Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi
(KCKT)

1
 KCKT/HPLC
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
High Performance Liquid Chromatography

KCKT Adalah suatu teknik kromatografi

yang menggunakan fasa gerak cair.
Dapat untuk pemisahan sekaligus analisis

Berdasarkan kekuatan/kepolaran fasa geraknya

Fasa gerak
Fasa Normal kurang polar
dibanding
KCKT (Normal Phase)
fasa diam
Fasa gerak
Fasa terbalik lebih polar
dari fasa
(Reverse phase)
diam 2
 Prinsip

distribusi komponen
diantara fasa gerak dan fasa diam
migrasi diferensial komponen-komponen
analit dalam kolom kromatografi

Fs gerak + A + B A terpisah dari B

A B

Fasa diam dalam kolom

3
 A B
int
en
sit
as

Waktu retensi (tr), menit

Parameter yang digunakan:

• waktu retensi (tr)
• volume retensi (Vr)

Waktu retensi (tr):

Waktu yang diperlukan analit untuk
bergerak sepanjang kolom

Volume retensi :
Volume fasa gerak yang diperlukan
untuk membawa analit sepanjang
kolom 4
Elusi :
Proses bergeraknya analit
yang di bawa oleh fasa gerak
melalui kolom

Berdasarkan laju alir fasa geraknya:

Proses Elusi

Isokratik
Laju alir tetap pada
proses elusi

Gradien
Laju alir berubah pada
proses elusi
5
 Apa parameter interaksi
komponen – fasa diam ?

FAKTOR KAPASITAS (k`)

k` besar

Interaksi besar

Tertahan dalam
kolom lebih lama

6
Faktor kapasitas, k`

t t
r r (0)
k `
t
r (0)
tr(o)= waktu retensi senyawa yang tidak
tertahan dalam kolom
= waktu retensi fasa gerak

EFISIENSI KOLOM

7
KOLOM YANG EFISIEN:
Puncak sempit, tajam dan simetris

Ukuran efisiensi kolom :

N (jumlah pelat teori)

Asumsi:
Kesetimbangan distribusi analit
diantara fasa diam dan fasa gerak
terjadi dalam setiap pelat teori.

Semakin banyak pelat teori (N

semakin besar), semakin baik
kemampuan kolom untuk memisahkan
analit.

8
 tr 2 tr 2
N 16( )  5,54( )
W w1 / 2
Ukuran efisiensi kolom yg lain: HETP

HETP = L/N

High Equivalent to Teoritical Plate

= tinggi pelat teori

Kolom yang efisien:

N besar, HETP kecil

9
 Mengapa kolom dapat memisahkan
campuran komponen ?

Karena perbedaan interaksi komponen

Komponen dengan kolom/fasa diam

Komponen2 keluar dari kolom

Dalam waktu yang berbeda-beda

Waktu retensi (tr)

Berbeda-beda pula

10
 Prinsip Pemisahan

Perbedaan distribusi komponen

diantara fasa gerak dan fasa diam
yang menyebabkan perbedaan migrasi
diferensial komponen-komponen
analit dalam kolom kromatografi

Kemampuan kolom untuk membedakan

suatu komponen dari komponen lain

 Selektivitas kolom ?

dasar
Perbedaan k`

Faktor selektivitas,

11
 1. Faktor Selektivitas ( )

K2 K adalah Koef partisi

  komponen 1 dan 2
K1

t ' t t
r2 r ( 2) r (0)
 
t ' t t
r1 r (1) r (0)

Untuk Pemisahan:
 >>1

12
  Apakah parameter  menjamin
pemisahan sempurna ??

I 3,2 4,5
T0= 0,99

Tr, menit

 :………………………………
 menjamin pemisahan bagian atas
(puncak) kromatogram
 Tidak memperhitungkan overlap
puncak-puncak

Parameter lain : R (resolusi)

