MENDETEKSI ALERGEN MAKANAN DENGAN ELISA

DAN METODE UMUM LAINNYA

(Makalah ini disusun sebagai tugas mata kuliah Mikrobiologi dan

Bioteknologi Pangan)

Disusun oleh :
Dwita Nafila (A2B023001)
Diana Kamilah (A2B023008)
Delia Meilani (A2B023009)

Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Riset, dan Teknologi

Universitas Jenderal Soedirman
Fakultas Pertanian
Purwokerto
2023
 PENDAHULUAN

Alergi makanan menjadi masalah kesehatan masyarakat yang utama di daerah-

daerah yang sudah mapan, yang merupakan ancaman yang signifikan bagi kesehatan
manusia dalam beberapa tahun terakhir. Terjadinya alergi makanan telah meningkat
selama bertahun-tahun yang memberikan tantangan serius bagi para ahli alergi dan
ilmuwan makanan. Istilah 'alergi makanan' telah didefinisikan oleh European Academy
of Allergology and Clinical Immunology (EAACI), "Alergi adalah reaksi
hipersensitivitas yang diprakarsai oleh mekanisme imunologi", sedangkan alergen
makanan sebenarnya adalah konstituen dalam makanan yang memperparah reaksi
imunologi. Reaksi yang merugikan/hipersensitif terhadap makanan dapat berupa reaksi
beracun atau tidak beracun, di mana tidak beracun dapat berupa reaksi yang diperantarai
oleh kekebalan atau reaksi yang tidak diperantarai oleh kekebalan. Efek samping
makanan yang melibatkan sistem kekebalan tubuh untuk bereaksi benar-benar merupakan
alergi yang diperantarai IgE.

Alergen makanan diketahui berupa protein atau glikoprotein di alam dengan berat
molekul antara 10 hingga 70 kDa. Juga diketahui bahwa hanya sebagian kecil protein dari
berbagai famili dalam makanan tertentu yang memicu reaksi alergen. Umumnya makanan
penyebab alergi yang paling umum di seluruh dunia meliputi, kacang tanah, kacang
pohon, susu, kedelai, krustasea, telur, ikan, dan gandum. Tetapi prevalensi alergi dapat
bervariasi dari satu negara ke negara lain atau dari satu benua ke benua lain karena
preferensi makanan dari populasi umum. Gejala utama alergi yang dapat dirangsang
dengan mengonsumsi makanan yang mengandung zat-zat yang menyinggung adalah
rinitis, asma, kram, diare, muntah, eksim, angioedema, syok anafilaksis. Di antara
makanan yang menyinggung, kacang-kacangan adalah penyebab utama yang
menyebabkan alergi parah dan bahkan syok anafilaksis yang mengancam nyawa.

Karena berbagai produk makanan dapat diproduksi melalui jalur pemrosesan yang
sama (misalnya, biskuit kacang dan biskuit glukosa), sulit untuk menemukan apakah
suatu makanan terkontaminasi alergen atau tidak. Dalam kasus seperti itu, perusahaan
perlu menggunakan teknik analisis yang dapat diandalkan untuk menguji produk
makanan terhadap alergen untuk melindungi konsumen yang alergi. Pelabelan protein
alergen pada produk makanan olahan juga merupakan salah satu cara terbaik untuk
menjaga konsumen yang sensitif agar terlindungi dari alergen makanan yang
tersembunyi.

PEMBAHASAN

Berdasarkan jurnal penelitian yang dikaji, berikut adalah beberapa hal terkait allergen dan
berbagai metode yang digunakan dalam menganalisis allergen pada pangan.

A. Biokimia dari Allergen Makanan

Alergen makanan memiliki beberapa karakteristik fisikokimia yang umum,
termasuk kelarutan dalam air, berat molekul (biasanya antara 10-60 kD), stabilitas
pada pH rendah dan ketahanan terhadap panas, protease, dan denaturant lainnya.
Alergen makanan juga memiliki kemampuan untuk melawan kondisi asam lambung
dan enzim proteolitik, sehingga dapat diserap melalui usus. Di sisi lain, memasak
dapat mengurangi alergenisitas beberapa protein, tetapi meningkatkan alergenisitas
protein yang lain dengan cara memperkenalkan ikatan baru yang menghasilkan
antigen baru dengan stabilitas yang tinggi.

