UJI

TETRAZOLIUM
 Pengertian Uji Tetrazolium
Pada uji daya hidup secara langsung diperlukan kondisi :
kelembaban, temperatur dan aerasi yang sesuai, serta
dalam beberapa hal cahaya, sehingga menguntungkan
bagi proses perkecambahan. Penting juga untuk
menentukan apakah kecambah yang dihasilkan normal
atau tidak.
Kepastian apakah suatu kecambah itu normal atau tidak
tergantung pada pengamatan yang teliti terhadap sistem
akar dan tunas. Walaupun semua kondisi diatur
sedemikian rupa, umumnya pelaksanaan uji
perkecambahan berlangsung selama beberapa hari atau
minggu. Bahkan untuk beberapa jenis benih rumput-
rumputan dan pohon- pohonan dapat memakan waktu
yang lebih lama lagi. Sehingga kesimpulan dari suatu uji
perkecambahan secara langsung tidak dapat segera
diketahui.
Beberapa kelebihan dan kekurangan
dari uji tetrazolium:

Jika diperlukan keterangan segera tentang viabilitas

dan suatu kelompok benih tertentu, maka uji
tetrazelium akan dapat memberikan keterangan lebih
cepat 1 - 2 hari daripada uji perkecambahan secara
langsung. Tetapi untuk pelaksanaan uji tetrazolium
diperlukan waktu Yang lebih lama daripada uji
perkecambahan secara langsung.

Untuk benih-benih yang sangat dorman dan lambat

berkecambah lebih menguntungkan bila digunakan
uji tetrazolium.
 Kadangkala suatu kelompok benih gagal berkecambah
atau mungkin berkecambah lebih lambat dari biasanya
disebabkan oleh tipe dormansi "after ripening". Untuk
menentukan viabilitas benih tersebut secara cepat dapat
dilaksanakan uji tetrazolium. Hal ini akan memungkinkan
seorang analis mengadakan pengujian kembali untuk
perkecambahan dengan menggunakan metode
pemecahan dormansi terlebih dahulu. Tetapi jika uji
tetrazolium digunakan langsung pada benih dorman,
maka akan diperoleh hasil lengkap tentang viabilitas
benih tersebut tanpa mengetahui adanya pengaruh
dormansi.

Efek phytotoxic dari fungisida, insektisida atau fumigasi

dengan methyl bromide yang telah diperlakakan pada
benih tidak dapat diketahui dengan uji tetrazolium.
 Uji tetrazolium tidak selalu dapat memberi keterangan
tentang kerusakan pada benih yang diakibatkan oleh
proses pengeringan.

Uji tetrazolium memerlukan lebih banyak kecakapan dan

keputusan daripada yang biasa diperlukan dalam uji
perkecambahan secara langsung. Seringkali diperlukan
beberapa kali pembesaran untuk dapat mempelajari
dengan seksama pola noda dan lokasi daerah nekrotik
yang tidak ternoda.
 Pelaksanaan Uji Tetrazolium
Pada dasarnya uji tetrazolium dilaksanakan
dalam tiga tahap :

Tahap 1.
Pengaktifan enzim dan/atau reaksi dehidrogenasi dengan
penyerapan air.

Tahap 2.
Persiapan benih untuk membiarkan daerah embrionik
mudah dimasuki oleh larutan tetrazolium pada proses
imbibisi selanjutnya.

Tahap 3.
Evaluasi benih.
Tahap 1

Pada tahap 1 biasanya diperlukan waktu hampir 16 jam. Benih-

benih yang kecil dibiarkan mengambang di permukaan air,
sedangkan benih-benih yang lebih besar dibiarkan berimbibisi
di antara lembaran-lembaran kertas yang lembab. Benih perlu
dibiarkan sampai mencapai tahap di mana radikel muncul,
karena akan lebih sulit untuk menentukan kondisi dari radikel.
Jika benih- benih tertentu berkecambah lebih cepat pada
temperatur optimum, maka perlu meletakkan benih tersebut
pada temperatur yang lebih rendah selama 16 jam. Biasanya
benih diletakkan kontak dengan air sekitar pukul 4 sore hari
selama 16 jam dan dilanjutkan ke tahap 2 pada sekitar pukul 8
pagi hari selama 8 jam berikutnya.
Tahap 2

