MUHAMMAD TAUFIQ (1410411028)

LUSY YUSELVI ANNISA (1510411010)

FAUZIAH SULAEMAN (1510411037)
JASNA YANI (1510411040)
MARRISA HERIS TOFA (1510412009)
ATIQAZIKRA (1510412018)

Dosen pembimbing : PROF.Dr.SAFNI,M.Eng.

chroma berasal dari graphein
kata menuliskan
warna

Kromatografi adalah

Suatu teknik pemisahan molekul

berdasarkan perbedaan pola pergerakan
antara fase gerak dan fase diam untuk
memisahkan komponen (berupa molekul)
yang berada pada larutan
 Penemuan Kromatografi

Tahun
1903

Tsweet

mencoba memisahkan
pigmen – pigmen dari
daun dengan
menggunakan suatu
kolom yang berisi kapur
 Starkensen berhasil
menjerat α-amilasi
Tahun 1910 dengan pati yang tidak
larut

Kromatografi afinitas
mulai dikembangkan Tahun 1968
oleh Cuatrecases
Kromatografi afinitas
adalah metode pemisahan
campuran biokimia
berdasarkan interaksi
spesifiknya, misalnya
antara antigen dan
antibodi, enzim dan
substrat, atau reseptor dan
ligan .
 Pemurnian dengan teknik kromatografi
afinitas disebut pemurnian satu tahap (one
step purification). Dalam proses pemurnian
satu tahap menggunakan kromatografi
afinitas diperlukan interaksi spesifik antara
protein rekombinan dengan suatu ligan
 Prinsip kromatografi afinitas adalah
pengikatan spesifik ligan dan reseptornya.
Jadi dalam kromatografi afinitas minimum
harus ada 2 senyawa yang berikatan
spesifik.
 Kromatografi afinitas paling banyak
digunakan untuk pemurnian protein
rekombinan.
 Di
siapkan kolom afinitas dengan matriks dan ligan
yang sesuai
 SampelProtein dimasukkan ke kolom dan protein
akan melalui saringan matriks afinitas manik-manik.
 Proteinberinteraksi dengan afinitas ligan dengan
beberapa protein yang mengikat dengan erat,
longgar dan tak berikatan
 proteinyang tidak mengikat akan tercuci oleh
buffer aplikasi.
 protein yang mengikat di cuci dengan buffer elusi
 protein
elusi yang mengikat erat ligan dan
mengumpulkan protein murni penting
 Memurnikan dan
memekatkan
larutan enzim

Memurnikan dan Mengamati

memekatkan suatu senyawa biologi
Kegunaan
bahan dari yang terikat pada
campurannya Kromatogra
suatu bahan
kedalam larutan fi Afinitas
penyangga

Mengurangi
jumlah bahan
dalam suatu
campuran
Faktor-faktor yang Mempengaruhi Efisiensi Kolom

1. Difusi Eddy (olakan):

Disebabkan oleh kecepatan gas pembawa
yang tidak sama didalam kolom karena
bagian dari pori yang dilalui tidak sama
panjang :Multipath effect (pengaruh jalan
berganda) A

2. Difusi Molekuler:
terutama dalam fase gas, dimana molekul
cuplikan dapat bergerak dalam arah yang
salah yang disebabkan oleh difusi eddy

15
3. Kesetimbangan yang lambat
beberapa molekul tetap tinggal lama, sedangkan
lainnya hanya sebentar dalam fase diam. Hal ini
disebabkan oleh perbedaan suhu yang kecil (GLC)

4. Harga K yang tidak tetap

Disebabkan oleh perbedaan ratio distribusi dalam
kolom.

Keempat faktor tsb menyebabkan perbedaan

puncak.Faktor 1, 2 dan 3 menyebabkan pelebaran
puncak yg simetris.Faktor 4 menyebabkan pelebaran
puncak yg tak simetris.Keadaan yg lebih buruk akan
terjadi puncak puncak yg overlap.

