Pemantapan Mutu

Pemeriksaan Hematologi
Rutin

Irnawastu awusi
PEMANTAPAN MUTU
DALAM PENETAPAN
KADAR HEMOGLOBIN DAN
PEMBUATAN KURVA STANDAR
Terdapat beberapa metode pemeriksaan
untuk mengukur kadar hemoglobin (Hb),
diantaranya dengan cara mengukur intensitas
warnanya, mengukur kemampuan mengikat
oksigen dan mengukur kadar besi yang
dikandungnya.
Penetapan kadar Hb dengan cara mengukur
intensitas warna yang umum dilakukan di
laboratorium adalah :
1. Metode Sianmethemoglobin
2. Metode Oksihemoglobin
3. Metode lain
1. Metode Sianmethemoglobin

Pengukuran kadar hemoglobin berdasarkan

metode sianmethemoglobin merupakan cara
yang dianjurkan oleh International for
Standardization in Haematology (ICSH). Cara
ini mudah dilakukan dan mempunyai bahan
standar yang stabil. Semua bentuk Hb yang
umum dijumpai dalam darah manusia kecuali
sulfhemoglobin dapat diperiksa dengan cara
ini.
Prinsip Pemeriksaan :
Hemoglobin akan diubah oleh Kalium
Ferisianida (K3Fe(CN)6) menjadi
methemoglobin, yang kemudian diubah
menjadi hemiglobin sianida (HiCN) oleh
Kalium Sianida (KCN).

Alat :
-Spektrofotometer atau fotometer dengan
filter 540 nm
-Tabung reaksi
-Pipet 20 ml (Pipet Hb Sahli)
-Pipet volumetrik 5 ml
Reagen :
- Larutan Drabkin
K3Fe(CN)6 200 mg
KCN 50 mg
KH2PO4 140 mg
Non ionic detergent 1 ml
Aquades ad 1000 ml
pH 7.0 – 7.4
- Larutan Sianmethemoglobin standar
Bahan pemeriksaan :
-Darah vena yang sudah diberi antikoagulan
EDTA
-Darah kapiler
Cara Kerja
1. Ke dalam tabung reaksi / botol kecil,
dimasukkan tepat 5 ml larutan Drabkin
2. Hisaplah darah vena (EDTA) atau darah
kapiler sebanyak 20 ml dengan pipet Sahli
atau pipet otomatik
3. Hapuslah kelebihan darah yang menempel
pada bagian luar pipet dengan kertas
pembersih
4. Masukkan darah dalam pipet ke tabung
reaksi yang berisi larutan Drabkin
5. Pipet dibilas sebanyak 3 kali dengan larutan
Drabkin tersebut (jangan melewati batas
volume)
6. Campur larutan baik-baik dengan cara
menggoyangkan tabung secara perlahan-
lahan hingga larutan homogen dan biarkan
selama 3 menit
7. Baca dengan fotometer pada l 540 nm,
sebagai blanko digunakan larutan Drabkin
Pembuatan kurva standar Hb
1. Hitung lebih dahulu kadar hemoglobin dalam
larutan standar yang akan digunakan.
Karena pada pengukuran kadar Hb
digunakan 20 ml darah dan ditambah larutan
Drabkin 5 ml, berarti darah diencerkan 251
kali, maka kadar Hb standar yang tercantum
pada ampul harus dikalikan dengan 251.
2. Larutan standar HiCN yang dipilih dengan
kadar 55 – 85 mg/dl. Misal dipilih larutan
standar HiCN 57,2 mg/dl berarti larutan ini
sesuai dengan kadar Hb 251 x 57,2 mg/dl =
14,4 g/dl
3. Buat paling sedikit 3 macam larutan yang
mempunyai kadar Hb berbeda dengan cara
mengencerkan larutan standar dengan
larutan Drabkin, misalnya 25%, 50%, 75%
dan 100%. Usahakan diperoleh larutan yang
mempunyai kadar Hb tinggi, sedang dan
rendah yang biasa ditemukan di klinik.
4. Serapan larutan-larutan tersebut diukur pada
l 540 nm, sebagai blanko digunakan larutan
Drabkin.
5. Pada kertas grafik, gambarkan titik-titik yang
diperoleh dengan kadar Hb pada absis dan
nilai serapan larutan pada ordinat. Setelah
titik-titik tersebut dihubungi akan diperoleh
satu garis lurus.
6. Hitung faktor kurva ini dengan cara
membagi seluruh kadar Hb larutan standar
dengan seluruh nilai serapan dari larutan
yang diperoleh.
 Tabung Pengen Kadar Larutan Larutan Serapan
ceran Standar Drabkin HiCN
No. % g/dl ml ml (A)
1 0 0 - 2.0 0
2 25 3.6 0.5 1.5 0.098
3 50 7.2 1.0 1.0 0.196
4 75 10.8 1.5 0.5 0.294
5 100 14.4 2.0 - 0.392