Ada berbagai metode di mana tahap 2 dapat

dilaksanakan, dengan maksud untuk membuka daerah
cmbrionik terhadap larutan tetrazolium. Pada benih-
benih Gramineae yang lebih besar benih dapat
dibelah dua memanjang melalui embrio atau secara
tepat dan teliti memisahkan embrio dan scutellum
bersama sebagian kecil dari endosperm dan
diletakkan dalam larutan tetrazolium.
Tahap 3

Tahap 3 merupakan bagian yang tersulit dari uji

tetrazolium. Diperlukan pengetahuan yang baik
tentang morfologi benih dan jaringan embrionik
untuk memungkinkan menentukan bagian bagian apa
saja yang penting dari embrio yang harus berwarna
untuk menunjukkan bahwa benih yang dianalisa
adalah viable. Dan jika dikecambahkan akan
menghasilkan suatu kecambah normal. Tipe noda,
kedalaman warna dan kondisi dari jaringan yang
ternoda dapat dipertimbangkan untuk menunjukkan
status viabilitas dari benih.
Penggunaan Uji Tetrazolium untuk Benih
Pohon-pohonan

Sesuai dengan peraturan ISTA maka untuk golongan

benih pohon-pohonan berikut ini dilakukan uji tetrazolium
untuk mengukur viabiiitasnya, karena uji daya kecambah
secara langsung menyebabkan kesulitan terlalu besar.

Species pohon-pohonan tersebut yaitu:

Car pinus spp. Prunus spp.
Crataegus spp. Pyrus spp.
Fraxinus spp. Rosa spp.
Juniperus spp. Taxus spp.
Malus spp. Tilia spp.
Pinus spp.
 Dalam uji ini dipakai larutan 1% (pH 6,5 - 7,0) dari
tetrazolium chloride atau bromide. Tiap uji dilakukan
dengan paling sedikit 4 x 100 benih (atau buah).

Benih-benih ditaruh dalam larutan dan harus berada

sedikit di bawah permukaan larutan. Temperatur waktu
pelaksanaan uji adalah 30C (kecuali disebutkan lain)
dan dalam keadaan gelap.

Sesudah perlakuan maka larutan tetrazolium dibuang

dan benih-benih dicuci dengan air. Untuk evaluasi benih-
benih ditaruh pada tempat datar dan harus tetap dalam
keadaan basah. Untuk penentuan selisih antar ulangan
dapat dipakai pedoman toleransi seperti pada uji daya
kecambah secara langsung.
Petunjuk Khusus untuk Uji Tetrazolium

Malus dan Pyrus spp.

Prosedur:

Benih direndam dulu dalam air selama 18 - 20 jam.

Buang kulit yang keras dan selaputnya, temasuk endosperm
dengan menggunakan sebuah jarum panjang
Rendam dalam larutan tetrazolium selama 18 - 20 jam.
Evaluasi: benih-benih yang berikut ini dianggap sebagai viable.
Embrio yang berwarna penuh.
Embrio dengan pucuk akar yang tidak berwarna
Embrio dengan noda-noda yang tidak berwarna di atas keping biji yang
berseberangan dengan akar. Asalkan menunjukkan nekrose hanya di
permukaan dan tidak lebih dari separuh keping biji. Untuk nekrose yang
lebih dalam, tidak boleh melebihi 1/3 dari keping biji.
Benih-benih Tanaman Pertanian
Padi, sorghum dan jagung

Prosedur:
Benih disimpan di tempat yang lembab selama 24 jam,
kemudian embrionya dibelah menjadi dua bagian yang sama
besar. Tetapi dilakukan sedemikian rupa sehingga benih tidak
terbelah menjadi dua bagian yang terpisah.

Untuk benih padi, benih dipotong menjadi dua bagian sedikit di

atas embrio dan bagian yang berembrio ini digunakan untuk
pengujian.

