PENGERTIAN
Rekayasa genetika
DNA rekombinan adalah bentuk
DNA buatan yang dibuat dengan
menggabungkan dua atau lebih
sekuens yang tidak akan
biasanya terjadi bersama-sama.
Dalam hal modifikasi genetik, itu
adalah diciptakan melalui
pengenalan DNA yang relevan
ke dalam DNA organisme yang
ada, seperti plasmid bakteri,
untuk kode untuk atau
mengubah sifat berbeda untuk
tujuan tertentu, seperti resistensi
antibiotik.
dilakukannya untuk
manipulasi gen-gen tertentu
sehingga ekspresi gen
dapat dikontrol dan
produknya dapat
dimanfaatkan untuk tujuan
tertentu, salah satunya
untuk pengobatan penyakit
dengan terapi gen. Terapi
ini melibatkan transfer asam
nukleat berupa DNA ke sel
embrionik maupun somatik
pasien sehingga gen
tersebut memiliki efek
pengobatan terhadap
penyakit pasien.
 Endostatin adalah blocker vaskularisasi
yang paling efektif untuk mencegah
neovaskularisasi dan metastasis tumor,
yang akhirnya mengarah pada apoptosis
atau nekrosis sel kanker.
Endostatin termasuk ke dalam Terapi gen
mempunyai bobot molekul 20-kDa C. dan
merupakan tipe dari kolagen XVIII. Dan
biasanya dikenal dengan Angiostatin dan
thrombospondin.
 TUMOR?!

Neoplasma (Tumor) ialah pertumbuhan jaringan baru

yang bersifat abnormal dan patogen pada tubuh, tidak
berkoordinasi dengan jaringan sekitarnya dan tidak
berguna bagi tubuh. Imunologi Tumor, Peran penting
imunitas lainnya adalah untuk menemukan dan
menghancurkan tumor. Beberapa tumor menghindari
sistem imun dan terus berkembang sampai menjadi
kanker. Kombinasi hipoksia pada tumor dan sitokin
diproduksi oleh makrofag menyebabkan sel tumor
mengurangi produksi protein yang menghalangi
metastasis dan selanjutnya membantu penyebaran sel
kanker.
 Bagaimana perubahan pada
gen bisa memicu
berkembangnya kanker?