B. Sumber Makanan yang Penting Bagi Allergen

Pada umumnya, delapan makanan atau kelompok yang dikenal sebagai ‘Big
Eight’ adalah penyebab alergi makanan yang diperantarai IgE di seluruh dunia.
Kelompok makanan ini terdiri dari kacang tanah, susu, telur, ikan, kedelai, gandum,
gandum, kacang-kacangan (seperti almond, kenari, kacang mete, kacang hazel,
kacang Brazil, dll.) dan krustasea (seperti udang, kepiting, lobster, lobster air tawar).
Di antara sumber makanan yang menyebabkan alergi, populasi orang dewasa
umumnya alergi terhadap ikan, krustasea, kacang tanah, dan kacang-kacangan,
sementara anak-anak rentan terhadap susu sapi, gandum, putih telur, dan protein
kedelai. Secara keseluruhan, kacang tanah adalah penyebab utama yang
menyebabkan reaksi anafilaksis berat atau ringan di antara populasi negara maju.
C. Teknik Analisis yang Digunakan untuk Mendeteksi Allergen Makanan
Sangat penting untuk menemukan teknik baru yang inovatif namun dapat
diandalkan untuk mendeteksi dan mengukur alergen makanan yang tersembunyi
untuk melindungi konsumen yang sensitif. Namun, deteksi alergen tersembunyi
dalam produk makanan tidak sesederhana itu karena jumlah dan matriks makanan
yang rendah. Kedua, untuk menentukan alergenisitas produk makanan tertentu akan
membutuhkan serum yang mengandung IgE dari subjek yang sensitif. Namun, setelah
identifikasi dan isolasi alergen, antibodi spesifik dapat dibuat pada berbagai hewan
(misalnya kelinci, tikus, kambing, domba, atau ayam) untuk mendeteksi alergen
dalam makanan. Hingga saat ini, beberapa teknik telah dikembangkan untuk
mendeteksi alergen yang kuat dalam produk makanan pada tingkat jejak. Metode yang
digunakan dapat membidik alergen itu sendiri atau penanda yang menandakan
ketersediaan alergen.

D. Penghambatan Radio-allergosorbent (RAST or Enzyme-allergosorbent (EAST)

Tes RAST atau EAST, digunakan untuk IgE spesifik alergen (Fig. 1), di mana
antibodi IgE spesifik membentuk kompleks dengan alergen makanan pada fase padat
dan kemudian diukur. Tes tersebut dirancang sebagai alat untuk memverifikasi
kepekaan pasien terhadap alergi makanan atau untuk menggunakannya dalam
diagnosis klinis alergi makanan. RAST/EAST telah dimodifikasi selama bertahun-
tahun untuk mengidentifikasi alergen dalam produk makanan. Modifikasi utama
adalah dengan menginkubasi serum manusia dengan protein yang diekstraksi dari
makanan yang perlu diuji. Selanjutnya, antibodi IgE yang telah diserap sebelumnya
perlu dicuci untuk mengurangi jumlah IgE yang terikat pada alergen makanan fase
padat.
Keterbatasan utama penghambatan RAST dan EAST adalah standarisasi, yang
sangat sulit karena ketergantungannya pada sejumlah besar serum manusia.
Keterbatasan lainnya termasuk penggunaan radioisotop, biaya tinggi, kurangnya fase
padat komersial yang dapat diandalkan dan konsisten, dan kurangnya hasil yang dapat
diukur secara langsung. Keterbatasan ini mencegah metode ini digunakan untuk
mengukur alergen makanan pada tingkat komersial. Berikut diagram alir proses
Penghambatan Radio-allergosorbent (RAST or Enzyme-allergosorbent (EAST)
E. Imunoblotting atau SDS/PAGE

Alergen makanan yang dideteksi/dipisahkan dengan SDS-PAGE, terdiri dari

elektroforesis gel poliakril (PAGE) natrium dodesil sulfat (SDS) satu dimensi yang
dilanjutkan dengan imunobloting. Protein alergi dapat dipisahkan berdasarkan massa
molekul, yang kemudian dapat dideteksi dengan antibodi berlabel radio atau antibodi
berlabel enzim. Setiap pita pada prinsipnya mewakili satu protein tetapi dalam
beberapa kasus dua atau lebih protein dapat bermigrasi bersama. Namun, blotting IgE
manusia memungkinkan kita mendeteksi dan mengidentifikasi protein alergen
individu. Oleh karena itu, SDS-PAGE dan immunoblot dengan antibodi IgE manusia
dapat memainkan peran penting untuk memisahkan dan memurnikan protein alergen
baru [32]. Keterbatasan utama dari SDS-PAGE dan immunoblotting dengan IgE
adalah melelahkan dan memakan waktu, yang tidak cocok untuk lingkungan barang
konsumsi yang bergerak cepat (seperti industri makanan).

