuk dari 8
berdasarkan volume) sebagai fase gerak. Identitas dan
kultur cair, G. sulphuraria ditumbuhkan pada suhu
kemurnian
40°C dalam keadaan gelap gulita di atas pengocok putar
dengan kecepatan 150 rpm dalam medium Allen pada
pH 2 yang ditambah dengan 1% (w/v) gliserol dan, jika
diperlukan, NaCl dengan konsentrasi 0,5, 1 atau 1,5 M.
Pertumbuhan sel dimonitor dengan mengukur OD
pada 800 nm.
Untuk memurnikan floridosida yang dapat digunakan
sebagai standar, sel ditumbuhkan hingga fase
eksponensial akhir dan kemudian diberi garam dengan
1 M NaCl selama 24 jam pada suhu 40 ° C. Untuk
membangun rangkaian waktu kandungan floridosida
dan gliko-gen setelah penambahan garam, sel
ditumbuhkan hingga fase eksponensial akhir dan
kemudian diberi tekanan garam dengan 1 M NaCl
selama 0, 4, 8, 16, 24, dan 48 jam pada suhu 40 ° C.
Untuk menentukan pengaruh sumber karbon dan jenis
serta konsentrasi agen osmotik pada produksi
floridosida, sel ditumbuhkan pada sumber karbon 1%
(w/v) (gliserol, galaktosa atau glukosa) hingga fase
eksponensial akhir, dipanen dan dicuci dengan air
ultra-murni dan disuspensikan kembali dalam 100 mL
agen osmotik (NaCl, KCl, CaCl2 atau sorbitol) dengan
konsentrasi yang berbeda (jika ada, 0.5, 1 atau 1,5 M)
selama 24 jam pada suhu 40 °C. Untuk menguji
pengaruh suhu terhadap produksi floridosida, sel
ditumbuhkan hingga fase eksponensial akhir pada 1%
gliserol, diberi garam dengan 1 M NaCl dan diinkubasi
pada suhu 20, 30 atau 50 ° C selama 24 jam. Untuk
percobaan dengan kondisi stres osmotik bertahap, sel
ditumbuhkan hingga fase eksponensial akhir dan
kemudian diberi garam dengan NaCl yang
ditambahkan dalam 2, 5 atau 10 langkah hingga
konsentrasi akhir 1 M selama 24 jam pada suhu 40 ° C.

Perolehan fraksi senyawa dengan berat molekul rendah

(LMW) dan pemurnian floridosida
Sel-sel yang mengalami tekanan osmotik dipanen
dengan sentrifugasi pada 5000 × g selama 5 menit,
dicuci dua kali dengan air ultra-murni dan dikeringkan
dengan cara dibekukan. Pelet sel kering dicampur
dengan 20 mL etanol 80% dan senyawa dengan berat
molekul rendah diekstraksi dari sel dengan dua putaran
pengadukan selama 15 menit ditambah 15 menit
inkubasi dalam penangas ultrasonik (Elma) pada suhu
kamar, diikuti dengan inkubasi akhir dalam penangas
air pada suhu 70 ° C selama 5 menit. Puing-puing sel
dihilangkan dengan sentrifugasi pada 10.000 × g selama
10 menit dan supernatannya dicampur dengan satu
volume air ultra murni dan 0,5 volume kloroform.
Setelah pemisahan kedua fase dengan sentrifugasi pada
10.000 × g selama 10 menit, fase atas (hidroalkohol)
dipindahkan ke tabung baru dan dicampur dengan resin
ionik Amberlite MB20 (DOW) semalaman. Supernatan
dipekatkan di bawah vakum pada rotary evaporator
dan dikeringkan dengan cara dibekukan. Residu kering
disuspensikan kembali dalam 1 mL air ultra-murni. Ini
disebut sebagai fraksi LMW. Flori-dosida dimurnikan
dari fraksi ini dengan kromatografi lapis tipis preparatif
(KLT) pada pelat silika gel 60 (Merck-Millipore)
Martinez-Garcia dan van der Maarel AMB Expr (2016) 6:71 Halaman 4
dari 8

tersebut diidentifikasi sebagai floridosida menurut

floridosida dikonfirmasi dengan analisis1H-NMR.
Sampel dilarutkan dalam 600 µL deuterium oksida (D2
O, 99,9%atom , Sigma-Aldrich), dibekukan dan ditukar
dalam pelarut yang sama sekali lagi. Spektrum1 H-NMR
direkam pada spektrometer Varian 500 (NMR cen- tre,
University of Groningen, Belanda) pada suhu probe 25 °
C. Aseton (δ 1H 2,225 ppm dalam D2 O) digunakan
sebagai referensi internal untuk penentuan pergeseran
kimia dan data dianalisis menggunakan MestReNova
9.1.0 (Mestrelab Research S.L).