Jumlah 36 0.980

Faktor (F) = 36 / 0.980 = 36.8

Kurva standar Hb cara sianmethemoglobin
s 0.400
e
r 0.300
a
p 0.200
a
n 0.100

0
0 5 10 15
Kadar hemoglobin (g/dl)
Perhitungan
Kadar Hb dapat dibaca pada kurva standar atau
dihitung dengan menggunakan faktor (F).
Kadar Hemoglobin = A x F
A = serapan
F = Faktor
Nilai Normal
Laki-laki dewasa : 13.0 – 18.0 g/dl
Wanita dewasa : 11.5 – 16.5 g/dl
Wanita hamil : 11.0 – 16.5 g/dl
Balita : 12.0 – 14.0 g/dl
Bayi : 13.5 – 19.5 g/dl
Sumber Kesalahan
I. Tahap Pra-analitik
1. Pemberian identitas spesimen salah atau
tertukar
2. Kesalahan pada tahap pengambilan darah :
- Pengambilan darah kapiler, ujung jari
terlalu ditekan-tekan, sehingga cairan
jaringan ikut keluar dan akibatnya kadar Hb
menjadi lebih rendah.
- Pengambilan darah vena, bendungan
terlalu lama sehingga darah menjadi lebih
kental.
- Antikoagulan yang digunakan kurang
sehingga darah membeku.
3. Spesimen tidak homogen
Pada penundaan pemeriksaan sering lupa
untuk mencampur dengan menggoyangkan
darah terlebih dahulu pada saat akan
diambil sampel darah tersebut.
4. Persiapan pasien kurang :
- Darah lipemik sehingga kadar Hb lebih
tinggi dari seharusnya.
- Adanya lekositosis berat (> 50.000/ml)
sehingga kadar Hb meninggi.
II. Tahap Analitik
1. Alat ukur (pipet Sahli dan pipet volumetrik)
yang digunakan tidak akurat.
2. Reagen yang digunakan kurang baik
kualitasnya. Larutan Drabkin yang baik
harus jernih dan serapannya 0 terhadap
akuades pada l 540 nm. Larutan Drabkin
tidak baik bila dibiarkan lama terkena
cahaya.
3. Fotometer / Spektrofotometer :
- l tidak pada puncak serapan. Pada
fotometer digunakan filter 540 nm,
sedangkan pada spektrofotometer harus
dibuat kurva serapan dan kalibrasi panjang
gelombang.
 - Perubahan tegangan listrik sehingga
pembacaan serapan terganggu.
- Kuvet kotor, isi kurang, ada gelembung
udara dan posisi penempatan tidak benar
pada fotometer akan mempengaruhi hasil
pembacaan.
4. Kesalahan pada pencampuran :
- Teknik pemipetan tidak benar
- Tidak menghapus darah yang menempel
pada bagian luar pipet Sahli.
- Tidak membilas bagian dalam pipet Sahli
- Pencampuran sampel dan reagen tidak
benar. Sampel darah harus dimasukkan
setelah reagen.
5. Penyimpanan larutan standar Hb tidak baik
( tidak dalam lemari es) sehingga kadarnya
lebih rendah.
6. Kesalahan perhitungan
Perhitungan menggunakan faktor yang
diperoleh dari beberapa pemeriksaan
larutan standar Hb lebih baik daripada
hanya berasal dari 1 pemeriksaan larutan
standar saja.
III. Tahap Pasca-analitik
1. Kesalahan pencatatan.
2. Kesalahan alamat pasien dan dokter yang
meminta pemeriksaan.
PEMERIKSAAN
LAJU ENDAP DARAH (LED)
Mengukur kecepatan pengendapan sel darah
merah di dalam plasma.
Satuan LED adalah mm/jam.
Cara yang dianjurkan ICSH adalah cara
Westergren.
Bahan pemeriksaan
Darah vena dicampur dengan lar. Na Sitrat
0.109 M dengan perbandingan 4 : 1 atau
darah EDTA yang diencerkan dengan lar. Na
Sitrat atau NaCL 0.9% dengan perbandingan
4:1
Alat
Tabung Westergren
Rak untuk tabung Westergren
Cara Pemeriksaan
- Isi tabung Westergren dengan darah yang
telah diencerkan sampai garis tanda 0.
- Letakkan tabung pada rak dan perhatikan
supaya posisinya betul-betul vertikal lurus
pada suhu 18 - 250C. Jauhkan dari cahaya
matahari dan getaran.
- Setelah tepat 1 jam, baca hasilnya dalam
mm/jam.