13
 2
1

2. Resolusi (Rs)

t r ( 2 )  t r (1)
Rs 
1
( w1  w2 )
2
2(t r ( 2 )  t r (1)

( w1  w2 )

W = lebar puncak
14
W1/2

2(t r ( 2)  t r (1) )
Rs 
1,699( w1/ 2 (1)  w1/ 2 ( 2 ) )

Rs ideal = 1,25

15
Cara lain menghitung Rs :
memperhitungkan
 selektivitas
 efisiensi
 faktor kapasitas

1 k`  1
R ( )( ) N
4 1 k` 

Faktor Faktor Faktor

kapasitas selektivitas efisiensi

16
17
 KCKT
 Teknik untuk pemisahan dan analisis zat
yang sukar dipisahkan dan termolabil
 Teknik untuk kontrol ketakmurnian

Eluat
dikumpulkan

detektor

Tempat kolom
pompa injektor
eluen

rekorder

Diagram blok alat KCKT

18
GAMBAR HPLC
19
1. Tempat eluen/pelarut

Botol terbuat dari bahan yang tidak

bereaksi dgn pelarut (gelas)
Dilengkapi dgn penyaring (stainless
steel)
Pipa kecil polietilen
eluen harus di degassing
Eluen harus disaring dengan saringan
membran
20
2. Pompa eluen

Gambar Pompa

Gunanya memompa eluen ke dalam kolom

Terbuat dari stainless steel/teflon
Seals terbuat dari mas atau teflon/grafit
Tekanan sampai 400 bar
Memberikan laju alir sampai 5 mL/menit
Tidak memberikan pulsa
21
Keberulangan pemompaan < 1%
Spesifikasi pompa yang baik:
Repeatability (keberulangan)
Presisi jangka pendek (short term precision)
Noise pompa (menyebabkan pulsa) karena
gerakan piston dan check valve
Drift (perubahan kecepatan alir pompa
karena waktu alir lama)

3. Injektor

Valve Syringe injection

22
Injektor
 Syarat injektor:
dapat memasukkan contoh ke dalam kolom
dalam bentuk sesempit mungkin untuk
menghindari pelebaran puncak
Mudah digunakan
Keberulangan tinggi
Dapat bekerja meskipun ada tekanan balik
tinggi

4. Kolom

23
Gambar kolom
Kolom yang baik
bahan kolom kuat dan tidak mudah
berkarat
partikel Isi kolom berdiameter kecil (5–
10m), ukuran seragam, bulat, berpori
Efisiensi kolom tinggi (N >>, H<<)
Tahan terhadap tekanan tinggi
Menghasilkan puncak simetri dan sempit

24
Karakteristik packing kolom untuk kromatografi
25
Jenis kolom
1. Kolom polar : silika, amina
2. Kolom non polar : C-8, C-18

silika C-18 yang terikat

silika

Si
O O
Si
Si
O R
Si
Si O
O R
O H
Si
Si O

Struktur fasa diam C-18

Struktur fasa diam
terikat pada silika
silika 26
 5. Detektor

Syarat detektor
• Tingkat noise dan drift rendah
• Sensitivitas tinggi
• respons cepat
•Tidak sensitiv terhadap perubahan tipe pelarut, laju alir
pelarut dan temperatur
• mudah pengoperasiannya
• awet

Detektor dalam KCKT

• detektor spektrofotometrik (UV/VIS)

• detektor fluoresensi
•Detektor indeksrefraksi (Optis)
•Detektor elektrokimia

27
Berdasarkan jenis kolom dan eluen :
1. Kromatografi fasa terbalik : Fasa diam lebih
nonpolar dari fasa gerak
2. Kromatografi fasa normal : Fasa diam lebih
polar dari fasa gerak