16
 Pelebaran pita dan efisiensi kolom
Pemisahan puncak puncak itu berhubungan dengan 2
faktor:
1. Efisiensi kolom: pelebaran puncak merupakan hasil
dari bentuk kolom dan kondisi operasional.
2. Efisiensi Pelarut (Faktor selektifitas): Hasil dari
interaksi antara komponen dengan fase diam, hal ini
menentukan kedudukan relatif dari jalur jalur
komponen pada sebuah kromatogram.

17
1. Efisiensi Kolom
Diukur sebagai jumlah pelat teoritis N, Height
equivalent of a theoritical plate (HETP) = ketinggian
ekivalen terhadap pelat teoritis.
HETP = H = L / N
N = jumlah pelat teoritis dari suatu kolom
L = panjang kolom
Efisiensi kolom tergantung pada:
 Pelarut = fase diam
 Zat terlarut = komponen
 Suhu
 Kecepatan aliran dari gas pembawa
 Ukuran dari komponen

18
 Banyak faktor yg mempengaruhi N atau HETP,
tetapi secara kuantitatif teori yg menyatakan
pengaruh tsb sangat sukar.

 Akan tetapi ada 2 teori yang dapat

mempengaruhi N atau HETP yaitu:
1. Teori pelat
2. Teori laju / kecepatan

19
 TEORI PELAT – N
 Konsep tentang pelat adalah imajisi, karena suatu
kolom tidak memiliki pelat pelat. Tetapi merupakan
gambaran dari partikel partikel yang tertarik/ terikat
fase cair.
 Dasar teori pelat adalah Distribusi
 Kesetimbangan dari pemisahan komponen terjadi
diantara fase diam dan fase gerak yang terjadi didalam
pelat.
 Komponen bergerak kebawah kolom oleh transfer pada
fase gerak yg disetimbangkan dari satu pelat ke pelat
yang berikutnya.

20
 Substitusi hub tsb dengan pers diatas
W  Atau WL

 
4 L
tR 4t R

 Substitusi L dengan harga H = σ2 /L didapat:

L2 W 2 LW 2
H H
16 t R2 L 2
16t R
 Untuk mendapatkan N , subs ke N = L / H didapat
L LW 2
 2

N 16t R2 atau N  16 t R 

 w
N dapat dihitung dari 2 waktu pengukuran tR dan w

21
 Pengaruh kecepatan alir fase gerak:
pelebaran pita tergantung pada lamanya waktu
fase gerak yang kontak dengan fase diam.

Gambar tsb menunjukkan efisiensi kolom tgt

pada kec alir fase gerak.

22
 Dari gb tsb keduanya menunjukkan tinggi pelat
minimum / efisiensi max, terjadi pada kec alir yg
rendah.
Kolom pada GC panjangnya dapat mencapai 50 m atau
lebih, sedangkan kolom pada cair dapat lebih panjang
dari 25 – 50 cm, sebab tetesan sepanjang kolom
tekanannya cukup tinggi.
Jumlah pelat N pada GC lebih banyak dari pada LC
 Pengaruh ukuran diameter partikel : efisiensi kolom
bertambah dengan berkurangnya ukuran partikel
packing kolom, yaitu berupa lapisan yg tipis ( fase diam
cairan yg diadsorb pada padatan) dan viskositas fase
gerak yg rendah.
 Pengaruh temperatur : kenaikan temperatur juga
mengurangi pelebaran pita.

23
24
 Teori laju / kecepatan.
 Dikembangkan oleh van Deemter
 Teori pelat diasumsikan bahwa kolom secara matematik
ekivalen dengan pelat kolom.
 Kesetimbangan zat solut terjadi antara fase gerak dan
fase diam untuk setiap pelat dan dapat memprediksi
beberapa aspek dari bentuk kromatografi
 Teori pelat mengabaikan konsep difusi solut dan jejak
aliran.
 Teori laju dapat memprediksi pengaruh pada beberapa
faktor dari bentuk kolom seperti: sifat fase, difusivitas
solut, koef partisi, kec. Fase, ketebalan fase, ukuran
dan porositas padatan pendukung, dan kec. Alir.