Kuantifikasi Floridosida
Fraksi floridosida dianalisis dengan kromatografi
penukar anion pH tinggi yang digabungkan dengan
deteksi amperometrik berdenyut (HPAEC-PAD) pada
stasiun kerja ICS3000 yang dilengkapi dengan kolom
CarboPac PA-1 (2 × 250 mm) dan detektor ICS3000 ED
(Dionex) menggunakan elusi isokratis dalam 50 mM
NaOH. Serangkaian standar floridosida yang
dimurnikan dalam kisaran konsentrasi 5-500 µM
digunakan untuk membuat kurva kalibrasi untuk
kuantifikasi. Hasil floridosida dinyatakan relatif terhadap
biomassa kering.

Ekstraksi dan kuantifikasi glikogen

Glikogen diekstraksi dari sel G. sulphuraria seperti yang
telah dijelaskan sebelumnya (Martinez-Garcia et al.
2016) dan dikuantifikasi relatif terhadap biomassa
kering. Untuk membandingkan kandungan glikogen
pada fase pertumbuhan yang berbeda, semua suspensi
sel disiapkan untuk gangguan pada konsentrasi yang
sama yaitu 50 mg sel kering / mL air.

Hasil
Galdieria sulphuraria ditumbuhkan secara heterotrofik
dalam medium yang mengandung 1% gliserol dan
konsentrasi NaCl yang berbeda dan pertumbuhan sel
dimonitor dengan mengukur nilai OD pada 800 nm.
NaCl memiliki efek pada durasi fase lag sebelum
pertumbuhan eksponensial dan nilai OD maksimum
yang dicapai oleh kultur (Gbr. 1). Pada kultur yang
mengandung 0,5 dan 1 M NaCl, fase lag memiliki durasi
yang sama (48-56 jam) dibandingkan dengan kultur
tanpa garam. Kultur yang mengandung 1,5 M NaCl
menunjukkan fase lag yang jauh lebih lama jika
dibandingkan dengan yang lain (144 jam), setelah itu sel
masih dapat tumbuh secara signifikan. Nilai OD
maksimum dipengaruhi oleh NaCl dengan cara yang
bergantung pada konsentrasi. Meskipun demikian, semua
kultur yang mengalami cekaman garam mencapai nilai
OD yang mendekati atau lebih tinggi dari 7.
Untuk mengidentifikasi zat terlarut utama yang
kompatibel dalam G. sulphuraria, senyawa dengan berat
molekul rendah dari sel yang mengalami tekanan
osmotik diekstraksi dengan 80% etanol-nol. Konstituen
utama dari fraksi ini dimurnikan dengan KLT preparatif
dan dianalisis dengan1H-NMR (Gbr. 2). Senyawa
Martinez-Garcia dan van der Maarel AMB Expr (2016) 6:71 Halaman 5
pergeseran kimia yang dilaporkan oleh Simon-Colin dari 8
dkk. (2002). Kemurnian floridosida dikonfirmasi
dengan tidak adanya sinyal pada 4,9 ppm, karakteristik
proton anomali pada isofloridosida (1-O-α-d-
galaktopiranosilgliserol) (Bondu et al. 2007).
Floridosida yang telah dimurnikan ini digunakan untuk
menyiapkan kurva kalibrasi untuk mengukur produksi
glikosida oleh G. sulphuraria di bawah kondisi
pertumbuhan dan tekanan osmotik yang berbeda.
Karena pertumbuhan sel tertunda oleh penambahan
NaCl, terutama pada konsentrasi tinggi, kami
memutuskan untuk menganalisis kandungan
floridosida dalam sel yang mengalami tekanan osmotik
hanya setelah ditumbuhkan dalam medium tanpa
garam dan membandingkannya dengan sel yang
tumbuh di bawah tekanan osmotik. Dengan strategi ini,
hasil biomassa yang lebih tinggi dapat diperoleh dan
durasi proses produksi akan dipersingkat. Untuk
menentukan titik waktu kurva pertumbuhan di mana
tekanan osmotik harus diterapkan untuk mendapatkan
hasil floridosida tertinggi, kami mengukur jumlah
biomassa, glikogen, dan floridosida pada fase
pertumbuhan yang berbeda (Tabel 1). Pada fase
pertumbuhan eksponensial akhir dan stasioner, jumlah
biomassa (masing-masing 4,15 dan 4,94 g sel kering /
L) dan jumlah glikogen yang diakumulasikan oleh sel
(masing-masing 36,76 dan 35,40% dari biomassa
kering) sangat mirip. Namun, jumlah floridosida 3 kali
lebih tinggi pada fase eksponensial akhir daripada fase
stasioner. Akibatnya, pada percobaan selanjutnya,
tekanan osmotik diterapkan setelah sel mencapai fase
pertumbuhan eksponensial akhir dalam medium tanpa
garam.
Sebuah rangkaian waktu akumulasi floridosida
setelah aplikasi stres osmotik dilakukan untuk
mengidentifikasi saat di mana jumlah glikosida
maksimal. Kandungan floridosida menunjukkan
peningkatan hampir lima kali lipat selama 8 jam
pertama setelah penambahan garam dan kemudian
peningkatan yang lebih moderat selama

