Diagnosis Molekuler & Terapi Gen

Purnomo Soeharso
Departeme Biologi Medik FKUI
Diagnosis Molekuler :
Menggunakan teknik biologi molekuler untuk
mendapatkan informasi tentang etiologi penyakit,
mengidentifikasi kerentanan individu untuk
mendapat penyakit tertentu dan menentukan
diagnosis/ prognosis penyakit berdasarkan analisis DNA
atau hasil ekspresinya.
Prinsip Kerja :

- mendeteksi kelainan/penyimpangan atau status patologi

individu (pasien).

- menggunakan sampel DNA atau hasil ekspresinya (RNA &

protein) untuk mendapatkan informasi dan menegakkan
diagnosis.

- menggunakan hasil uji/deteksi molekuler tersebut untuk

diagnosis, klasifikasi, prognosis dan memantau respon terapi
/perjalanan penyakit.
Keutamaan (pentingnya) diagnosis molekuler :

- informasi biologi molekuler (DNA dan hasil

ekspresinya) menjelaskan berbagai aspek medik
atau klinik penyakit, kelainan atau penyimpangan.

- penemuan-penemuan terbaru teknik biologi

molekuler memungkinkan pengertian/interpretasi
yang mendalam tentang penyakit dan kelainan pada
tingkat molekul.

- pengertian/interpretasi yang mendalam tentang

penyakit dan kelainan diimplementasikan untuk uji
diagnostik, terapi, pemulihan dan pencegahan
Tujuan :

- mendapatkan konsep esensial (penting) yang

bermanfaat untuk identifikasi marka (penanda)
molekuler penyakit.

- mengaplikasikan (menerapkan) uji molekuler untuk

memantau penyakit, menentukan strategi penanganan

/pengelolaan penyakit dan mengantisipasi akibat /hasil

penanganan suatu penyakit.
Sejarah perkembangan biologi molekuler &
implikasinya pada diagnosis molekuler

1865 Gregor Mendel, Law of Heredity

1866 Johann Miescher, Purification of DNA
1949 Sickle Cell Anemia Mutation
1953 Watson and Crick, Structure of DNA

1970 Recombinant DNA Technology

1977 DNA sequencing
1985 In Vitro Amplification of DNA (PCR)
2001 The Human Genome Project
6
Metodologi

Langkah-langkah yang diambil dalam diagnosis

molekuler :

1. isolasi /ekstraksi DNA genom atau RNA dari sel

2. identifikasi DNA atau hasil ekspresinya (RNA &
protein) : PCR, hibridisasi blot Southern, Northern,
Western
3. karakterisasi gen : sikuensing, RFLP, gene cloning,
dll.
4. analisa kualitatif : patologi, mutasi, polimorfisme, dll
analisa kuantitatif : konsentrasi DNA/RNA/protein
5. kesimpulan
Diagnosis penyakit :

infeksi :
- mendeteksi DNA/RNA bakteri, virus atau parasit
- mengidentifikasi genotip bakteri/virus/parasit
- mendeterminasi mutasi bakteri/virus/parasit
- menguji resistensi bakteri/virus/parasit terhadap
antibiotik

degeneratif
- mengidentifikasi gen kausatif
- mendeterminasi mutasi atau polimorfisme gen tsb
- menganalisa hambatan atau malfungsi gen tsb
 Keganasan
- mengidentifikasi marka (penanda) keganasan -
onkogen, virus, gen spesifik
- mendeterminasi perubahan mutasi, delesi,
translokasi gen marka keganasan
- menguji suseptibilitas individu terhadap keganasan
- genetika dan silsilah keluarga
Kelainan atau penyimpangan :

genetika
- mengidentifikasi gen kausatif atau marka
- mendeterminasi perubahan gen kausatif
- mendeterminasi genotip individu ybs
- menganalisa pedigree (silsilah keluarga) ybs

malformasi kongenital
- mengidentifikasi gen kausatif atau marka
- mendeterminasi perubahan gen kausatif
Contoh :

Diagnosis penyakit infeksi hepatitis B

Hepatitis B disebabkan oleh infeksi virus hepatitis B

(VHB), menyebabkan infeksi akut dan/atau khronik.

Infeksi akut ditandai dengan viremia dan kerusakan hati,

sedangkan infeksi khronik ditandai viremia menetap
dengan titer bervariasi, asimptomatik dan kambuh pada
waktu2 tertentu.

Diagnosis ditegakkan dengan mendeteksi DNA VHB dalam

serum dengan PCR secara kualitatif dan kuantitatif,
identifikasi genotip virus secara serologi atau PCR.
Diagnosis penyakit keganasan (kanker) karsinoma
nasofaring (KNF)

Karsinoma nasofaring (KNF) adalah keganasan yang

konsisten dengan infeksi virus Epstein Barr (EBV).
Pada epitel nasofaring replikasi EBV ditandai dengan
ekspresi gen litik virus immediate early BRLF1 dan
BZLF1. Kedua gen ini berfungsi menginduksi fase litik
tahap early dan late. Expresi gen litik (BRLF1 dan
BZLF1) secara spesifik ditemukan pada jaringan tumor
primer penderita KNF. Deteksi mRNA gen litik EBV
padajaringan tumor KNF mencerminkan patogenesis
KNF. Pengukuran mRNA gen litik EBV secara
kuantitatif dari biopsi tumor dapat memberi informasi
tentang progresifitas KNF.
Hasil RT-PCR LMP1 & BRLF1

1 2 3 4 5 6 7 8 9

142 bp

(a) Ekspresi mRNA LMP1 (positivitas 91,3 %)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

157 bp

(b) Ekspresi mRNA BRLF1 (positivitas 65,2 %)

Positivitas ekspresi mRNA LMP1 & BRLF1 > 65 % (Niedobitek, 2000)

Diagnosis penyakit degeneratif infertilitas pria

Salah satu penyebab infertilitas pria adalah inefektifitas

hormon gonadotropin FSH dan testosteron pada sel target
yaitu sel sertoli dan sel-sel germinal dalam tubulus
seminiferus.