Nilai Normal LED

Laki-laki jam I : 0 – 15 mm
Wanita jam I : 0 – 20 mm
Sumber kesalahan
- Pemeriksaan LED harus dilakukan dalam
waktu 2 jam pertama, apabila darah EDTA
disimpan pada suhu 40C pemeriksaan dapat
ditunda selama 6 jam. Makin lama tertunda
pemeriksaan makin tinggi LED.
- Pencampuran dan pengenceran darah sering
tidak dikerjakan dengan homogen.
- Pencucian tabung Westergren tidak boleh
memakai bikromat atau deterjen. Gunakan air
mengalir dan dibiarkan kering 1 malam dalam
posisi vertikal atau bilas dengan alkohol dan
aseton (harus yakin alkohol dan aseton sudah
benar-benar kering).
- Posisi tabung harus benar-benar vertikal tegak
lurus dan tidak boleh ada getaran. Tabung
miring dan adanya getaran akan menyebabkan
LED lebih tinggi.
- Suhu ruangan tinggi akan menaikkan LED
SUMBER KESALAHAN
HITUNG SEL
Sampel
1. Pemijatan / penekanan daerah tusukan yang
berlebihan
2. Perbandingan antikoagulan yang tidak tepat
dan pemilihan antikoagulan yang salah
3. Tidak dikocok dengan benar / tidak homogen
Penggumpalan sel / bekuan darah
4. Hemolisis karena alat basah / kotor
Alat
1. Kamar hitung yang dipakai garisnya tidak
jelas
2. Alat tidak kering / tidak bersih, basah
3. Volume pipet tidak tepat
4. Kaca penutup kamar hitung bukan yang
dianjurkan.
Reagen
1. Tidak disaring sebelum dipakai
2. Sudah kadaluarsa

Kesalahan Teknis
1. Penambahan bahan darah di luar pipet
2. Miniskus pembacaan tidak tepat
3. Pengenceran yang tidak tepat
4. Pencampuran yang kurang homogen
5. Cara mengisi kamar hitung tidak benar
(berlebihan atau mengering)
6. Letak kaca penutup tidak tepat
7. Meja mikroskop tidak horizontal
8. Menghitung sel yang tidak benar
Hal-hal khusus

Hitung lekosit
1. Bila jumlah lekosit sedikit (< 3000/ml)
pengenceran diperkecil
2. Bila jumlah lekosit sangat banyak (leukemia)
pengenceran diperbesar
3. Jika darah tepi mengandung eritrosit berinti
maka hitung lekosit harus dikoreksi (bila eri-
trosit berinti > 10 %)
Hitung lekosit = L – E x L
100+E
E = jumlah eritrosit berinti per 100 sel berinti
pada hitung lekosit
Hitung Trombosit
1. Tabung plastik yang digunakan untuk pen-
campuran amonium oxalat dengan sampel
2. Oleh karena merupakan sel kecil maka me-
merlukan waktu ± 5 menit untuk mengendap
3. Larutan Rees-Ecker tidak melisiskan eritrosit
sedangkan larutan amonium oxalat melisiskan
eritrosit
4. Pada keadaan trombositopenia, pembanding
diperkecil misal 1.9 ml amonium oxalat dengan
0.1 ml darah EDTA
5. Karena trombosit menyerupai partikel yang
kecil maka larutan pengencer harus benar-
benar bebas partikel
 Lekosit Trombosit Eritrosit

Reagen Lar. Turk Am.Oxalat% Formalin

(Vol) (0.38 ml) (2 ml) Citrat
(4 ml)
Sampel 20 ml Darah 20 ml Darah 20 ml Darah
EDTA EDTA EDTA
Kamar Hitung 4 bidang 1 bidang 5 bidang kecil
besar besar (0.02 ml)
(0.4 ml) (0.1 ml)
Pembesaran 10X 40X 40X
Objektif
Faktor 400/20x1/0.4 2000/20x 4000/20 x
Perhitungan = 50 1/0.1 1/0.02=10000
= 1000
Hitung Eritrosit
1.Karena jumlah sangat besar (juta) maka
kesalahan penghitungan relatif besar
2.Untuk memperkecil kesalahan, maka jumlah
eritrosit yang dihitung harus banyak (minimal
400)
3. Variance perhitungan 2% sehingga bila
diperoleh hitung eritrosit 5.106 / ml berarti
4,8 – 5,2. 106 / ml
4. Sebaiknya tidak digunakan untuk
menghitung MCV, MCH dan MCHC
5. Karena trombosit menyerupai partikel yang
kecil maka larutan pengencer harus benar-
benar bebas partikel
PENETAPAN NILAI
HEMATOKRIT
Untuk mengetahui volume eritrosit dalam 100 ml
darah  ada tidaknya anemia.
Dinyatakan dalam %.