Gbr. 1 Kurva pertumbuhan G. sulphuraria pada medium yang

mengandung 1% gliserol dan konsentrasi NaCl yang berbeda pada
pH 2 dan 40°C dalam keadaan gelap gulita
Martinez-Garcia dan van der Maarel AMB Expr (2016) 6:71 Halaman 6
dari 8

Gbr. 21 Spektrum1 H-NMR floridosida yang telah dimurnikan dari G. sulphuraria. Pergeseran kimia pada 4,8 ppm adalah sinyal sisa air dalam sampel

Tabel 1 Hasil biomassa, glikogen, dan floridosida pada berbagai fase pertumbuhan G. sulphuraria pada medium dengan
1% g l i k o l dan tanpa garam
Fase pertumbuhan Biomassa (g sel kering/L) Glikogen (% biomassa kering) Floridosida (% biomassa
kering)
Eksponensial awal 0.69 ± 0.09 20.07 ± 1.39 0.52 ± 0.02
Eksponensial tengah 2.68 ± 0.51 29.39 ± 2.50 1.20 ± 0.04
Eksponensial akhir 4.15 ± 0.19 36.76 ± 2.03 1.41 ± 0.14
Alat tulis 4.94 ± 0.17 35.40 ± 5.79 0.47 ± 0.06
Nilai mewakili rata-rata dari tiga pengukuran independen ± standar deviasi

mengalami stres osmotik setelah mencapai akhir

jam hingga mencapai maksimum 5,4% dari massa bio
kering setelah 24 jam (Gbr. 3). Mempertahankan
tekanan osmotik dalam waktu yang lebih lama (48 jam)
tidak menghasilkan akumulasi floriosida yang lebih
tinggi. Kandungan glikogen sedikit menurun selama 8
jam pertama, bersamaan dengan peningkatan floriidoide
selama periode tersebut, dan kemudian menunjukkan
nilai yang bervariasi selama sisa titik waktu, yang
tercermin dari deviasi standar yang tinggi yang
diperoleh.
Kami kemudian membandingkan akumulasi
floridosida dalam kultur fase eksponensial akhir yang
tumbuh di bawah tekanan osmotik pada konsentrasi
NaCl yang berbeda dengan kultur yang ditumbuhkan
sebelumnya pada media tanpa garam dan kemudian
diberi tekanan osmotik selama 24 jam. Strategi yang
terakhir menghasilkan peningkatan hasil floridosida
secara signifikan, yang sekitar 10 kali lebih tinggi dalam
kasus kultur yang diberi tekanan osmotik dengan 1 dan
1,5 M NaCl (Gbr. 4). Pada sel yang tumbuh di bawah
tekanan osmotik, akumulasi floridosida tidak
berkorelasi dengan peningkatan konsentrasi garam,
karena kandungan glikosida lebih tinggi pada kultur
yang mengandung 0,5 M NaCl daripada kultur dengan
jumlah garam yang lebih besar. Dalam sel yang
Martinez-Garcia dan van der Maarel AMB Expr (2016) 6:71 Halaman 7
dari 8

Gbr. 3 Perjalanan waktu kandungan floridosida dan glikogen

pada G. sulphuraria setelah penambahan 1 M NaCl. Nilai mewakili rata-
rata dari tiga pengukuran independen ± standar deviasi

Pada fase pertumbuhan eksponensial, peningkatan

NaCl dari 0,5 menjadi 1 M menghasilkan peningkatan
dua kali lipat dalam kandungan floridosida, tetapi
konsentrasi garam yang lebih tinggi tidak menghasilkan
lebih banyak glikosida.