Pemeliharaan kolom

1. Saring eluen dgn saringan membran

2. Hindari pengaliran eluen ke dalam kolom dari arah yang
sebaliknya
3. Gunakan kolom pengaman (column guard)
4. Simpan kolom dalam pelarut yang sesuai jika tidak
digunakan (kolom polar dalam metanol, kolom nonpolar
dalam kloroform)
5. Jangan sampai kolom jatuh
6. Jangan menggunakan eluen yang terlalu asam
7. Cuci kolom sesudah digunakan.
8. Lakukan regenerasi kolom sesuai prosedur

28
 Trouble shoot

Alat
Hasil pengukuran
Trouble Penanggulangan
Shoot
1. Pompa Saring kembali fasa gerak
berhenti/tekanan Periksa saringan fasa gerak
tinggi Periksa ujung-ujung kolom
periksa klep pompa (harus dgn
ahlinya.)
Bersihkan kolom dengan laju alir
minimal
ganti kolom

2. Keberulangan Cuci kolom

injeksi rendah Uji keberulangan pompa
Periksa detektor

3. Puncak tidak Perlambat laju alir

terpisah Ubah komposisi fasa gerak
Ganti fasa gerak
Ganti kolom

4. Puncak terlalu - Percepat laju alir 29

lebar dan tr >>
TIPE-TIPE KROMATOGRAM

A B

C
D

30
TIPE-TIPE KROMATOGRAM

31
 Soal resolusi:
1. Dari kromaogram KCKT suatu campuran yang diketahui
terdiri dari senyawa A dan B, diperoleh data sbb:
tr (A) = 13 menit, tr (B) = 21,5 menit, to = 2,0 menit
W(A)= 2,1 menit, W(B) = 4,1 menit.
Hitung Resolusi dan faktor pemisahannya

Soal efisiensi kolom:

Komponen x terelusi dalam KCKT dengan data sbb:
tr (x) = 21,5 menit , W = 4,1 menit, W1/2= 1,85 menit, to=
0,95 menit.
Hitung N , HETP, dan Faktor kapasitas, bila elusi
dilakukan dalam kolom 12,5 cm

32
 Analisis kualitatif

-Agak sukar dilakukan terutama bila

dalam campuran
-Dapat dilakukan bila pemisahan baik
dan tidak ada interferensi
-Dasar: membandingkan waktu retensi
analit dengan standar
-Kondisi elusi analit harus sesuai
dengan kondisi standar
- Kesulitan: sukar menemukan standar

33
 Analisis Kuantitatif

Tahapan kerja:
*Penyiapan fasa gerak :
Pelarutan, pencampuran,
penyaringan, degasing
*Preparasi sampel :
Pemisahan dgn ekstraksi
Pengenceran/pelarutan ekstrak
penyaringan/degasing
*Penyiapan larutan standar :
Induk : larutan 1000 ppm
pengenceran dengan fasa gerak.
pembuatan larutan kerja:
larutan seri dengan range
konsentrasi tertentu. 34
 *Pengukuran sampel
*Penentuan konsentrasi sebenarnya
analit dalam sampel

Pengukuran sampel:
-Teknik membandingkan area standar
dengan area analit

Area standar = As , konsentrasi = Cs

Area analit = Ac , konsentrasi analit = Cc

As/Ac = Cs/Cc

35
- Teknik kurva kalibrasi

Dibuat beberapa seri larutan standar, dari

konsentrasi kecil sampai besar ( minimal 4 larutan
standar)
Dibuat larutan sampel sedemikian sehingga area berada
dalam range konsentrasi standar
Larutan standar diinjeksikan mulai dari konsentrasi kecil
Larutan sampel diinjeksikan
Plot Area sampel dalam kurva kalibrasi
(C vs area standar)

*
Area
*

Cx
C, ppm
36
 Teknik analisis kuantitatif
dengan kalibrasi adisi standar

• Untuk mendekatkan kondisi sampel

dengan kondisi larutan standar
• Caranya: ke dalam sejumlah larutan
standar (seri) ditambahkan sejumlah
yang sama sampel, kemudian
diperlakukan sesuai prosedur seperti
pada cara kalibrasi biasa

Area *

Cx
C, ppm
37