Adakalanya mutasi pada gen-gen yang

penting di dalam sebuah sel bisa
menyebabkan sel itu mulai berkembang
biak di luar kendali. Sel itu juga tidak lagi
sanggup memperbaiki diri secara benar,
dan tidak mati di saat yang seharusnya—
dan pada akhirnya menjadi penyebab
kanker adalah mutasi DNA.
 Penghambatan angiogenesis telah menjadi perhatian khusus untuk
pengobatan tumor padat. Endostatin, fragmen aC-terminal kolagen
XVIII, telah dilaporkan menunjukkan efek penghambatan potensial
pada proliferasi sel endotel, migrasi dan pembentukan tabung. Dalam
penelitian ini, perpustakaan cDNA endostatin disintesis dari hati tikus
dan dimasukkan ke dalam situs pemotongan enzim SacI dan SalI dari
vektor kloning pUC18. Vektor rekombinan dipindahkan ke Escherichia
coli DH5a dan kloning rekombinan dipilih pada piring agar LB ditambah
ampisilin. Analisis PCR dan sekuensing DNA membuktikan adanya
endostaten utuh pada pUC18. Gen endostatin subcloned menjadi
vektor ekspresi pET32a dan sel bakteri yang kompeten dari E. coli BL21
ditransformasikan oleh vektor yang menyimpan gen endostatin. Dalam
kondisi optimum, plasmid ekspresi diinduksi dengan IPTG dan endostatin
larut rekombinan sebagai fusi dengan tioredoksin dimurnikan dengan
resin Ni-NTA (Ni2? nitrilotriacetate).
1. Ekstraksi RNA
2. Kloning endostatin tikus
3. Persiapan sel yang kompeten
4. Transformasi plasmid
5. Pemilihan klon rekombinan yang sesuai
6. Pertumbuhan bakteri dan ekspresi
rekombinan endostatin dalam labu kocok
7. Stabilitas plasmid
8. Pemurnian endostatin rekombinan
9. SDS-PAGE
10. Total protein assay
11. Uji pembentukan tabung kapiler in vitro
HUVEC di kolagen matriks
Urutan gen endostatin (aksesi GenBank no.
AF257775) digunakan sebagai contoh
untuk desain primer. Seperti yang
disebutkan di atas, fragmen 554 bp yang
sesuai dengan gen endostatin diperkuat
dengan metode RT-PCR (Gambar 1).
Analisis PCR mengkonfirmasi adanya gen
endostatin di pUC18. Apalagi, hasil sekuensing
DNA memverifikasi gen tersebut dibandingkan
dengan urutan GenBank. Plasmid pUC18 yang
dipindahkan ke sel kompeten E. coli DH5a dalam
kultur LB (ditambah ampisilin) dimurnikan dari klon
ini dan diobati dengan RNaseI (data tidak
ditunjukkan). Gen diperkuat dan diekstrak plasmid
Puc18 dicerna oleh SacI dan SalI (Gambar 2).
Klon rekombinan itu dipilih dengan metode skrining merah
putih. Oleh karena itu, gen endostatin disubkripsikan dalam
pET32a yang merupakan vektor ekspresi Integritas pET32
rekombinan diperiksa dengan menggunakan analisis PCR. Di
antara sepuluh koloni tunggal yang tumbuh setelah
subcloning dari endostatin rekombinan pada pET32a, yang
sesuai koloni rekombinan dipilih berdasarkan tiga kriteria:
tingkat ekspresi, laju pertumbuhan dan stabilitas plasmid.Di
seluruh klon, fase log dimulai Setelah 4 jam inkubasi dan
pertumbuhan selesai setelah 8 jam saat kepadatan optik
dan berat kering sel (CDW) masing – masing adalah 4,2 dan
2,1 g / l, (Gambar 3).
Gambar 4 menunjukkan stabilitas plasmid pada
kloning terbaik selama 9 hari subkultur dengan
setelah 6 hari stabilitas plasmid 90% dan 80%
setelah 7 hari melakukan subkultur. Untuk
rekombinan ekspresi endostatin, budaya tumbuh
untuk 5 jam pasca induksi, dan protein total
dianalisis dengan SDS-PAGE dalam gel
pemecahan 12,5%. Rekombinan endostatin
diinduksi oleh penambahan IPTG di bawah kendali
Promotor T7, dan ampisilin adalah penanda
terpilih.
Gambar 5 menunjukkan analisis SDS-PAGE
total protein kloning terbaik pada 5 jam
setelah induksi dengan IPTG pada pET32
dan rekombinan peptid dalam kultur labu
kocok. Endostatin tikus rekombinan sebagai
protein fusi thioredoxin (* 35 kDa) terdeteksi
pada protein yang diekstrak dan
mengandung lebih dari 50% protein total
Untuk mengevaluasi kemungkinan efek rekombinan endostatin
sebagai inhibitor angiogenesis, konsentrasi yang berbeda
dari protein fusi ditambahkan ke HUVECs yang
dibudidayakan di matriks kolagen Hasilnya menunjukkan
bahwa protein fusi rekombinan secara sempurna
menghambat pembentukan tabung kapiler oleh HUVEC
dalam matriks kolagen pada 200 ng / ml (Gambar6)
 Endostatin dapat mengahambat tumor dengan
dilakukannya cara rekayasa genetika menggunakan
bakteri E. coli.

 Endostatin rekombinan sebagai protein fusi dengan

thioredoxin dalam sistem ekspresi pET32a. Hasil dari
Penelitian ini, yang diturunkan pada skala
laboratorium, memberikan perbaikan mengatur
kondisi dan bisa berguna dan berlaku untuk
investigasi lebih lanjut termasuk ungkapan lebih dari
endostatin sebagai protein rekombinan anti
angiogenik. Juga, Penelitian ini dapat memberikan
kondisi optimal untuk kloning dan ekspresi protein
rekombinan lainnya.
TERIMA KASIH