Inefektifitas dapat disebabkan karena ketidak sempurnaan

reseptor hormon tersebut pada sel target karena mutasi
atau variasi alotip yang menyebabkan afinitas hormon
terhadap reseptornya menurun.

Diagnosis ditegakkan dengan identifikasi reseptor FSH dan

androgen dengan PCR dilanjutkan dengan deteksi mutasi
dengan sikuensing DNA dan determinasi genotip/alotip gen
reseptor FSH dan androgen dengan RFLP.
 Hasil Penelitian

Gambar 1. Hasil PCR gen reseptor FSH yang

meliputi kodon 307 dan 680 exon 10.
(E = endometriosis; N = normal)
Gambar 2a. Hasil SSCP gen reseptor FSH yang meliputi
kodon 307 exon 10.
Keterangan : 1 = AT, 2 = TT, 3 = AT, 4 = AA, 5 = TT, 6 = AT,
7 = AT, 8 = TT, 9 = TT , 10 = TT
( A = alanin; T = threonin )
Gambar 2b. Hasil SSCP gen reseptor FSH yang meliputi kodon
680 exon 10.
Keterangan : 1 = NS, 2 = SS, 3 = NN, 4 = NS
( N = asparagin; S = serin )
PCR-SSCP pengulangan CAG gen reseptor androgen

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Hasil SSCP untuk mendeterminasi jumlah pengulangan CAG pada gen

reseptor androgen dengan jangkauan antara 19 ulangan (no. 15) dan 31
ulangan (no. 20)
Diagnosis penyakit genetika anemia sel sabit (sickle
cell anaemia)

Anemia sel sabit adalah penyakit genetika disebabkan

karena mutasi titik sehingga asam amino ke 6 dari
hemoglobin berubah dari glutamat menjadi valin
(GAG GTG). Mutasi mengubah gen menjadi alel
yang kodominan.

Diagnosis ditegakkan dengan identifikasi gen

hemoglobin dengan PCR dan deteksi mutasi kodon 6
dengan sikuensing DNA. Distribusi alotip dalam
keluarga dideterminasi dengan analisa pedigree.
Kelebihan diagnosis molekuler :
- lebih efisien dalam metodologi, waktu dan sampling
- lebih cepat dan akurat
- memerlukan sampel dengan jumlah atau ukuran kecil
- dapat disimpan dan diulang kembali dalam rentang
waktu lama

Kelemahan/kekurangan :
- memerlukan metodologi dan sarana yang kompleks &
mutakhir.
- biaya operasional mahal
- hanya dapat dilakukan dilaboratorium yang komplit
Terapi gen :

Menginsersikan gen normal (sehat) ke sel/jaringan

individu yang menderita penyakit genetika resesif agar
gen yang diinsersikan dapat mengganti/ mengkompensasi
atau mengkoreksi fungsi gen yang tidak atau kurang
berfungsi.

Terapi gen sel somatik (somatic cell gene therapy) lebih

diprioritaskan daripada germline cell therapy gen asing
yang diinsersikan tidak diturunkan ke generasi
berikutnya tidak berlawanan dengan etik.
Metodologi

Menginsersikan gen/DNA ke galur sel (cell line) tertentu

- Microinjection dengan microneedle glass menggunakan

micro manipulator dilakukan pada in vitro

fertilization (ICSI).

- Penggunaan karier loposom (lipofection):

DNAdicampur dengan fosfolipid yang dapat membentuk

kapsul lipid bilayer sintetik (liposom) liposom yang

membawa DNA ditambahkan ke kultur sel terjadi
fusi liposom membran sel & DNA masuk ke dalam sel,
beberapa mencapai nukleus, berintegrasi dengan DNA
Transfeksi gen dengan virus

DNA manusia (asing) di klon pada DNA SV40 yang

membawa promoter & ditransfeksikan ke COS cell
line (cell line ginjal kera).

Sel COS yang terinfeksi mati & membentuk virion

baru yang membawa DNA rekombinan sebagai
DNA genomnya.

Virion diinfeksikan ke kultur sel baru beberapa

sel inang mengadopsi DNA & terintegrasi ke DNA
genom & diexpresikan.
 Contoh terapi gen pada leukemia limfositik /
mielositik :

Transfesikan gen normal ke stem cell penderita

leukemia yang diambil dari bone marrow.
Bersihkan bone marrow & tanamkan stem cell
yang membawa gen normal rekombinan
sel normal tumbuh menggantikan sel
leukemia.
 Terima Kasih
atas
Perhatian Anda