F. Imunodifusi Ganda
Prosedur ini sangat mudah dan hanya untuk pengukuran kualitatif dan
perbandingan lebih dari satu alergen makanan. Pada metode ini baik antigen maupun
antibodi pada sumurnya masing-masing dapat berdifusi satu sama lain dan
membentuk garis pengendapan pada titik ekivalen (Gbr. 2). Sensitivitas yang buruk,
memakan waktu (24-48 jam) dan hanya digunakan untuk uji kualitatif adalah
beberapa keterbatasan metode ini. Berikut diagram alir metode Imunodifusi Ganda.
G. Imuno-elektroforesis roket (RIE)
Instrumentasi elektroforesis imun roket terdiri dari antibodi yang mengandung gel
di mana migrasi protein sampel bergantung pada mobilitas elektroforesisnya. Ini
adalah pengujian di mana antigen dan antibodi mengendap bersama dalam gel
membentuk roket dengan rasio antigen: antibodi yang konstan. Penerapan RIE untuk
mendeteksi alergen yang ditutupi oleh matriks makanan masih terbatas karena dua
langkah yang sulit, yaitu persiapan gel dan pewarnaan imuno.

H. Dot Imunobloting
Dalam beberapa tahun terakhir metode dot immunoblot digunakan untuk
mendeteksi alergen dalam makanan. Ini tentunya merupakan tes semi kuantitatif yang
memungkinkan pemeriksaan sampel makanan secara sederhana dan murah untuk
mengetahui adanya alergen. Dalam pengujian ini, sampel makanan yang mengandung
protein alergi dideteksi pada membran nitroselulosa yang mengandung antibodi
berlabel enzim yang spesifik terhadap protein (antigen). Selain itu, seseorang dapat
menggunakan antibodi berlabel radio dan menganalisis pembentukan kompleks
dengan autoradiografi. Imunoblotting titik merupakan metode yang sangat sensitif
dan murah untuk menganalisis alergen makanan

I. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Saat ini metode yang paling menjanjikan untuk mendeteksi alergen adalah cDNA
protein makanan tertentu. Metode pendeteksian alergen dalam matriks makanan ini
 sangat spesifik dan menawarkan sensitivitas untuk mendeteksi alergen tertentu yang
tersembunyi dalam makanan. Selama PCR, wilayah DNA yang sangat spesifik yang
dikenal sebagai primer (sebagian kecil DNA yang berikatan secara selektif dengan
bagian DNA komplementer) diamplifikasi. Penambahan enzim polimerase
termostabil membantu primer menghasilkan salinan DNA dalam jumlah besar. Proses
amplifikasi DNA terjadi secara logaritmik dalam bentuk siklus, yaitu penggandaan
jumlah fragmen DNA setiap kalinya. Produk yang dihasilkan dipisahkan dengan
elektroforesis gel agarosa berdasarkan rasio muatan terhadap massa. Gel tersebut
kemudian diwarnai dengan pewarna fluoresen (etium bromida), yang membentuk
kompleks dengan DNA yang menghasilkan bintik oranye di bawah sinar UV.
Seseorang dapat meminimalkan reaktivitas silang dan menghindari hasil positif palsu
melalui pemilihan primer yang dapat membedakan rangkaian yang berkerabat dekat.
Meskipun PCR merupakan metode yang sangat menjanjikan untuk mendeteksi
alergen dalam makanan pada tingkat yang sangat rendah, namun kelemahan utamanya
adalah denaturasi DNA selama pemrosesan makanan dan biayanya yang mahal.

J. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Saat ini, teknik ELISA adalah metode yang paling umum digunakan untuk
mendeteksi dan mengukur alergen tersembunyi dalam produk makanan. ELISA
digunakan untuk menguji protein spesifik yang merupakan indikator terbaik
keberadaan alergen. Kelemahan terbesar dari metode ini adalah denaturasi protein
target selama pemrosesan (seperti pemasakan, pemanggangan, ekstrusi, dan
pemurnian) yang tidak lagi dapat dideteksi oleh antibodi yang digunakan dalam
pengujian. Tes ELISA melibatkan antibodi hewan berkualitas tinggi dengan hasil
yang konstan. Teknik ELISA yang paling sederhana adalah sandwich ELISA, dimana
antibodi pertama kali diadsorpsi pada fase padat yang mengikat antigen yang ada
dalam sampel. Setelah antigen-antibodi membentuk kompleks, enzim kedua yang
diberi label antibodi (antibodi sekunder), diproduksi dalam spesies berbeda, tetapi
spesifik untuk antigen yang sama, digunakan untuk mengikat antigen sampel.
Intensitas perkembangan warna yang dihasilkan bergantung pada konsentrasi antigen
pengikat. Beberapa teknik ELISA telah dikembangkan selama bertahun-tahun untuk
mendeteksi dan mengukur ekstrak protein utuh dari makanan atau alergen makanan
 tertentu. Tes dipstick (strip uji aliran lateral) menjadi sangat penting sebagai alternatif
tes ELISA dalam beberapa tahun terakhir karena murahnya, sederhana, cepat, mudah
dibawa dan tidak memerlukan instrumentasi tetapi bersifat kualitatif.