25
 Persamaan deferensial partial dari van Deemter untuk
isoterm linier dihasilkan dalam fungsi konsentrasi
effluent.

26
27
28
 Faktor Selektivitas
 Faktor selektivitas merupakan relative komponen
diantara fasa diam dan fasa gerak. Faktor
selektivitas antara dua komponen antara A dan B
dapat dinyatakan dengan rumus
 KB = koefisien partisi komponen B yang sukar
terelusi
 KA = koefisien partisi komponen A yang mudah
terelusi
 Resolusi (R)
adalah pemisahan nyata antara dua puncak yang
berdekatan.
RS = 2 d/ (wa + wB )
= 2 [(tR)A – (tR)A] / (wA + wB)

Pemisahan yg baik harus mempunyai RS ≥ 1,5, karena

hanya 0,3% daerah yg overlap atau pemisahanya
mencapai 99,7%.
Sedangkan jika RS = 0,75 pemisahannya jelek.
RS = 1, berarti daerah A akan mengandung 4% B dan
daerah B akan mengandung 4% A.

30
31
 Pengaruh faktor kapasitas dan selektifitas pada resolusi dari gambar
diatas untuk solut A dan solut B, maka resolusinya:
2
   1 k 
2 '
N  16 R  2
  ' 
N    1  k B' 
B

  1 
S
RS      kB 
4    1  k B' 
 Dimana k’B adalah faktor kapasitas dari spesies yg bergerak lebih lambat,
α adalah faktor selektifitas.

 Persamaan tsb dapat diatur dengan menghitung jumlah pelat yg

diperlukan untuk pemisahan yg baik.

2
   1 k 
2 '
N  16 R  2
  ' B

  1
S
 kB 
32
 Pengaruh resolusi pada waktu retensi
Kromatografi berhasil dengan baik jika memungkinkan
resolusinya paling tinggi dan waktu retensinya singkat.
Pengaruh resolusi pada waktu retensi adalah:

t R B 
16 R H    1  k
2
S
 
2
 ' 3
B 
    1  k B'  
2

Dimana µ =kecepatan linier dari fase gerak

33
I. Judul : Sistem Kromatografi Afintas Secara
Paralel Untuk Pemurnian Dari Sampel
Protein Rekombinan
II. Tujuan : untuk memurnikan dan
menentukan kadar protein dengan cara
kromatografi afinitas dan
spektrofotometri.
III. Metode : kromatografi afinitas dan
spektrofotometri.
METODE PENELITIAN
 Prosedur pemurnian : Selang
kecil dan
Sampel/protein penjepit
kolom reservoir
(resin)
 Pengujian
Biokimia dari protein yang telah
dimurnikan (penentuan kadar)

protein

SPEKTROFOTOMETRI

CBB
Hasil
Sebanyak 24 sampel yang protein yang
dimurnikan dengan metoda kromatografi
afinitas, namun yang dapat diuji untuk
penentuan kadar protein murninya hanya 18
sampel. Berdasarkan 18 sampel yang diuji
tersebut dengan menggunakan spektrofotometer
menghasilkan nilai serapan tertinggi pada
panjang gelombang 280 nm.
 Sherman, J., Bernard, F., 1996, Hand book of
Thin-Layer Chromatography, Second ed.,
Marcel Dekker INC, New York.
 Grob, R.L., 1995, Modern Practice of Gas
Chromatography, 3rd edition, John Wiley &
Sons INC, New York.
 Neue, U.D.,1997, HPLC Columns. Theory
Technology and Practice, John Wiley & Sons
INC, New York.
 Gritter, R.J., Bobbitt, J.M., Schwarting, A.
E., 1985, Introduction to Chromatography,
Holden-Day INC, Oakland, USA.