Benih yang sudah dibelah embrionya, dimasukkan ke dalam

larutan tetrazolium (TZ) dan disimpan di tempat gelap selama 1
x 24 jam pada temperatur kamar atau 1/2-1 jam pada
temperatur 40C.
Kedele

Prosedur:
Benih kedele disimpan di tempat yang lerribab
selama 1 x 24 jam dan sebaiknya pada
temperatur rendah dalam refrigerator.

Setelah itu dimasukkan ke dalam larutan

tetrazolium 1% dan disimpan di tempat yang
gelap seiama 1 x 24 jam pada temperatur
kamar atau 1 - 2 jam pada temperatur 40 C.
Kacang Tanah
Prosedur:

Benih kacang tanah disimpan di tempat lembab

selama 1 x 24 jam, kemudian kulitnya dikupas
dengan hati-hati dibelah dua dengan cara
membuka kotiledonnya.

Bagian kotiledon yang membawa bakal akar dan

daun dimasukkan ke dalarn larutan tetrazolium 1%,
lalu disimpan di tempat gelap selama 1 x 24 jam
pada temperatur kamar atau selama 2 jam pada
temperatur 40 C.
Kapas
Prosedur:

Benih kapas yang telah dibasahi disimpan di

tempat lembab selama 1 x 24 jam.

Kulitnya dikupas demikian juga kulit ari yang

meliputi kotiledonnya. Kulit bagian dalam ini akan
lebih mudah dibuang dengan tidak merusak
kotiledon bila setelah dikupas kulit luarnya,
kotiledon yang berkulit ari tersebut direndam
dalarn air selama 10 - 15 menit.

Kotiledon yang telah bersih dari kulit tersebut lalu

dimasukkan dalam larutan tetrazoliun 1% dan
disimpan di tempat gelap selama 1 x 24 jarn pada
temperatur kamar atau selama 2 jam pada
temperatur 40 C.
Kenaf
Prosedur:

Benih kenaf disimpan di tempat lembab

selama 1 x 24 jam.

Kemudian dengan menggunakan pisau yang

tajam kulit biji diiris sepanjang sisi punggung
benih tanpa melukai kotiledon.

Benih yang telah diiris kulitnya dimasukkan

dalam larutan tetrazolium 1% dan disimpan di
tempat gelap selama 1 x 24 jam pada
temperatur kamar atau 2 jam pada
temperatur 40C.
Setelah perlakuan tersebut di atas, benih diambil
dan dicuci 2-3 kali dengan air suling.
Pengamatan sebaiknya dilakukan dalam keadaan
lembab. Yang diamati adalah bagian terpenting
dari lembaga seperti scutelum, bakal akar, axis,
bakal daun dan kotiledon.
Khusus untuk kedele dan kenaf sebelum diamati
masih harus dikupas kulitnya kemudian dicuci.
Dengan menggunakan standard yang ada dapat
dinilai apakah benih dapat berkecambah atau
tidak, sesuai dengan pola pewarnaan dari embrio
serta kotiledon.
 Penilaian Daya Hidup (Viabilitas)
dengan Uji Tetrazolium

Malus dan Pyrus spp

Gambar : Pewarnaan tetrazolium pada benih Malus dan Pyrus spp.

 Jagung, sorghum, gandum, bluegrass dan kedele.

Gambar :
Bagian yang berwama gelap menunjukkan sel-sel hidup pada embrio :
a) jagung, b) sorgum, c) gandum - setelah dari bagian permukaan atas embrio
dipotong, d) bluergrass, e) kedele - bagian permukaan tidak dipotong .
 Gandum, rye, barley dan oats

Gambar :
a) Gandum, b) Rye, c) Barley, d) Oats. Bagian yang bergarisgaris gelap
menunjukkan daerah embrio yang paling sedikit harus memperlihatkan
pewarnaan setelah perlakuan tetrazolium, agar dapat berkecambah
 Gambar : Irisan longitudinal dari biji jagung.

Sc = scutellum Pr = serat procambial, c = coleoptil, PI = piumule, B = dasar

plumule, A= transisi dari plumule ke radikai, R = radikel, SW = permulaan
radikel, Bagian yang bergaris-garis menunjukkan daerah embrio yang harus
memperlihatkan pewarnaan setelah perlakuan dengan tetrazolium agar
dapat dinyatakan viabiel