K. Direct ELISA.
Dalam metode direct ELISA, pelat mikrotiter dilapisi dengan antigen, yang
membentuk kompleks dengan antibodi berlabel. Pengikatan antibodi berlabel ke
antigen kemudian diukur dengan teknik kalorimetri, chemiluminescent, atau
fluoresen. Meskipun langkah antibodi sekunder dihilangkan, ELISA jenis ini
tampaknya relatif cepat sehingga menghindari reaktivitas silang dari antibodi
sekunder dengan komponen lain dari sampel makanan. Namun, pra ELISA
memerlukan pelabelan pada setiap antibodi, yang dapat memakan waktu dan juga
mahal. Selain itu, metode direct juga tidak memiliki amplifikasi sinyal tambahan yang
dapat diperoleh saat menggunakan antibodi sekunder. Berikut diagram alir proses uji
Direct ELISA.

L. Indirect ELISA
Dalam Indirect ELISA, antibodi primer yang tidak berlabel digunakan bersama
dengan antibodi sekunder berlabel. Penggunaan antibodi sekunder berlabel
memberikan penguatan sinyal, sehingga meningkatkan sensitivitas pengujian secara
keseluruhan. Kompetitif indirect ELISA sangat spesifik, meskipun kehilangan
beberapa sensitivitas yang umumnya dikaitkan dengan ELISA. Ini melibatkan
antibodi spesifik dalam serum (antibodi uji) yang bersaing dengan antibodi spesifik
lain (antibodi pesaing) untuk sejumlah situs antigenik yang terbatas. Antibodi pesaing
berasal dari spesies hewan yang berbeda dengan hewan uji sehingga enzim yang
diberi label antibodi sekunder hanya akan mengenali dan mengikat antibodi pesaing.
Biasanya, antibodi yang bersaing bersifat monoklonal atau poliklonal. Berikut
diagram alir proses uji Indirect ELISA.
 KESIMPULAN

Selama beberapa tahun terakhir, telah terjadi peningkatan permintaan untuk tes
dengan tingkat sensitivitas, relatif sederhana yang mendeteksi alergen makanan untuk
digunakan dalam penelitian dasar dan diagnosis klinis. Disimpulkan bahwa format uji
ELISA kompetitif tidak langsung paling memenuhi semua kriteria yang diinginkan dalam
banyak situasi. Meskipun ELISA memenuhi persyaratan, namun optimalisasi metode
diperlukan sebelum melakukan pengujian sampel. Dalam format ELISA ada beberapa
parameter yang umum dan penting untuk kinerja pengujian dan harus dipertimbangkan
selama proses optimasi, termasuk konsentrasi antibodi, konsentrasi antigen, waktu
inkubasi pemblokiran, substrat larutan dan larutan pencuci. Setelah metode dioptimalkan,
metode ini akan memberikan hasil yang dapat diandalkan. Meskipun immunoassay
menawarkan metode yang spesifik, sensitif dan cepat untuk mendeteksi dan mengukur
jumlah alergen dalam bahan makanan, proses tertentu dapat mendenaturasi, mengubah
atau menghancurkan protein sehingga tidak dapat dideteksi lagi dengan pengujian
menggunakan antibodi. Saat menggunakan antibodi monoklonal, ada besar kesempatan
untuk memperoleh salah negatif dalam itu deteksi. Poliklonal antibodi adalah
direkomendasikan untuk ELISA teknik sebagai sebagai risiko dari memperoleh negatif
palsu berkurang dibandingkan dengan antibodi monoklonal, yang cukup spesifik.
Alternatif untuk ELISA, yang paling menjanjikan metode untuk alergen deteksi adalah
PCR. Metode PCR sangat spesifik dan sensitive untuk mendeteksi alergi komponen
dalam makanan. Meskipun, PCR adalah metode yang sangat menjanjikan untuk
mendeteksi alergen dalam makanan pada tingkatan yang sangat rendah, tetapi kekurangan
yang utama adalah denaturasi DNA selama pemrosesan dan biaya yang mahal.
 DAFTAR PUSTAKA

Iqbal, A., Shah, F., Jamal, Y., Hamayun, M., Islam, B., Khan, Z. H., Hussain, A., Rehman,
G., Ziaullah, & Shah, S. (2018). Detection of Food Allergens By Elisa and Other
Common Methods. Fresenius Environmental Bulletin, 27(12), 8340–8346
https://search.ebscohost.com/login.aspx?direct=true&db=8gh&AN=13380090
3&site=ehost-live