Bahan pemeriksaan :
Darah EDTA kadar 1 mg Na2EDTA / K2EDTA / ml
darah atau darah heparin kadar 15 – 20 IU/ml
darah.
Pemeriksaan tidak boleh ditunda > 6 jam (suhu
40C)
Alat :
Pada cara makro : tabung Wintrobe, diameter
2.5 – 3 mm, panjang 110 mm, skala interval 1
mm sepanjang 100 mm, volume 1 ml.
Pada cara mikro : pipet kapiler yang panjangnya
75 mm dan diameter 1 mm. Pipet dilapisi
Na2EDTA /Heparin di bagian dalam  darah
kapiler. Pipet tanpa antikoagulan darah vena.

Cara Pemeriksaan :
Makro
Darah dicampur dengan seksama hingga
homogen. Dengan menggunakan pipet pasteur
darah dimasukkan ke dalam tabung Wintrobe
hingga mencapai garis tanda 100, dimulai dari
dasar tabung dan hindari terjadinya gelembung
udara di dalam tabung. Tabung yang berisi da-
rah dipusing selama 30 menit pada kecepatan
2000 – 2300 g.
Hasil Ht dibaca dengan memperhatikan :
- Tinggi kolom eritrosit yang dibaca sebagai nilai
Ht (%).
- Tebal lapisan putih di atas eritrosit yang tersu-
sun dari leukosit dan trombosit  Buffy coat.
- Warna kuning lapisan plasma  indeks ikterus.
Dibandingkan dengan warna larutan Kalium
Bikromat yang dinyatakan dalam satuan (S).
Satu satuan sesuai warna larutan 1 g Kalium
Bikromat dalam 10.000 ml air.

Bila Ht > 50%, pusing tabung 30 menit lagi.

Kesalahan yang mungkin terjadi
- Konsentrasi antikoagulan yang digunakan
tidak sesuai
- Bahan pemeriksaan tidak dikocok hingga
homogen
- Bahan pemeriksaan mengandung bekuan
- Pemeriksaan ditunda lebih dari 6 jam
- Pada waktu mengisi tabung terjadi gelembung
udara didalam tabung
- Pengisian tabung Wintrobe tidak mencapai
tanda 100
- Kecepatan dan lama pemusingan tidak sesuai
- Terjadi hemolisis sewaktu pemusingan
- Pembacaan yang salah
Mikro

- Isi pipet kapiler dengan darah yang langsung

mengalir (darah kapiler) atau darah dengan
antikoagulan
- Salah satu ujung pipet disumbat dengan
dempul atau dibakar
- Tabung kapiler dimasukkan ke dalam
centrifuge mikrohematokrit dengan bagian
yang disumbat mengarah ke luar
- Tabung kapiler dipusing selama 5 menit
dengan kecepatan 16.000 rpm
- Hematokrit dibaca dengan memakai alat baca
yang telah tersedia
Kesalahan yang mungkin terjadi

- Bila memakai darah kapiler, tetes pertama

harus dibuang
- Penggunaan EDTA lebih dari 1.5 mg/ml darah
berakibat eritrosit mengerut sehingga Ht <
- Pemeriksaan ditunda > 6 jam akan menye-
babkan Ht>
- Bahan pemeriksaan tidak dicampur homogen
- Bahan pemeriksaan mengandung bekuan
darah
- Pipet heparin pada daerah panas cepat rusak
sehingga harus disimpan dalam lemari es
- Kecepatan dan lama pemusingan tidak sesuai
- Pemakaian centrifuge mikro untuk waktu yang
lama sering menjadi panas sehingga darah
menjadi hemolisis
- Lisis eritrosit dapat terjadi bila salah satu ujung
pipet kaliper disumbat dengan cara dibakar
- Penguapan plasma dapat terjadi bila pemusi-
ngan terlalu lama atau pembacaan dibiarkan
terlalu lama